Histotecnologia

Anatomia Patológica
• Anatomia patológica – É uma especialidade médica que procede à análise morfológica de órgãos, tecidos e células,
tendo como objetivo, o diagnóstico (como meio de identificação de lesões da natureza de
tumores). Esta tem implicações no tratamento e prognóstico e apresenta-se como fundamento
de medidas de carácter preventivo (exames de rastreio). Temos como exemplo o citodiagnóstico
nos tumores do útero e pulmão).
A anat. patológica engloba 3 valências: → Histopatologia - Engloba biopsias, peças operatórias e exames pré-operatórios
→ Citopatologia - Citologia espoliativa (papanicolau)
- Técnica citológica: - Centrífuga; Citocentrífuga;
Eq. para citologia camada fina
→ Autópsias clínicas - Ajudar na monitorização terapêutica
- Exame macroscópico do lado externo e interno dos
órgãos ínsito e pós dissecção
• Exame anatopatológico – É uma análise laboratorial de base morfológica de órgãos ou parte deles, de
tecidos e de células. Que podem pertencer a indivíduos vivos ou a cadáveres.
• Peça anatómica – Órgão ou parte de um órgão.
• Amostra biológica – Material recebido no laboratório.
– É uma amostra obtida por um ato de colheita e sobre a qual vão ser efetuados 1 ou mais exames
laboratoriais no âmbito da anatomia patológica.
• Autopsia – Clínica - Tem como finalidade conhecer a causa de morte, não sendo nesta tão importante salientar como a
morte ocorreu. Interessa fazer uma revisão anatomopatológica retrospetiva, recorrendo para isso à
análise de todas as lesões encontradas e relacioná-las entre si. Tentando interligá-las num mecanismo
patogénico comum com finalidade de conhecer a história natural da doença que provocou a morte.
Este tipo de autópsias só se pode realizar com o consentimento dos familiares e fazem-se
nos serviços de anatomia patológica de hospitais.
– Médico legal - Investiga a origem e circunstância da morte quando existem implicações penais ou
civis, ou seja, esclarecer se a morte foi natural ou não e caso não tenha sido saber se
foi devido a acidente suicídio ou homicídio.
São realizadas nas locações do instituto nacional de medicina legal, nos gabinetes
médico legais ou em qualquer lugar delegado pelo Tribunal estas autópsias só são
realizadas mediante ordens jurídicas

Biópsia (não é um órgão inteiro) – Fragmento de órgão ou tecido obtido por meios cirúrgicos (peq. Cirurgia), meios de
instrumentação, endoscópica ou meio de agulha (citologia), para diagnostico histológico.
→ Biópsia Cirúrgica – Que exige ou é praticada no decurso de uma peq. intervenção cirúrgica
→ Biópsia por Punção (e aspiração) com seringa – Utiliza-se no diagnostico de quistos, nódulos solitários
→ Biópsia por Punção (e remoção) de um peq. fragmento – Utiliza-se no diagnostico de carcinoma da próstata, de lesões
difusas do fígado e rim
→ Biópsia por Endoscopia – Por ex. brônquicas e gástricas
→ Biópsia por Raspagem – Por ex. endométrico ou lesões superficiais da cavidade oral
 Exame Extemporâneo
• Material vem direto do bloco operatório, chegando ao lab. a fresco
• Questões de segurança: Luvas (grau de proteção superior) e máscara mais resistente (riscos biológicos e
físicos (corte; criostato - queimadura pois está a temperaturas entre -20 e -60))
• Neste exame deve-se ter em atenção: Liga; Ângulo de inclinação; Diferença de temp. (escolhida de acordo com a
natureza do tecido)
• É feita uma seleção macroscópica e posteriormente é levado para o que criostato
• Tecido vai enrijecer (pelo OCT), há congelação (temperatura importante)
• Corte qualidade também vai depender do tempo do tecido
• Antirrol - À medida que temos o corte este vai para baixo do antirrol ficando entre este e o suporte da faca.
Posteriormente tiramos do suporte para uma lâmina a temperatura do criostato
• Coloração da Hematoxilina & Eosina
→ Colocar diretamente na hematoxilina (3 min) - não reutilizável (há quem coloque antes no formol, álcool 95 ou água
→ Colocar em água
→ Depois em diferenciador fraco
→ Por fim colocar em água corrente (5 min) ou água quente (pôr e tirar) – Vai parar a ação do diferenciador
• Montagem

Organização laboratorial
• Organização dos trabalhadores: Médico; técnico auxiliar de ação médica e administrativos
- À cabeça - diretor médico
- Abaixo - quem controla o laboratório
• Sala de Receção e de Macroscopia: Devem ser salas afastadas de zonas limpas (salas de diagnóstico; parte administrativa)
Processador poderá estar nesta sala ou na sala de inclusão
• Sala de Inclusão: Ampla e com aparelhos de inclusão para as peças (diferenciados dos aparelhos de biópsias para evitar
contaminações).
Se for necessário a inclusão de peças e biópsias no mesmo aparelho deve começar-se
pelas biopsias, para evitar contaminações e por que não demoram tanto tempo.
• Sala de Coloração: Deverá servir para coloração de rotina e histoquímica
• Área da Imuno: Área mais sensível e muitas vezes na mesma sala fazem os exames de biologia molecular
• Salas de Lavagem: Amplas com máquinas para desinfeção, lavagem e esterilização;
Com área onde o material possa secar sem contaminação de poeiras
• Vestiário: Área deve ser distinta da casa de banho
• Sala de Pausa
• Organização para técnica Citológica e Histológica: Devem existir os seguintes equipamentos
→ Frigorífico/ Congelador
→ Material para medição precisa régua
→ Material diverso do laboratório
• Equipamento utilizado no exame de macroscópico:
1) Mesa de entrada com: boa iluminação; água quente e fria; boa extração de ares; sistema de gravação de voz e imagem
2) Sistema de fotografia
3) Aparelho marcador de cassetes
4) Dispensador de formol
5) Balança e Régua
6) Material cirúrgico como: pinças facas tesouras estiletos e bisturis
7) Material de proteção individual (teste- importância das luvas e máscara)
8) Material técnico: cassetes; recipientes com formol para colorar as cassetes; papel absorvente (importante); pinceis;
gases; ácido asséptico ajuda a secar a tinta da China.
 Macroscopia
Baseia-se na obtenção de informações relativas ao tamanho, forma, cor e natureza do órgão a analisar.
Nesta etapa é feita receção de material, confere-se a requisição e o conteúdo (em relação à quantidade/ qualidade
e tipo de material)
Para que estas etapas aconteçam é necessária uma mesa de observação, sistema de exaustão, água corrente,
recipientes, processador de tecidos com sistema aberto
É de principal importância para: - Parte crucial do exame anátomo-patológico;
- Seleção de fragmentos representativos;
- Averiguar necessidade de estudos especiais.
- Quando realizada inadequadamente pode invalidar a interpretação histológica.
As 3 principais etapas são: → Receção do material biológico
→ Acondicionamento
→ Colheita de amostras
Receção de material biológico: (peças cirúrgicas/ peças amputação) (fetos não são recebidos)
• Intestino, útero, apêndice e placenta- órgão oco previamente tratado
• Tudo o que acontece antes da assinatura do técnico não é responsabilidade do laboratório
• Auxiliar de ação médica - Quem leva o material para o laboratório com a respetiva requisição.
No entanto, também pode ser levada por um enfermeiro (quem coloca o material
para ser analisado NOS respetivos contentores com o formol) que esteja no bloco.
OU o cirurgião (só ele pode fazer a requisição) quando é este a levar é porque quer
falar com a anatomopatologista.
• Material deve chegar e trazer consigo a requisição, o contentor e o livro de protocolo.
→ Livro de protocolo deve conter: - Nome de quem transporta;
- Proveniencia;
- Serviço onde tem de chegar
- Identidade do doente
- Tipo de material
- Quantidade de recipientes
• Podemos não receber a amostra em caso: - Má identificação
- Requisição não assinada pelo médico
- Falta de informação clínica (ex: indica que foi colhido apêndice, mas não o pq)
- Material composto por 2 órgãos e só está rececionado um deles. Nestas
situações há uma receção condicionada (recebemos o identificado e
indica-se que o material está incompleto)
• Requisição
Deve sempre acompanhar o material recebido no laboratório e o seu preenchimento é um ato quase tão
importante quanto a colheita do material. Dados importantes que devem constar:
- Identificação do doente (sexo, idade, nome, atividade profissional)
- Local de proveniência (local de onde vem e qual o serviço de onde vem)
- Identificação do órgão e informação clínica (natureza da peça e quantidade)
- Tipo de intervenção clínica cirúrgica
- Se o material Vem fixado ou não (se sim em que meio e a que horas teve início a fixação)
- Se o material pode conter alguma alteração a ter em consideração no exame anatomopatológico
- Nome do técnico responsável para receber o material e o médico que vai analisar
É necessário ser referido se devem ser feitos cortes com técnicas especificas
Devem ser colocadas anotações a dzr se o produto vai para descalcificação e qual o descalcificador
Após a macroscopia são colocadas na requisição informações sobre o destino da peça:
- RD (reserva definitiva);
- RT (reserva temporária - fica 15 dias após a saída do relatório)
- Reserva a longo prazo - fica + de 15 dias, mas posteriormente é deitada fora
- Arquivo ou Fotografia
Nota: após a receção do material deve-se logo atribuir um número de registo este é sequencial cassetes têm
número de registo.
Regras de segurança: - Bata, Luvas (mais importante), máscara (no caso de material contagioso não fixado. Ex: pulmão)
- Caderno
Riscos biológicos - Tudo é potencialmente um risco biológico
Riscos químicos – Xilol/ Formol (substância química altamente irritável para as mucosas tóxico)

Acondicionamento do material biológico:

• Material vem dentro de contentores - vem líquido do fixador? → Não - Tem de ser colocado no laboratório
→ Sim!
→ É o adequado/ Vem em quantidade suficiente?
→ Não - Colocar o líquido
→ Sim - Está em bom estado ou saturado
→ Nesse caso muda-se
• Abertura do órgão - Em órgãos ocos (vesícula biliar, intestino delgado e grosso, estômago e útero)
• Registo da cassete - Retira-se o órgão do líquido fixador e posteriormente prepara-se a peça para a macroscopia.
- Lava se a peça com água corrente durante alguns minutos e coloca-se em álcool 70%
- Passa-se o órgão para a mesa de macroscopia (bancada + tábua)
- Colhe-se fragmentos do órgão e coloca-se em cassetes
- Identificação das mesmas com o nº de registo
• Mesa de macroscopia: Os objetos de corte devem ficar de um lado – tesoura, lâminas, bisturis
Os objetos não cortantes do lado oposto – (pinças, régua)
Para além disto a mesa de macro deve conter uma placa dissecção e um gobelé para colocar as cassetes
• Avaliação macroscopia (descrição):
→ Natureza da peça
→ Estruturas e Dimensões – forma, comprimento, largura, espessura, tamanho, profundidade
→ Aspeto exterior – liso, brilhante, opaco, translucido
→ Tonalidade – castanho, bege, vermelho
→ Consistência – mole, elástico, dura
→ Espessura da Parede
→ Diâmetro órgãos cilíndricos
→ Identificação de zonas normais e aparentemente patológicas
→ Se tiver tumor – identificação distância da margem (tinta da China nas margens)
São escolhidas as áreas que queremos analisar e são colocadas em cassetes. Estas estão identificadas com nº de registo
atribuído à peça no livro de registos e no recipiente.
Macroscopia só está concluída quando o material é colocado em cassetes.

Processamento de Tecidos
• É feito no processador de tecidos num sistema fechado.
• Caracterizado pelo procedimento em que as amostras são colocadas em cassetes, posteriormente vão
para o cesto e é este que vai ao encontro dos vários reagentes:
1) Fixador - Formol tamponado 10%
2) Álcool 70% – Finalidade - Parar a ação da fixação; Começar a etapa da desidratação (retirar a água pq
a parafina e água não se dão)/ (outros podem colocar água antes do álcool)
3) Álcool 95% - Continuar a desidratação
4) Álcool 100% - Desidratar por completo as cassetes
5) Agente intermediário/ Diafanizador - Xilol - Retirar a parafina consegue misturar-se com o álcool e a parafina
6) Parafina
• Protocolo de elaboração:
1) Álcool 70% – podemos deixar bastante tempo
2) Álcool 95% – Temos 2 de seguida
3) Álcool 100% – Temos 3 de seguida
4) Xilol – Temos 3 de seguida
5) Parafina –Temos 2 de seguida
• Reagente deve permanecer sempre mais tempo no último recipiente e menos tempo no primeiro quando
temos mais que um recipiente seguido.
 Fixação
• É uma das primeiras etapas e a mais importante
• A histopatologia tem como fim dar um diagnóstico a partir do estudo da morfologia, estrutura do tecido
ou órgão extirpado.
Para que tal aconteça é necessário imobilizar os tecidos num estado o mais próximo possível do estado
vivo, sem a perda de moléculas. Esta é a razão para que se proceda à sua fixação.
• A fixação deve ir além da simples preservação dos tecidos, deve lhe conferir uma resistência que
permita resistir a todas as manipulações que se seguem, em todo o processamento histológico.
• Aspetos importantes para a fixação:
→ A fixação cria um ambiente em que a célula fica estática sem alterações.
→ Deve prevenir a autólise - Processo interno da célula (própria morte da célula destruição das
enzimas e começa logo quando o organismo morre).
→ Deve prevenir a tumefação (órgão mais sujeito intestino/estômago)
→ Deve prevenira proliferação de microorganismos que vão degradar o tecido
• É uma etapa crítica na preparação dos tecidos porque com tecido mal preservado não se pode construir.
• Ação da fixação:
→ Inibição da autólise tecidular e inibição da estou muito facção dos tecido
→ Imobilização de células e tecidos estáticos
→ Solidificação do material feloidal
→ Endurecimento dos tecidos
→ Modificação dos índices de refração das diferentes estruturas de tecidulares
→ Modificação do volume dos tecidos ligeiramente superior após a fixação
→ Insolubilidade dos constituintes tecidulares
• Fatores que influenciam a fixação
→ Volume de penetração do fixador
→ Rapidez da reação do fixador volume do líquido fixador (30 a 40 vezes superior ao volume da peça)
→ Líquido fixador na quantidade certa conforme a peça
→ Tipo de recipiente
→ As espessura das peças
→ Consistência dos tecidos
→ Duração da fixação
→ Concentração do líquido fixador
→ Ph e temperatura (temperatura aumenta provoca desnaturação das células)
→ Lavagem pós fixação
→ Pressão osmótica
• Agente fixador – Qualidade de um bom fixador:
1) Boa penetração rápida e homogénea
2) Não provocar retração dos tecidos
3) Evidenciar as estruturas intracelulares
4) Evitar o desaparecimento de formações solúveis exemplo glicogénio
5) Permitir encontrar os elementos visíveis
6) Conferir aos constituintes celulares solidez e insolubilidade suficientes para lhes permitirem suportar sem danos
a manipulação e a ação dos reagentes químicos
7) Não deve criar artefactos i assegurar aos tecidos e às células uma conservação imagem fiel
• Regras gerais da fixação:
1) A fixação deve ser o mais cedo possível de preferência ser colocada assim que se tira do organismo
2) A fixação deve ser rápida os fragmentos devem ter em média 5 a 6 mm de espessura
3) Duração da fixação depende do volume da peça e da natureza do fixador escolhido
4) Lavar as peças assegurar a detenção do fixador este passo é interdito há alguns tecidos
• Artefactos relacionados com a fixação:
→ Pigmentos (formólico) - Tempo a mais no formol puro (37%), por exemplo tecidos do pulmão ou pele (se tiver muita
melanina e tiver tempo a mais no formol a mostra vai apresentar muitos fragmentos)
→ Pseudocalcificações
→ Alterações do tecido por ação de ácido pícrico

• Tipos de fixação:
→ Fixação por métodos físicos - Calor (não é tão utilizado), frio (mais utilizado), dissecação (utilizado na veterinária)
→ Fixação por métodos químicos - Fixação por imersão (pegar na amostra e mergulhar)
→ Fixação por vapores - Colocação do formol numa concentração que vai provocar a libertação de vapor
→ Fixação por perfusão - Injeção nas veias (para conservação de cadáveres ou orgãos)
• Tipos de fixadores:
→ Agentes oxidantes:
– Ácidos minerais- Ac. Crómico e ósmico (mto utilizado como fixador para microscopia eletronica)
– Sais metálicos- Bicromato de potássio, biclorato de mercurio, cloreto de platina
– Ácido Orgânicos- Ac. acético (fzr eosina alcoólica/ tbm pode ser utilizado como fixador ou na
etapa de descalcificação), ácido pícrico
→ Agentes Redutores:
– Álcool metílico e etílico, formaldeído (formol)
– Cada fixador tem características próprias, por isso na prática, quase sempre se usam misturas:
umas vezes com ÁC. Pícrico, outras com base no Cromo, outras no Formol, outras ainda com base no Álcool.
• Dados q devam estar presentes nos fixadores:
1) Sinónimos
2) Fórmula química
3) Concentração da sua utilização- se devem ser utilizados na forma pura ou a uma determinada concentração
4) Propriedades físicas
5) Incompatibilidades com outros agentes
6) Modo de atuação sobre as proteínas, glúcidos, lípidos, ácidos nucleicos
7) Velocidade de penetração, sua tolerância
8) Tratamentos pós- fixação
9) Indicações e Contraindicações
10) Modo de utilização
11) Efeitos sobre a saúde dos utilizadores
 Descalcificação
Ocorre entre a macrotomia e o processamento de tecidos.
Não se pode realizar esta etapa sem a realização da fixação, para não haver a degradação dos tecidos.
• Descalcificação:
1) Dissolução dos sais calcários (meio ácido)
2) Desprendimento dos sais calcários (sal sódico, agente quelante, resinas, ionização eletr.)
3) Solubilização do cálcio por um agente ácido (Ac. Nítrico, Ac. Fórmico, Ac. Tricioroacético)
4) Eliminação de cálcio por um agente quelante (EDTA)
5) Resinas transportadoras de iões
6) Eletrolise (exige a utilização de um tampão especifico)
• Agentes descalcificadores:
→ Ac. Fórmico, nítrico, tricloroacético
→ Resinas
→ Agentes quelantes
→ Descalcificador rápido de osso (RDO) - Utilizado quando o bloco de parafina já esta feito, depois de embolido.
É Colocada uma gota em cima da zona com a calcificação, deve ser
utilizado num prazo máximo de 20min para se dar a descalcificação
Cuidados a ter: Na sua utilização, usar sempre luvas, colocar apenas no sítio necessário para não
degradar os restantes tecidos, após a sua utilização deve ser colocado por água
• Descalcificador:
→ Agitador das soluções - É conseguida pela movimentação do cesto nas sol. descalcificantes (agitar o
cesto de tempo a tempo e evitar q fique em repouso)
→ Tempo requerido- Depende do material a descalcificar. Habitualmente cerca de 1h
→ Soluções geralmente utilizadas- Ac. Nítrico (o melhor, garante uma descalcificação mais controlada)
- Hidrocloridrico a 5% (ossos grandes)- começamos a % maiores e acabamos a 5%
Qualquer fragmento q vá para descalcificação, mais peq. ou maior deve estar em suspensão e não em
contacto com o fundo, pois essa parte não ficara bem descalcificada.
É utilizada uma vareta de vidro e presa a esta temos um pedaço de gaze e é dentro deste q são
colocados os fragmentos a descalcificar.
Com uma agulha espetamos no fragmento e conseguimos aferir o estado de descalcificação (conforme o
quão fundo a mesma consegue ir).
Um osso q vai descalcificar deve ter sempre um pouto médio e não descalcificado por completo.
Outra forma pode ser pela radiografia, feita uma antes da descalcificação e outra a meio. Pós isso fazemos
uma métrica de tempo.
Melhor forma de parar uma descalcificação é a lavagem por abundante por água.
• Processamento de tecidos: (em alguns sítios pode incluir a fixação)
→ Desidratação
→ Diafanização/ Clarificação
→ Impregnação
 Desidratação
• Desidratação: (ocorre devido à parafina)
– Etapa q sucede a fixação (sempre que não há descalcificação).
– É a 1º. etapa do processamento, se considerarmos a fixação como um processo de conservação.
– Tem como finalidade retirar a água existente nos tecidos, através de banhos sucessivos de desidratantes.
– O desidratante ideal: Aquele que é solúvel em água e em parafina
– Desta forma não seria necessário utilizar um líquido intermediário, passaria o fragmento da desidratação
diretamente para o meio de inclusão.
– Esta desidratação existe, mas a existência de contraindicações leva à utilização de substancias
desidratantes miscíveis em água e depois recorre-se à substituição de um liquido intermediário.
– Presença de etanol: O método utilizado pelo etanol será o aumento gradual das concentrações do
álcool, iniciado com o álcool a 70%, ou seja, uma menor concentração e
prosseguir com aumentos de 10% até atingir o álcool absoluto.

Um aumento gradual das concentrações dos álcoois não evita a retração, mas modera.
– O etanol deve ser mudado periodicamente pq a água retirada dos fragmentos vai diminuindo as concentrações
dos álcoois.
– Quanto maior for a quantidade de fragmentos, maior terá de ser a quantidade de etanol utilizado.
– Um banho de grande quantidade levará a uma retirada menor de água consequentemente vários
banhos mais pequenos serão os mais efetivos para se dar uma boa desidratação.
• Fatores q influenciam a desidratação:
A rapidez da desidratação está dependente de vários fatores q são sensivelmente os mesmos q nas
outras etapas de processamento (diafanização ou clarificação e impregnação):
→ Concentração do desidratante - Para uma desidratação o mais completo possível, é necessário que:
- Os últimos banhos sejam com o agente no estado puro
- No etanol é necessário proceder com prudencia, pq se ocorrer uma
transferência da Sol. Aquosa para Sol. Etanol puro levará sempre a uma
retração e distorção estrutural-85%
→ Volume do agente desidratante
→ Agitação - A desidratação é mais rápida e eficiente se existir uma agitação constante.
→ Tempo de aplicação - Os fragmentos só devem permanecer nos banhos o tempo necessário até se equilibrar
as proporções entre a agua e o etanol.
No álcool a 100% se os fragmentos ficarem tempo a mais ficam quebradiços
Permanência - Longa: vai levar ao endurecimento dos tecidos. Retração, quando os
fragmentos secam demasiado, vai ser notado na microtomia.
- Curta: os fragmentos ficam com demasiada água. Os efeitos vão se fzr
sentir a curto ou longo prazo (possível o corte, com um fragmento
de consistência reduzida).
→ Temperatura- O aumento de temperatura acelera a desidratação (tornam-se endorecidos), no
entanto aumenta a retraçao e pode levar a uma inflamação do reagente
→ Vácuo- Não é o vácuo em si que facilita/ acelera a desidratação, mas a força da retirada do ar, facilitando a troca
dos reagentes entre si. O espaço ocupado pelo ar passará a estar ocupado pelo agente desidratante q é
o q vai acelerar a desidratação.
→ Tamanho e Consistência dos tecidos- Tecidos fibrosos e mais densos são mais difíceis de desidratar, visto que são
mais difíceis de penetrar.Fragmentos maiores têm maior quantidade de água

Um tecido mal desidratado não permite uma boa diafanização, um bom corte e uma boa cloração.
 Diafanização/ Clarificação
• Fixação/ Desidratação/(descalcificação)/ Clarificação ou diafanização/ Impregnação/ Inclusão
• É uma etapa intermédia, significando a substituição do etanol q se encontre nos tecidos por um solvente da parafina.
• Tem como objetivo, remover o agente desidratante dado que, o meio de suporte usado na etapa
seguinte, é a parafina e esta substância não é miscível: em água e álcool
• Principais agentes diafanizadores: Benzeno, Tolueno, Xilol
• Qualquer um destes 3 tem um anel de benzeno, sendo qualquer um prejudicial para a saúde, no entanto entre os
3 o mais usado é o Xilol.
• Características dos agentes diafanizadores: Alguns inflamáveis/ Muito tóxicos/ Não miscíveis com a água/
Mais densos que o etanol.
• Fatores q influenciam a diafanização: - Temperatura/ Vácuo/ Tamanho, volume e consistência dos fragmentos/
Duração, volume total e nº. de banhos.
• Os critérios mais importantes para a escolha do agente clarificador são:
→ Rapidez na remoção do agente desidratante
→ Toxicidade – Os agentes clarificadores não devem ser tóxicos uma vez que esse resultado, poderia ter sérios
impactos nos tecidos, podendo influenciar o diagnóstico final;
→ Viscosidade – Influencia a velocidade de penetração no tecido dado que, um agente menos viscoso, tem
uma penetração mais rápida;
→ Densidade – A densidade deve ser superior à do álcool para que este possa ser retirado;
→ Possibilidade de substituição por parafina líquida e facilidade da sua eliminação
→ Não provocar danos no tecido – Evitar autólise e putrefação;
→ Custo
 Meios de Impregnação e Inclusão
• Meios utilizados tanto na Impregnação como na inclusão: - Parafina
- Celoidina (meio de inclusão mais duro)
- Resinas
- Gelatina (meio feito com presença de água, único destes que
não necessita da desidratação (já contém uma % de
água na sua constituição))

→ Parafina - São misturas complexas de carbono provenientes da destilação do petróleo.

- Existem vários tipos de parafina: umas mais duras, outras mais moles; umas mais especializadas para
incluir fragmentos duros, outras para fragmentos mais pequenos.
- Cada firma que comercializa as diversas parafinas, adiciona determinadas substâncias para que sejam
mais ou menos eficazes para determinado tipo de procedimentos, para os quais nós vamos utiliza-las.
- Entre as várias substancias que podem ser adicionadas vamos ter por exemplo a borracha que dará
uma maior ou menor possibilidade da parafina ser mais maleável/ elástica.
- A escolha da parafina em lab é feita de acordo com a experiência de quem c/ ela trabalha, e tendo em
conta o tipo de material que se processa, bem como a temperatura ambiente e a espessura do corte.
- Uma boa parafina deve ser homogénea, compacta, opalina e fundir numa forma regular.
- A utilização do calor leva a uma retração e a um endurecimento dos tecidos.
- A duração da permanência na parafina varia com o tamanho do fragmento e a natureza do tecido.
Certos fragmentos de consistência mole e de pequeno tamanho são impregnados em 2 ou 3 horas (se
for biopsia atualmente já se torna muito tempo, nos dias de hoje consegue-se uma boa impregnação
em 1h). Porem, se forem mais volumosos e mais duros, necessitam de muito mais tempo.
- A parafina para ficar líquida, tem de aquecer no seu ponto de fusão (é variável, consoante o tipo), que
pode ir dos 45ºC aos 60ºC. Este intervalo também tem de estar adequado ao tecido que está a ser
manuseado, ou seja, se tivermos fragmentos pequenos temos de ter um pouto de fusão não muito
alto, para não haver degradação.
Por exemplo em biópias, temos de ter uma parafina que nos permita ter um pouto de fusão mais baixo.
(Fragmentos pequenos, a temperaturas elevadas durante muito tempo, em que o ponto de
fusão é elevado, há uma maior degradação dos tecidos.)
- Por um lado, a parafina apresenta vantagens que superam em muito as desvantagens.
Continua-se a trabalhar com a parafina devido:
* Permite-nos um trabalho facilitado com um grande número/ diversidade de fragmentos de
uma maneira Standart, ou seja, apesar de haver diferenças entre os vários tipos de
fragmentos pode-se arranjar uma forma Standart, para todos, mantendo sempre a eficácia.
* A coloração de cortes feitos em blocos de parafina é fácil.
* Fácil conservação de tecidos.
* Técnica rápida, em comparação com a celóidina.
 Impregnação/ Inclusão
• Impregnação é realizada por norma em parafina (substância de consistência firme), e consiste no processo
que tem como objetivo a infiltração ou o preenchimento completo dos fragmentos pelo meio que se vai
utilizar na inclusão. Deste modo, permite uma consistência aos fragmentos rígida o suficiente para que seja
possível serem submetidos a cortes finos.
• Deve ser realizada na estufa a 60°C e os fragmentos são transportados de uma parafina para outra em
intervalos de tempo predeterminados, no entanto, não se deve realizar somente uma passagem pela
parafina, pois será insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos.
• Assim a parafina penetra nos tecidos substituindo o xilol, ocupando os espaços anteriormente
preenchidos por água e gordura, de modo, a preservar a estrutura tecidular.
• As substâncias que garantem uma consistência firme ao fragmento podem ser várias, no entanto, o
meio de impregnação mais usado é a parafina e a resina.
• Processo de impregnação - A peça é mergulhada na parafina fundida numa estufa ou banho-maria a
uma temperatura alguns graus acima do ponto de fusão da parafina (2-4ºC).
• Métodos de Impregnação:
→ Impregnação com gelatina: A impregnação de gelatina é utilizada para amostras altamente viáveis para a
realização de cortes macromicrométicos de órgãos completos em micrótomos do tipo
Tetrander, como alternativa cortes de congelação.
A gelatina é solúvel em água, por isso não é necessário realizar a desidratação.
O seu ponto de fusão é baixo, por isso as amostras não sofrem dano ao serem
manuseadas a temperaturas acima dos 40°C.
A impregnação é feita através de várias impregnações sucessivas em gelatina a 37°C.
→ Impregnação em Celoidina: A Celoidina é uma substância amorfa, branca-amarelada, insolúvel em água, e
solúvel em álcool 50% (q pode ser chamado colódio elástico) e benzoato de metila.
É um método utilizado em trabalhos neurohistológicos, em amostras duras, frágeis e de
grande heterogeneidade (cortes tecido ósseo, globo ocular).
Deste modo obtém-se blocos de grande dureza e não são necessárias temp elevadas.
Neste tipo de impregnação o tecido não deve ter menos de 10 μm de espessura, e tem a
desvantagem de ser um procedimento que demora dias ou semanas a ser concluído.
→ Impregnação em resinas: As resinas acrílicas (o metacrilato de metila, de glicol e as resinas hidrossolúveis) ou resinas
epóxi (é um tipo de plástico que endurece misturado c/ um catalisador).
São um procedimento de impregnação da microscopia eletrónica de transmissão e tbm
usadas no estudo de tecidos ósseos não descalcificados e tecidos duros.
As resinas plásticas, por permitirem cortes muito finos com excelente conservação da
estrutura são usadas em microscopia ótica de alta resolução.
→ Impregnação em meios hidrossolúveis: Este tipo de método é utilizado principalmente para demonstrações de
enzimas, lípidos e também elementos intratecidulares que podem ser
desnaturados pelo calor ou por agentes desidratantes e clarificadores.
O polietileno glicol é o mais utilizado para este tipo de impregnação.

Inclusão
• A parafina, que é o meio mais utilizado, envolve a peça e, após arrefecer e endurecer, forma um bloco compacto
com a amostra incorporada.
• Deste modo, permite o seu fácil manuseamento e dá uma consistência homogénea à amostra que será submetida
posteriormente à microtomia.
• Para que seja realizada uma boa inclusão, é importante que o fragmento esteja completamente desidratado,
diafanizado e corretamente impregnado nos processos anteriores.
• Formas de inclusão e suas características: 1- Chapa: Método utilizado por nós; Ex: Fígado e o baço;
2- Topo: Por norma utilizadas em artérias, formando aspeto de donut;
3- Parede: Por norma utilizados em órgãos ocos, como intestino e estômago.
• Métodos automatizados de inclusão: Existem métodos automatizados de inclusão que ajudam no processamento
dos tecidos como, a máquina Tissue-Tek AutoTEC.
A Tissue-Tek AutoTEC é uma máquina fiável e tem como finalidade a incorporação
de um tecido humano num bloco de parafina durante o processo histológico.
 Micrótomia
• Tipos de micrótomos
→ Micrótomo de Minot (Rotação): O micrótomo de rotação dispõe de uma lâmina fixa e de um porta-blocos móvel,
manuseia-se por meio de um volante, que transforma o movimento de rotação
num movimento vertical do porta-blocos (de cima para baixo e vice-versa).
Desta forma, podem-se compensar diferenças de dureza dentro da amostra e assim
evitar diferenças na velocidade do corte.
É utilizado, principalmente, para cortes em blocos de parafina e podem-se elaborar-se
cortes para a microscopia de alta precisão, com espessuras de 1 até 60 μm.
Vantagens – Grande precisão; Cortes finos
Desvantagem – Grande custo; não podem ser seccionados tecidos impregnados em
gelatina, celoidina e propilenoglicol.
→ Micrótomo de Deslizamento: Este micrótomo é caracterizado por apresentar o mesmo tipo de mecanismo que o
micrótomo de corrediça, no entanto, utiliza o ideal do estilo Minot, no qual o
suporte da faca se encontra fixo e o suporte do bloco será neste caso a peça móvel.

→ Micrótomo de Congelação: É utilizado para fazer secções de tecido congelado, ou seja, que não desidratado.
Uma vez congelado, os cortes são feitos com uma lâmina que gira em torno de um eixo
fixo, de modo que o avanço seja feito pelo suporte da amostra através de um
mecanismo de parafuso.
Desvantagens: Necessárias substâncias químicas para manter o congelamento; Cortes
apenas acima 10 μm; origina uma dificuldade de distensão.
Por essa razão este tipo de micrótomo foi trocado pelo criostato.
→ Criostato: Utilizado para confecionar cortes de tecidos congelados, isto é, permite a obtenção de cortes muito
mais finos de tecidos não fixados (entre 2 a 4 μm).
Este equipamento consiste em um micrótomo do tipo Minot acondicionado dentro de uma câmara de
congelação com temperatura abaixo de – 20ºC.
Por norma é usado para realizar não apenas biópsias intraoperatórias, bem como todos os estudos
histoenzimáticos ou imuno-histoquímicos que são realizados em tecidos congelados.
Apesar da disposição horizontal da lâmina, a obtenção de cortes em série é possível graças à existência
de um sistema anti-roll que obriga o corte a deslizar sobre a superfície da lâmina.
Nos modelos mais modernos é possível optar pelo corte manual ou motorizado, bem como resfriar
rapidamente a amostra a – 60ºC graças à existência de uma placa de congelamento instantâneo.
→ Ultramicrótomo: Utilizado para cortes de material incluído em resinas acrílicas ou epóxi.
Este equipamento permite seções semifinais (com espessura em micras) e ultrafinas (com espessura
em nanómetros) a espessura do corte varia entre 40 e 100 nm em microscópio eletrónico de
transmissão e entre 30 e 50 nm em microscópio eletrónico de varredura.
Este vem adaptado com suporte para navalhas de vidro para a confeção de cortes semifinos, e
suportes para facas de diamante ou safira, utilizadas para confecionar cortes ultrafinos.
• Existem 4 tipos de facas para micrótomos:
→ Bicôncava em ambos os lados: Para cortar blocos de parafina moles.
Desvantagem de vibrar mto, mas faz cortes excelentes, principalmente em
tecido macio.
→ Plano-côncava: Dentro deste grupo existem duas variantes do tipo A e B, estando estas variedades
dependentes do grau de concavidade da face não côncava.
O Tipo A é usado para cortar blocos de parafina no micrótomo deslizante.
O Tipo B é usado para cortar blocos mergulhados em celoidina.
→ Biplanas de cunha: Também chamados de Tipo C.
Estas são usadas de forma intercambiável para fazer cortes de criostato ou cortes de
parafina com o micrótomo tipo Minot.
Dos 4, é o tipo mais utilizado, devido à sua versatilidade quanto à dureza.
→ Biplana com faceta: Também chamado de Tipo D.
É usado principalmente para cortar tecidos congelados com o micrótomo de congelação
(com dióxido de carbono) e no micrótomo do tipo “Minot” do criostato, ou quando o
material a ser cortado é muito duro.
• Os banhos de água são executados imediatamente após o seccionamento dos cortes de parafina.
• Cada corte de parafina tem duas faces diferentes, uma superior, áspera e opaca, outra inferior, lisa e brilhante,
esta última irá aderir melhor à lâmina.
• No banho quente a temperatura da água deve rondar os 45-50 C ̊ , sempre no mínimo 5 C̊ abaixo do
ponto de fusão da parafina.
• Neste banho o objetivo é permitir que o corte tenha uma distensão suficiente para remover as pequenas
dobras e pregas provenientes do corte.
• Finalizando-se esta etapa, as lâminas seguem para a estufa onde haverá uma secagem rápida cerca de
60 C
̊ por no máximo 10-20 minutos.
• Corte em Parafina
→ 1- Recorte e Arrefecimento do bloco: Antes do bloco de parafina ir para o micrótomo para ser
cortado, existem 2 passos a serem feitos. Primeiramente deve haver um recorte do bloco, onde é
retirado o excesso de parafina das laterais do bloco com uma lâmina de bisturi até ser obtida uma
pirâmide para facilitar a orientação da amostra e para que o bloco apresenta apenas a resistência
típica do tecido.
Feito isto, o tecido incluído na parafina deve esfriar, numa câmara fria a 4ᵒC, para que a parafina
endureça e atinja a consistência ideal. Este arrefecimento deve acontecer para que haja uma
hidratação dos blocos, obtendo blocos com maior qualidade. Para além disto a realização de um
bom corte deve ocorrer a uma temperatura entre os 5 e 10ᵒ C.
→ 2- Fixação no suporte do bloco: A parafina líquida vai ser o agente que vai providenciar a adesão
entre o bloco e o suporte.
→ 3- Orientação do bloco: Após o bloco ser colocado no suporte, este é transferido para o braço do
micrótomo, e aí procede-se à orientação da peça em relação à inclinação e horizontalidade. Tem
de ser tida em conta esta orientação para que o bloco fique paralelo à faca.
→ 4- Orientação da lâmina do micrótomo e Desbaste do bloco: Para que haja um bom corte a lâmina tem de
ser corretamente orientada, neste caso devem ter-se em consideração quatro ângulos importantes, que
vão controlar a incidência do bloco na lâmina. Estes ângulos são: Ângulo de inclinação (I); Ângulo de
arraste (A); Ângulo de corte (C); Ângulo de incidência (L).
Uma vez orientada a lâmina, procede-se ao desbaste do bloco. Este consiste em retirar o excesso de
parafina que existe entre a superfície do bloco e a amostra, deve ser feito com uma lâmina já utilizada
(velha), com uma espessura de 15 a 30 μm. Durante este processo deve se ter em atenção a forma como é
feito o corte, pois um desbaste agressivo pode provocar artefactos no tecido.
O desbaste termina quando a superfície do tecido começa a ser obtida no corte.
 → 5- Seleção da espessura do corte: Feito o desbaste, há substituição das lâminas para uma nova e
mais afiada. Após a troca escolhe-se a espessura do corte, que por norma é fino, estando
regulado entre os 4-6μm, esta variação existe porque a espessura ideal do corte vai variar de
acordo com o objetivo e tecido em estudo. No entanto, há tecidos com cortes grossos até aos 10
µm, mas estes provocam perda de detalhe celular, o que nunca deve acontecer são cortes acima
dos 20 µm pois vão provocar enrolamento nos cortes.
Antes de iniciar o corte, deve haver uma correta reorientação da lâmina do micrótomo, e se
necessário, tendo em conta que o correto ângulo, reduz-se o atrito conforme a lâmina passa o
bloco, evitando assim a compressão da secção
→ 6- Realização do corte: Depois de substituídas as lâminas e escolhida a espessura do corte, inicia-se
o corte. Este deve ser feito com movimentos constantes em relação à velocidade, para que facilite
a formação da fita contínua de cortes. A velocidade dos cortes nos vários tecidos vai estar por sua
vez dependente da natureza do bloco e do tecido, que é inversamente proporcional à dureza do
mesmo.
Durante a obtenção dos cortes deve-se ter sempre o auxílio de pincéis e pinças, que ajudarão na
orientação da fita formada.
→ 7- Extensão e Secagem dos cortes

Colorações
❖ Coloração Hematoxilina-Eosina
→ Hematoxilina
• A hematoxilina é um corante natural extraído da árvore, sendo a mais utilizada a hematoxilina Harris,
que tanto é progressiva como regressiva.
• A hematoxilina na sua forma natural não é corante, para isso precisa de ser oxidada previamente em
hemateína.
 • Uma oxidação excessiva pode ocorrer durante a fabricação da hematoxilina ou com o envelhecimento
da mesma, o que causará uma má coloração.
• A hematoxilina é um corante básico que cora de azul/roxo as estruturas ácidas (basofílicas) dos
tecidos (núcleos, cromatina e a membrana nuclear)
• Tem pouca afinidade para os tecidos, por isso é usado um mordente que tem como objetivo melhorar
a capacidade da hematoxilina se ligar aos componentes tecidulares.
• Existem 2 formas de usar a hematoxilina:
– A coloração progressiva - É um processo de coloração mais lento no qual o tecido permanece na
solução de coloração apenas o tempo suficiente para atingir o ponto
desejado. Este tipo de coloração não precisa de diferenciação.
– A coloração regressiva - É um processo de coloração mais rápido no qual os tecidos são
intencionalmente supercoloridos e depois procede-se ao uso de uma solução
ácida diferenciadora descolorados.
→ Eosina
• A eosina Y é a mais amplamente utilizada.
• A eosina, é chamada de contracoloração, uma vez que cora aquilo que a hematoxilina não tem
capacidade de corar.
• Sendo um corante ácido cora, o citoplasmas e fibras, ou seja, cora estruturas básicas (acidófilas) de
rosa/alaranjado.
• A eosina é muito solúvel em água, portanto quanto mais diluído for o álcool usado na lavagem após a
coloração com eosina, mais este corante vai ser removido do tecido.
• A diferenciação pela coloração com eosina pode ocorrer na lavagem com água corrente, e uma
diferenciação ligeiramente maior ocorre durante a desidratação pelos álcoois.
→ Procedimento
• Xilol (2) – Álcool (3_começa no 100) – H2O – Diferenciador – H2O – Eosina – Alcool (2_96-100) - Xilol
• Xilol agente desparafinante e agente de diafinização.
• O 1º. Passo na realização de uma coloração H&E é dissolver toda a parafina com o auxílio do xilol
(parafina é hidrofóbica e impermeável a reagentes aquosos) - Desparafinação
• O 1º. xilol é sempre o mais usado e mais saturado enquanto os outros dois são mais recentes.
Contudo, a função do 1º. e 2º. Xilol é de desparafinar, o último xilol diafanizar.
• O 2º. Passo após a desparafinação, a lâmina é passada por vários álcoois, em concentrações
descendentes, para remover o xilol - Hidratação.
• Após a coloração ocorre a desidratação da amostra, usando álcool de diferentes concentrações em
ordem crescente (álcool 70%, 95%, 100%).
• Para finalizar o procedimento, passa-se a amostra por xilol uma última vez para se obter a
diafanização da amostra, isto é, garantir a remoção completa do álcool do interior dos tecidos.

❖ Coloração PapaNicolau
• A coloração é constituída por um corante básico (hematoxilina), dois corantes ácidos (Orange G/
Eosina) e um corante policromático.
• Esta coloração é constituída por etapas de coloração do núcleo e do citoplasma, por fases de
hidratação, desidratação e diafanização.
→ Hematoxilina
• No papanicolau são usadas fórmulas de hematoxilina de Harris ou de Gill para colorir o núcleo.
 A hematoxilina de Harris pode ser usada progressiva ou regressivamente.
• A coloração progressiva cora muito levemente o citoplasma.
Depois temos os corantes, EA50 e Orange G, que usam ácido fosfotúngstico como mordente.
→ Orange G
• O Orange (OG-6) é um corante ácido com dois grupos sulfónicos.
• O orange G-6, primeira contracoloração, é um corante ácido de base alcoólica, que cora os
componentes básicos (acidófilos/eosinofílicos) do citoplasma de amarelo ou alaranjado.
• No laboratório, na coloração de Papanicolaou, é utilizado OG-6.
→ EA-50
• O corante EA-50, pode ser substituído por EA-36 ou EA-65, é produto de dois corantes
Light Green (ácido) e Eosina.
→ Procedimento
Álcool (95-70) – H2O – Hematoxilina – H2O – Álcool 95 – Orange – Álcool 95 – EA-50 – Álcool (95-100) – Xilol
• Assim que realizado o esfregaço, a lâmina ainda húmida deve ser imediatamente imersa em
álcool 95%, onde permanece até o momento da coloração.
• A hidratação é o processo no qual o material citológico é hidratado através da reposição gradual da
água das células por meio de banhos alcoólicos de concentrações decrescentes até ao banho de água
corrente para facilitar a interação com o primeiro corante.
• O álcool a 95% é utilizado como fixador uma vez que é eficaz e pouco tóxico.
• O álcool 96% que se encontra a seguir à hematoxilina, vai ter como função a compatibilização das
células com o próximo corante, que é de base alcoólica (Orange G).
A passagem por esse álcool também auxilia na remoção do excesso de hematoxilina.
• O outro álcool que iremos ter entre o Orange G e o EA-50 vai servir para retirar o excesso de corante e
compatibilizar as células com o próximo corante, que também é de base alcoólica.