Histotecnologia

Anatomia Patológica
• Anatomia patológica – É uma especialidade médica que procede à análise morfológica de órgãos, tecidos e células,
tendo como objetivo, o diagnóstico (como meio de identificação de lesões da natureza de
tumores). Esta tem implicações no tratamento e prognóstico e apresenta-se como fundamento
de medidas de carácter preventivo (exames de rastreio). Temos como exemplo o citodiagnóstico
nos tumores do útero e pulmão).
A anat. patológica engloba 3 valências: → Histopatologia - Engloba biopsias, peças operatórias e exames pré-operatórios
→ Citopatologia - Citologia espoliativa (papanicolau)
- Técnica citológica: - Centrífuga; Citocentrífuga;
Eq. para citologia camada fina
→ Autópsias clínicas - Ajudar na monitorização terapêutica
- Exame macroscópico do lado externo e interno dos
órgãos ínsito e pós dissecção
• Exame anatopatológico – É uma análise laboratorial de base morfológica de órgãos ou parte deles, de
tecidos e de células. Que podem pertencer a indivíduos vivos ou a cadáveres.
• Peça anatómica – Órgão ou parte de um órgão.
• Amostra biológica – Material recebido no laboratório.
– É uma amostra obtida por um ato de colheita e sobre a qual vão ser efetuados 1 ou mais exames
laboratoriais no âmbito da anatomia patológica.
• Autopsia – Clínica - Tem como finalidade conhecer a causa de morte, não sendo nesta tão importante salientar como a
morte ocorreu. Interessa fazer uma revisão anatomopatológica retrospetiva, recorrendo para isso à
análise de todas as lesões encontradas e relacioná-las entre si. Tentando interligá-las num mecanismo
patogénico comum com finalidade de conhecer a história natural da doença que provocou a morte.
Este tipo de autópsias só se pode realizar com o consentimento dos familiares e fazem-se
nos serviços de anatomia patológica de hospitais.
– Médico legal - Investiga a origem e circunstância da morte quando existem implicações penais ou
civis, ou seja, esclarecer se a morte foi natural ou não e caso não tenha sido saber se
foi devido a acidente suicídio ou homicídio.
São realizadas nas locações do instituto nacional de medicina legal, nos gabinetes
médico legais ou em qualquer lugar delegado pelo Tribunal estas autópsias só são
realizadas mediante ordens jurídicas

Biópsia (não é um órgão inteiro) – Fragmento de órgão ou tecido obtido por meios cirúrgicos (peq. Cirurgia), meios de
instrumentação, endoscópica ou meio de agulha (citologia), para diagnostico histológico.
→ Biópsia Cirúrgica – Que exige ou é praticada no decurso de uma peq. intervenção cirúrgica
→ Biópsia por Punção (e aspiração) com seringa – Utiliza-se no diagnostico de quistos, nódulos solitários
→ Biópsia por Punção (e remoção) de um peq. fragmento – Utiliza-se no diagnostico de carcinoma da próstata, de lesões
difusas do fígado e rim
→ Biópsia por Endoscopia – Por ex. brônquicas e gástricas
→ Biópsia por Raspagem – Por ex. endométrico ou lesões superficiais da cavidade oral
 Exame Extemporâneo
• Material vem direto do bloco operatório, chegando ao lab. a fresco
• Questões de segurança: Luvas (grau de proteção superior) e máscara mais resistente (riscos biológicos e
físicos (corte; criostato - queimadura pois está a temperaturas entre -20 e -60))
• Neste exame deve-se ter em atenção: Liga; Ângulo de inclinação; Diferença de temp. (escolhida de acordo com a
natureza do tecido)
• É feita uma seleção macroscópica e posteriormente é levado para o que criostato
• Tecido vai enrijecer (pelo OCT), há congelação (temperatura importante)
• Corte qualidade também vai depender do tempo do tecido
• Antirrol - À medida que temos o corte este vai para baixo do antirrol ficando entre este e o suporte da faca.
Posteriormente tiramos do suporte para uma lâmina a temperatura do criostato
• Coloração da Hematoxilina & Eosina
→ Colocar diretamente na hematoxilina (3 min) - não reutilizável (há quem coloque antes no formol, álcool 95 ou água
→ Colocar em água
→ Depois em diferenciador fraco
→ Por fim colocar em água corrente (5 min) ou água quente (pôr e tirar) – Vai parar a ação do diferenciador
• Montagem

Organização laboratorial
• Organização dos trabalhadores: Médico; técnico auxiliar de ação médica e administrativos
- À cabeça - diretor médico
- Abaixo - quem controla o laboratório
• Sala de Receção e de Macroscopia: Devem ser salas afastadas de zonas limpas (salas de diagnóstico; parte administrativa)
Processador poderá estar nesta sala ou na sala de inclusão
• Sala de Inclusão: Ampla e com aparelhos de inclusão para as peças (diferenciados dos aparelhos de biópsias para evitar
contaminações).
Se for necessário a inclusão de peças e biópsias no mesmo aparelho deve começar-se
pelas biopsias, para evitar contaminações e por que não demoram tanto tempo.
• Sala de Coloração: Deverá servir para coloração de rotina e histoquímica
• Área da Imuno: Área mais sensível e muitas vezes na mesma sala fazem os exames de biologia molecular
• Salas de Lavagem: Amplas com máquinas para desinfeção, lavagem e esterilização;
Com área onde o material possa secar sem contaminação de poeiras
• Vestiário: Área deve ser distinta da casa de banho
• Sala de Pausa
• Organização para técnica Citológica e Histológica: Devem existir os seguintes equipamentos
→ Frigorífico/ Congelador
→ Material para medição precisa régua
→ Material diverso do laboratório
• Equipamento utilizado no exame de macroscópico:
1) Mesa de entrada com: boa iluminação; água quente e fria; boa extração de ares; sistema de gravação de voz e imagem
2) Sistema de fotografia
3) Aparelho marcador de cassetes
4) Dispensador de formol
5) Balança e Régua
6) Material cirúrgico como: pinças facas tesouras estiletos e bisturis
7) Material de proteção individual (teste- importância das luvas e máscara)
8) Material técnico: cassetes; recipientes com formol para colorar as cassetes; papel absorvente (importante); pinceis;
gases; ácido asséptico ajuda a secar a tinta da China.
 Macroscopia
Baseia-se na obtenção de informações relativas ao tamanho, forma, cor e natureza do órgão a analisar.
Nesta etapa é feita receção de material, confere-se a requisição e o conteúdo (em relação à quantidade/ qualidade
e tipo de material)
Para que estas etapas aconteçam é necessária uma mesa de observação, sistema de exaustão, água corrente,
recipientes, processador de tecidos com sistema aberto
É de principal importância para: - Parte crucial do exame anátomo-patológico;
- Seleção de fragmentos representativos;
- Averiguar necessidade de estudos especiais.
- Quando realizada inadequadamente pode invalidar a interpretação histológica.
As 3 principais etapas são: → Receção do material biológico
→ Acondicionamento
→ Colheita de amostras
Receção de material biológico: (peças cirúrgicas/ peças amputação) (fetos não são recebidos)
• Intestino, útero, apêndice e placenta- órgão oco previamente tratado
• Tudo o que acontece antes da assinatura do técnico não é responsabilidade do laboratório
• Auxiliar de ação médica - Quem leva o material para o laboratório com a respetiva requisição.
No entanto, também pode ser levada por um enfermeiro (quem coloca o material
para ser analisado NOS respetivos contentores com o formol) que esteja no bloco.
OU o cirurgião (só ele pode fazer a requisição) quando é este a levar é porque quer
falar com a anatomopatologista.
• Material deve chegar e trazer consigo a requisição, o contentor e o livro de protocolo.
→ Livro de protocolo deve conter: - Nome de quem transporta;
- Proveniencia;
- Serviço onde tem de chegar
- Identidade do doente
- Tipo de material
- Quantidade de recipientes
• Podemos não receber a amostra em caso: - Má identificação
- Requisição não assinada pelo médico
- Falta de informação clínica (ex: indica que foi colhido apêndice, mas não o pq)
- Material composto por 2 órgãos e só está rececionado um deles. Nestas
situações há uma receção condicionada (recebemos o identificado e
indica-se que o material está incompleto)
• Requisição
Deve sempre acompanhar o material recebido no laboratório e o seu preenchimento é um ato quase tão
importante quanto a colheita do material. Dados importantes que devem constar:
- Identificação do doente (sexo, idade, nome, atividade profissional)
- Local de proveniência (local de onde vem e qual o serviço de onde vem)
- Identificação do órgão e informação clínica (natureza da peça e quantidade)
- Tipo de intervenção clínica cirúrgica
- Se o material Vem fixado ou não (se sim em que meio e a que horas teve início a fixação)
- Se o material pode conter alguma alteração a ter em consideração no exame anatomopatológico
- Nome do técnico responsável para receber o material e o médico que vai analisar
É necessário ser referido se devem ser feitos cortes com técnicas especificas
Devem ser colocadas anotações a dzr se o produto vai para descalcificação e qual o descalcificador
Após a macroscopia são colocadas na requisição informações sobre o destino da peça:
- RD (reserva definitiva);
- RT (reserva temporária - fica 15 dias após a saída do relatório)
- Reserva a longo prazo - fica + de 15 dias, mas posteriormente é deitada fora
- Arquivo ou Fotografia
Nota: após a receção do material deve-se logo atribuir um número de registo este é sequencial cassetes têm
número de registo.
Regras de segurança: - Bata, Luvas (mais importante), máscara (no caso de material contagioso não fixado. Ex: pulmão)
- Caderno
Riscos biológicos - Tudo é potencialmente um risco biológico
Riscos químicos – Xilol/ Formol (substância química altamente irritável para as mucosas tóxico)

Acondicionamento do material biológico:

• Material vem dentro de contentores - vem líquido do fixador? → Não - Tem de ser colocado no laboratório
→ Sim!
→ É o adequado/ Vem em quantidade suficiente?
→ Não - Colocar o líquido
→ Sim - Está em bom estado ou saturado
→ Nesse caso muda-se
• Abertura do órgão - Em órgãos ocos (vesícula biliar, intestino delgado e grosso, estômago e útero)
• Registo da cassete - Retira-se o órgão do líquido fixador e posteriormente prepara-se a peça para a macroscopia.
- Lava se a peça com água corrente durante alguns minutos e coloca-se em álcool 70%
- Passa-se o órgão para a mesa de macroscopia (bancada + tábua)
- Colhe-se fragmentos do órgão e coloca-se em cassetes
- Identificação das mesmas com o nº de registo
• Mesa de macroscopia: Os objetos de corte devem ficar de um lado – tesoura, lâminas, bisturis
Os objetos não cortantes do lado oposto – (pinças, régua)
Para além disto a mesa de macro deve conter uma placa dissecção e um gobelé para colocar as cassetes
• Avaliação macroscopia (descrição):
→ Natureza da peça
→ Estruturas e Dimensões – forma, comprimento, largura, espessura, tamanho, profundidade
→ Aspeto exterior – liso, brilhante, opaco, translucido
→ Tonalidade – castanho, bege, vermelho
→ Consistência – mole, elástico, dura
→ Espessura da Parede
→ Diâmetro órgãos cilíndricos
→ Identificação de zonas normais e aparentemente patológicas
→ Se tiver tumor – identificação distância da margem (tinta da China nas margens)
São escolhidas as áreas que queremos analisar e são colocadas em cassetes. Estas estão identificadas com nº de registo
atribuído à peça no livro de registos e no recipiente.
Macroscopia só está concluída quando o material é colocado em cassetes.

Processamento de Tecidos
• É feito no processador de tecidos num sistema fechado.
• Caracterizado pelo procedimento em que as amostras são colocadas em cassetes, posteriormente vão
para o cesto e é este que vai ao encontro dos vários reagentes:
1) Fixador - Formol tamponado 10%
2) Álcool 70% – Finalidade - Parar a ação da fixação; Começar a etapa da desidratação (retirar a água pq
a parafina e água não se dão)/ (outros podem colocar água antes do álcool)
3) Álcool 95% - Continuar a desidratação
4) Álcool 100% - Desidratar por completo as cassetes
5) Agente intermediário/ Diafanizador - Xilol - Retirar a parafina consegue misturar-se com o álcool e a parafina
6) Parafina
• Protocolo de elaboração:
1) Álcool 70% – podemos deixar bastante tempo
2) Álcool 95% – Temos 2 de seguida
3) Álcool 100% – Temos 3 de seguida
4) Xilol – Temos 3 de seguida
5) Parafina –Temos 2 de seguida
• Reagente deve permanecer sempre mais tempo no último recipiente e menos tempo no primeiro quando
temos mais que um recipiente seguido.
 Fixação
• É uma das primeiras etapas e a mais importante
• A histopatologia tem como fim dar um diagnóstico a partir do estudo da morfologia, estrutura do tecido
ou órgão extirpado.
Para que tal aconteça é necessário imobilizar os tecidos num estado o mais próximo possível do estado
vivo, sem a perda de moléculas. Esta é a razão para que se proceda à sua fixação.
• A fixação deve ir além da simples preservação dos tecidos, deve lhe conferir uma resistência que
permita resistir a todas as manipulações que se seguem, em todo o processamento histológico.
• Aspetos importantes para a fixação:
→ A fixação cria um ambiente em que a célula fica estática sem alterações.
→ Deve prevenir a autólise - Processo interno da célula (própria morte da célula destruição das
enzimas e começa logo quando o organismo morre).
→ Deve prevenir a tumefação (órgão mais sujeito intestino/estômago)
→ Deve prevenira proliferação de microorganismos que vão degradar o tecido
• É uma etapa crítica na preparação dos tecidos porque com tecido mal preservado não se pode construir.
• Ação da fixação:
→ Inibição da autólise tecidular e inibição da estou muito facção dos tecido
→ Imobilização de células e tecidos estáticos
→ Solidificação do material feloidal
→ Endurecimento dos tecidos
→ Modificação dos índices de refração das diferentes estruturas de tecidulares
→ Modificação do volume dos tecidos ligeiramente superior após a fixação
→ Insolubilidade dos constituintes tecidulares
• Fatores que influenciam a fixação
→ Volume de penetração do fixador
→ Rapidez da reação do fixador volume do líquido fixador (30 a 40 vezes superior ao volume da peça)
→ Líquido fixador na quantidade certa conforme a peça
→ Tipo de recipiente
→ As espessura das peças
→ Consistência dos tecidos
→ Duração da fixação
→ Concentração do líquido fixador
→ Ph e temperatura (temperatura aumenta provoca desnaturação das células)
→ Lavagem pós fixação
→ Pressão osmótica
• Agente fixador – Qualidade de um bom fixador:
1) Boa penetração rápida e homogénea
2) Não provocar retração dos tecidos
3) Evidenciar as estruturas intracelulares
4) Evitar o desaparecimento de formações solúveis exemplo glicogénio
5) Permitir encontrar os elementos visíveis
6) Conferir aos constituintes celulares solidez e insolubilidade suficientes para lhes permitirem suportar sem danos
a manipulação e a ação dos reagentes químicos
7) Não deve criar artefactos i assegurar aos tecidos e às células uma conservação imagem fiel
• Regras gerais da fixação:
1) A fixação deve ser o mais cedo possível de preferência ser colocada assim que se tira do organismo
2) A fixação deve ser rápida os fragmentos devem ter em média 5 a 6 mm de espessura
3) Duração da fixação depende do volume da peça e da natureza do fixador escolhido
4) Lavar as peças assegurar a detenção do fixador este passo é interdito há alguns tecidos
• Artefactos relacionados com a fixação:
→ Pigmentos (formólico) - Tempo a mais no formol puro (37%), por exemplo tecidos do pulmão ou pele (se tiver muita
melanina e tiver tempo a mais no formol a mostra vai apresentar muitos fragmentos)
→ Pseudocalcificações
→ Alterações do tecido por ação de ácido pícrico

• Tipos de fixação:
→ Fixação por métodos físicos - Calor (não é tão utilizado), frio (mais utilizado), dissecação (utilizado na veterinária)
→ Fixação por métodos químicos - Fixação por imersão (pegar na amostra e mergulhar)
→ Fixação por vapores - Colocação do formol numa concentração que vai provocar a libertação de vapor
→ Fixação por perfusão - Injeção nas veias (para conservação de cadáveres ou orgãos)
• Tipos de fixadores:
→ Agentes oxidantes:
– Ácidos minerais- Ac. Crómico e ósmico (mto utilizado como fixador para microscopia eletronica)
– Sais metálicos- Bicromato de potássio, biclorato de mercurio, cloreto de platina
– Ácido Orgânicos- Ac. acético (fzr eosina alcoólica/ tbm pode ser utilizado como fixador ou na
etapa de descalcificação), ácido pícrico
→ Agentes Redutores:
– Álcool metílico e etílico, formaldeído (formol)
– Cada fixador tem características próprias, por isso na prática, quase sempre se usam misturas:
umas vezes com ÁC. Pícrico, outras com base no Cromo, outras no Formol, outras ainda com base no Álcool.
• Dados q devam estar presentes nos fixadores:
1) Sinónimos
2) Fórmula química
3) Concentração da sua utilização- se devem ser utilizados na forma pura ou a uma determinada concentração
4) Propriedades físicas
5) Incompatibilidades com outros agentes
6) Modo de atuação sobre as proteínas, glúcidos, lípidos, ácidos nucleicos
7) Velocidade de penetração, sua tolerância
8) Tratamentos pós- fixação
9) Indicações e Contraindicações
10) Modo de utilização
11) Efeitos sobre a saúde dos utilizadores
 Descalcificação
Ocorre entre a macrotomia e o processamento de tecidos.
Não se pode realizar esta etapa sem a realização da fixação, para não haver a degradação dos tecidos.
• Descalcificação:
1) Dissolução dos sais calcários (meio ácido)
2) Desprendimento dos sais calcários (sal sódico, agente quelante, resinas, ionização eletr.)
3) Solubilização do cálcio por um agente ácido (Ac. Nítrico, Ac. Fórmico, Ac. Tricioroacético)
4) Eliminação de cálcio por um agente quelante (EDTA)
5) Resinas transportadoras de iões
6) Eletrolise (exige a utilização de um tampão especifico)
• Agentes descalcificadores:
→ Ac. Fórmico, nítrico, tricloroacético
→ Resinas
→ Agentes quelantes
→ Descalcificador rápido de osso (RDO) - Utilizado quando o bloco de parafina já esta feito, depois de embolido.
É Colocada uma gota em cima da zona com a calcificação, deve ser
utilizado num prazo máximo de 20min para se dar a descalcificação
Cuidados a ter: Na sua utilização, usar sempre luvas, colocar apenas no sítio necessário para não
degradar os restantes tecidos, após a sua utilização deve ser colocado por água
• Descalcificador:
→ Agitador das soluções - É conseguida pela movimentação do cesto nas sol. descalcificantes (agitar o
cesto de tempo a tempo e evitar q fique em repouso)
→ Tempo requerido- Depende do material a descalcificar. Habitualmente cerca de 1h
→ Soluções geralmente utilizadas- Ac. Nítrico (o melhor, garante uma descalcificação mais controlada)
- Hidrocloridrico a 5% (ossos grandes)- começamos a % maiores e acabamos a 5%
Qualquer fragmento q vá para descalcificação, mais peq. ou maior deve estar em suspensão e não em
contacto com o fundo, pois essa parte não ficara bem descalcificada.
É utilizada uma vareta de vidro e presa a esta temos um pedaço de gaze e é dentro deste q são
colocados os fragmentos a descalcificar.
Com uma agulha espetamos no fragmento e conseguimos aferir o estado de descalcificação (conforme o
quão fundo a mesma consegue ir).
Um osso q vai descalcificar deve ter sempre um pouto médio e não descalcificado por completo.
Outra forma pode ser pela radiografia, feita uma antes da descalcificação e outra a meio. Pós isso fazemos
uma métrica de tempo.
Melhor forma de parar uma descalcificação é a lavagem por abundante por água.
• Processamento de tecidos: (em alguns sítios pode incluir a fixação)
→ Desidratação
→ Diafanização/ Clarificação
→ Impregnação
 Desidratação
• Desidratação: (ocorre devido à parafina)
– Etapa q sucede a fixação (sempre que não há descalcificação).
– É a 1º. etapa do processamento, se considerarmos a fixação como um processo de conservação.
– Tem como finalidade retirar a água existente nos tecidos, através de banhos sucessivos de desidratantes.
– O desidratante ideal: Aquele que é solúvel em água e em parafina
– Desta forma não seria necessário utilizar um líquido intermediário, passaria o fragmento da desidratação
diretamente para o meio de inclusão.
– Esta desidratação existe, mas a existência de contraindicações leva à utilização de substancias
desidratantes miscíveis em água e depois recorre-se à substituição de um liquido intermediário.
– Presença de etanol: O método utilizado pelo etanol será o aumento gradual das concentrações do
álcool, iniciado com o álcool a 70%, ou seja, uma menor concentração e
prosseguir com aumentos de 10% até atingir o álcool absoluto.

Um aumento gradual das concentrações dos álcoois não evita a retração, mas modera.
– O etanol deve ser mudado periodicamente pq a água retirada dos fragmentos vai diminuindo as concentrações
dos álcoois.
– Quanto maior for a quantidade de fragmentos, maior terá de ser a quantidade de etanol utilizado.
– Um banho de grande quantidade levará a uma retirada menor de água consequentemente vários
banhos mais pequenos serão os mais efetivos para se dar uma boa desidratação.
• Fatores q influenciam a desidratação:
A rapidez da desidratação está dependente de vários fatores q são sensivelmente os mesmos q nas
outras etapas de processamento (diafanização ou clarificação e impregnação):
→ Concentração do desidratante - Para uma desidratação o mais completo possível, é necessário que:
- Os últimos banhos sejam com o agente no estado puro
- No etanol é necessário proceder com prudencia, pq se ocorrer uma
transferência da Sol. Aquosa para Sol. Etanol puro levará sempre a uma
retração e distorção estrutural-85%
→ Volume do agente desidratante
→ Agitação - A desidratação é mais rápida e eficiente se existir uma agitação constante.
→ Tempo de aplicação - Os fragmentos só devem permanecer nos banhos o tempo necessário até se equilibrar
as proporções entre a agua e o etanol.
No álcool a 100% se os fragmentos ficarem tempo a mais ficam quebradiços
Permanência - Longa: vai levar ao endurecimento dos tecidos. Retração, quando os
fragmentos secam demasiado, vai ser notado na microtomia.
- Curta: os fragmentos ficam com demasiada água. Os efeitos vão se fzr
sentir a curto ou longo prazo (possível o corte, com um fragmento
de consistência reduzida).
→ Temperatura- O aumento de temperatura acelera a desidratação (tornam-se endorecidos), no
entanto aumenta a retraçao e pode levar a uma inflamação do reagente
→ Vácuo- Não é o vácuo em si que facilita/ acelera a desidratação, mas a força da retirada do ar, facilitando a troca
dos reagentes entre si. O espaço ocupado pelo ar passará a estar ocupado pelo agente desidratante q é
o q vai acelerar a desidratação.
→ Tamanho e Consistência dos tecidos- Tecidos fibrosos e mais densos são mais difíceis de desidratar, visto que são
mais difíceis de penetrar.Fragmentos maiores têm maior quantidade de água

Um tecido mal desidratado não permite uma boa diafanização, um bom corte e uma boa cloração.