artigo tcnico

Determinao da microbiota
Janete Aparecida Dias
1.Introduo
A resoluo RDC n 591, de 27 de Junho de 2000, institui e implementa requisitos de Boas Prticas de Fabricao, para estabelecimentos que fabriquem ou comercializem produtos mdicos. A resoluo citada apresenta diversos requisitos de qualidade, que visam eliminar o risco de contaminao cruzada, entre eles a limpeza, sanitizao de superfcies, equipamentos, higiene pessoal dos funcionrios e monitoramento microbiolgico do ambiente de fabricao. Segundo o Ministrio da Sade2 , os operadores da linha de produo so considerados os principais vetores de disseminao dos microrganismos, pois manipulam diretamente as matrias-primas, produtos semi-acabados e acabados . A lavagem das mos, feita com gua corrente e sabo, capaz de eliminar sujeiras, graxas, leos e microrganismos transitrios. Os microrganismos transitrios so considerados os principais causadores da maioria das infeces hospitalares. So mais facilmente removidos que os microrganismos residentes, situados nas camadas mais profundas da pele. O objetivo deste trabalho foi determinar quantitativamente e qualitativamente a microbiota predominante nas mos de operadores, antes e aps a lavagem das mos.

antes e aps a lavagem das mos de operadores da linha de produo de uma indstria de produtos para a sade
microrganismos e os valores foram expressos em unidades formadoras de colnias5.

2.2 Preparo do meio de cultura

Para o preparo de 600 ml de meio de cultura, foram acrescentados 24 g de casena de soja, 3,4 g de gar bacteriolgico, 0,42 g de lecitina de soja, 3ml de Tween 80 (tensoativo) e 3,4 g de tiossulfato de sdio para inativao de possveis resduos de sanitizantes. Aps completa dissoluo, o meio de cultura foi submetido a um cozimento em forno de microondas (potncia alta), durante 8 minutos, divididos em duas etapas de quatro minutos. Em seguida foram distribudos 20 ml do meio de cultura por placa de contato. Aps o endurecimento do meio de cultura as placas foram tampadas, embrulhadas em papel de seda e esterilizadas por Cobalto-60 com dose mnima de 25 KGy.

2.3 Obteno e preparo das amostras

A amostragem foi realizada no perodo de setembro a outubro de 2003. Foram amostrados 70 operadores do sexo masculino e feminino. Os indivduos apresentavam-se saudveis e livres de ferimentos ou dilaceraes nas mos

2.4 Amostragem antes da lavagem de mos

Durante a amostragem foi empregada a metodologia de placa de contato por meio de leve presso na regio palmar, a seguir simultaneamente nos quatro dedos (indicador, mdio, anular e mnimo) mediais e distais. Por ltimo na regio distal do dedo polegar, totalizando-se aproximadamente quinze segundos de amostragem em cada indivduo. Em seguida, os operadores se dirigiram para a sala de antisepsia e efetuaram a lavagem das mos.

2.Material e Mtodo

2.1 Procedimento
Para a amostragem das partculas viveis foi empregado o mtodo de placas de contato, contendo meio de cultura semi-slido. Aps a amostragem, as placas foram incubadas durante 48h a temperatura entre 30-35 graus Celsius e, em seguida, foi realizada a contagem do crescimento dos Janete Aparecida Dias
* Johnson & Johnson Produtos Profissionais Ltda.Laboratrio Cincia da Esterilizao - Microbiologia Rod. Presidente Dutra, Km 154 SJC CEP: 12240-908 Contato: jdias2@medbr.jnj.com

2.5 Lavagem das mos

A lavagem das mos, foi realizada com degermante lquido, seguida de secagem com papel toalha branco.

2.6 Amostragem aps a lavagem de mos

Aps o trmino da lavagem de mos, cada operador foi imediatamente re-amostrado na prpria sala de anti-sepsia de maneira idntica ao item 2.4.

2.7 Acondicionamento das placas aps coleta

Aps o trmino da coleta, as amostras foram incubadas em estufas sob a temperatura de 30-35 C durante 48h.

Placa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

N N Colnias Colnias Antes Depois

4 10 74 19 2 22 7 50 262 1 14 7 11 9 12 13 102 167 14 270 4 29 19 92 28 134 138 102 48 14 30 339 139 106 42 1 176 46 13 34 159 15 6 33 13 13 126 15 15 24 75 95 7 58 56 17 107 200 61 19 322 37 61 163 139 18 45 88 35 185 554 15 21 132 15 32

Placa
39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
Mdia

N N Colnias Colnias Antes Depois

62 59 560 106 277 31 230 102 170 145 21 13 33 13 188 61 2 45 72 600 7 85 41 49 29 340 256 274 362 46 182 98 66,4 84,7 364 82 299 68 95 76 269 18 70 46 14 47 16 58 225 7 2 120 35 32 6 140 49 5 176 201 44 32 11 26 22 70 81,3 108,3

2.8 Contagem dos Microrganismos

Aps o perodo de incubao, cada placa foi observada quanto ao crescimento de microrganismos, e a contagem foi expressa em unidades formadoras de colnias (UFC).

2.9 Provas Bioqumicas (Bacilos, cocos e micrococos aerbios Gram positivos)

Para identificao dos bacilos esporulados Gram-positivos foi utilizado o Kit de identificao Api 50 CHB marca Biomerieux, seguindo instrues do fabricante. Na identificao microbiana dos cocos e micrococos foi utilizado o Kit de identificao Api Staph marca Biomerieux, de acordo com instrues do fabricante.

2.10 Precaues de Segurana

As amostras e culturas foram consideradas potencialmente patognicas, sendo manipuladas de forma assptica. Aps a leitura e interpretao dos resultados, o material utilizado foi submetido a autoclavagem a vapor sob a temperatura de 121C durante 1 hora.

3. Resultados e Discusso
Verificou-se atravs dos resultados descritos na Tabela 1 que, aps a lavagem das mos 50% dos indivduos apresentaram um aumento quanto ao nmero de bactrias, enquanto que 48,27% apresentaram uma reduo do nmero de bactrias e 1,43% permaneceram inalterados. O valor mdio de bactrias por indivduo analisado foi de 66,4 e 81,3 UFC, respectivamente, antes e aps a lavagem de mos. O clculo do desvio padro indicou, entretanto, uma grande variabilidade dos resultados, demonstrando que estes valores mdios no podem ser considerados estatisticamente diferentes. A Figura 1 apresenta a distribuio de freqncia do nmero de colnias detectadas nas mos antes e aps a lavagem das mos. As curvas de distribuio de freqncia mostraram-se muito semelhantes com relao a nmero total de colnias presentes, indicando que no houve diferenas significativas nestas duas situaes avaliadas: antes e aps a lavagem de mos. Com o objetivo de avaliar a abrangncia da lavagem de mos, com relao remoo da microbiota transitria e exposio da microbiota residente, foram realizadas anlises comparativas dos tipos de microrganismos recuperados antes e aps a lavagem.

Desvio Padro

n Aumento n Reduo; n Inalterado

Tabela 1 Resultados da contagem microbiana nas mos antes e aps a lavagem

Figura 1 - Distribuio de freqncia do nmero de bactrias por indivduo antes e aps a lavagem de mos

Frequncia (indivduos)

artigo tcnico

Os resultados da caracterizao dos microrganismos foram apresentados nos quadros 1 e 2 (veja pgs. 25 e 26). Atravs dos resultados apresentados no quadro 1 observamos diferenas com relao a microbiota presente nos operadores aps a lavagem de mos. Na amostragem realizada antes da lavagem de mos foi evidenciada a presena das seguintes bactrias: 38,4% pertencendo ao gnero Staphylococcus, sendo que S. saprofiticus correspondeu a 15,38% das ocorrncias, S. warneri correspondeu a 7,69% S.lugdunensis correspondeu a 7,69% e S. hominis correspondeu a 7,69%. O gnero Micrococcus e o Bacilus cereus foram observados em 7,69% das amostras analisadas. Os dados experimentais revelaram diferena qualitativa entre a microbiota detectada antes e aps a lavagem de mos. Os resultados apresentados no quadro 2 correspondentes aos recuperados em amostras aps a lavagem de mos, demonstraram prevalncia do gnero Staphylococcus, correspondendo a 75% das bactrias. As espcies S. epidermidis e S. warneri foram as predominantes, correspondendo cada uma a 31,25% das bactrias analisadas. Dentro do gnero Staphylococcus foi ainda observada uma ocorrncia de S. aureus e uma de S. hominis (6,25% cada). Micrococcus sp foi observado, correspondendo a 6,25% das amostras analisadas. Bactrias aerbias que esporulam, do gnero Bacillus, tambm foram recuperadas na ordem de 6,25%: B. subtilis, B. pumilus e B. circulans. Os resultados obtidos confirmaram estudos anteriores12, que indicaram a predominncia do gnero Staphylococcus em coletas de mos. Outros microrganismos foram recuperados e analisados pela colorao de Gram, indicando outros tipos de bactrias: cocos e bacilos Gram positivos, entretanto, a identificao bioqumica destas bactrias no foi efetiva, devido ao tempo longo de estocagem em geladeira aps o perodo de incubao (quadro 1 nmero de placas: 4A, 7A, 9A, 10A, 11A, 12A) que levou perda de suas caractersticas bioqumicas 7,8.

Referncias Bibliogrficas
(1) Resoluo nmero 59 de 27 de Junho de 2000 Boas Prticas de Fabricao para estabelecimentos que fabriquem ou comercializem produtos mdicos. (2) BRASIL. Ministrio da Sade,1994. Boas prticas de fabricao de produtos farmacuticos. Braslia: Secretaria de Vigilncia Sanitria. (3) AMARAL D.F. 2001. Determinao e controle da populao microbiana predominante nas mos dos funcionrios da linha de produo de uma indstria farmacutica. International Journal of Pharmaceutical Compounding 3: 74-7. (4) JOHNSON & JOHNSON, 1993. Um manual para os profissionais da rea da sade- lavagem de mos. So Paulo:Johnson & Johnson Medical Inc. 27 p. (5) SBCC 1997. Revista da Sociedade Brasileira de Controle de Contaminao. Ano 1 V.1. (6) FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988. 4. ed. So Paulo: Editora Atheneu X.1.1.1-2; X.1.2.1 p. (7) PELCZAR M.; REID, R. ; CHAN, E. C. S., 1980. Microbiologia. V.1 So Paulo: Ed. McGraw-Hill 566 p. (8) PELCZAR Jr., M. J.; CHANE, E. C. S.; KRIEG, R. N. 1997. Microbiologia conceitos e aplicaes.V 2. 2. ed. So Paulo: Ed. McGraw-Hill 517 p. (9) Biomerieux, 1978. Sistema de identificao de stafilococos e micrococos - Api Staph manual de orientao. Rio de Janeiro. 12 p. (10) Biomerieux, 1980. Sistema de identificao de Bacilos - Api 50 CH manual de orientao. Rio de Janeiro. 10 p. (11) KONEMAN, E.W. 1997. Diagnostic microbiology. 5. ed. New York: Lippincot. (12) PERRY, J.J.; STALEY, J.T.1997. Microbiology dinamic & diversity. Waschington: College Publisching. (13) Sociedade Brasileira de Controle de ContaminaoSBCC RN- 006-2002 Parte 1 Amostragem : Metodologias e limites microbiolgicos em areas limpas.

Concluses
- necessrio padronizar as etapas de lavagem de mos, determinando agente antisptico e tempo de contato. - Realizar um plano amostral contemplando as diferentes estaes do ano. - Preparar suspenses dos microrganismos isolados e identificados e verificar a resistncia frente a diferentes antispticos. - Neste estudo a ordem de grandeza observada nos operadores est dentro de valores aceitveis.

Agradecimentos: Johnson & Johnson Produtos Profissionais - Brasil

Quadro1 - Identificao dos Microrganismos - Antes da lavagem de mos. N da placa Morfologia da colnia Colnia de cor bege consistncia pastosa, tamanho grande, com borda achatada e irregular com aparncia fosca. Colnia amarela clara de consistncia pastosa, tamanho mdio, elevada e forma circular brilhante. Colnia de cor branca, consistncia pastosa, tamanho mdio, superfcie achatada e borda circular, brilhante. Colnia de cor amarela forte, consistncia pastosa, tamanho mdio, superfcie circular, achatada e levemente fosca. Colnia de cor branca, consistncia pastosa, de tamanho mdio, superfcie plana e circular, brilhante. Colnia de cor branca, consistncia pastosa, tamanho mdio, levemente elevada e brilhante. Colnia de cor bege, consistncia elstica, achatada, circular e brilhante. Colnia de cor bege escura, pastosa, achatada, circular e fosca. Colnia bege transparente, pastosa, achatada, circular e levemente fosca. Colnia amarela, mucide, grande, borda circular, elevada e brilhante. Colnia amarela, pastosa, mdia, borda circular, achatada e levemente brilhante. Colnia branca, pastosa, achatada, circular, levemente brilhante. Colnia alaranjada, pastosa, grande, achatada, circular e brilhante. Microscopia Teste bioqumico Sub-cdigo

Gnero e Espcie

1A

bacilo G+ esporulado.

Api 50 CHB

Bacillus cereus

2A

coco G+

Api Staph

0000002

Micrococcus-sp

Staphylococcus
coco G+ Api Staph 6222112

3A

hominis

4A

coco G+

Api Staph

6730730

5A

coco G+ Api Staph

6630112

S. saprofiticus

6A

coco G+

Api Staph

6630113

S. warneri

7A

coco G+

8A

coco G+

Api Staph

6702152

S. lugdunensis

9A

bacilo G+

10 A

coco G+

11 A

coco G+

12 A

coco G+

13 A

coco G+

Api Staph

6230152

S. saprofiticus

Quadro 2 - Identificao dos Microrganismos - Aps a lavagem de mos. N da colnia 1B Morfologia da colnia Cor branca, brilhante, lisa, circular e superfcie pouco elevada. Cor branca, brilhante, pouco opaca, lisa, circular e superfcie plana. Cor bege clara, brilhante, lisa, circular, superfcie pouco elevada. Cor branca, brilhante, lisa, circular e superfcie plana. Cor bege clara, brilhante, lisa, superfcie plana. Cor creme, brilhante, lisa, circular, superfcie plana. Cor bege p/ amarela, brilhante, circular, superfcie elevada. Cor bege, rugosa, opaca, superfcie irregular e plana, tamanho grande (acima de 4mm). Cor gelo, lisa, opaca, circular, superfcie plana. Cor branca, brilhante, lisa, circular, superfcie elevada. Cor bege, brilhante, lisa, circular, superfcie pouco elevada. Cor rosa, brilhante, lisa, circular, superfcie elevada. Cor bege brilhante, extremidade fosca, circular e superfcie elevada no centro. Cor bege clara, fosca, borda irregular achatada, tamanho grande (acima de 4mm). Cor amarela forte, brilhante, circular, superfcie plana. Cor amarela forte, brilhante, circular, superfcie elevada. Microscopia Teste bioqumico Sub-cdigo Gnero e Espcie

coco G+

Api Staph

6.706.142

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus warneri Bacillus pumilus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus aureus Micrococcus sp Bacillus ciculans

2B

coco G+

Api Staph

6.706.142

3B

coco G+

Api Staph

6.706.152

5B

coco G+

Api Staph

6.230.113

8B

coco G+

Api Staph

6.706.152

11 B

coco G+

Api Staph

6.234.113

13 B

coco G+ bacilo G+ esporulado coco G+ coco G+ coco G+ coco G+ bacilo G+

Api Staph

6.335.133

14 B

Api 50CHB

18 B 19 B 20 B 21 B 22 B

Api Staph Api Staph Api Staph Api Staph Api 50CHB

6.306.003 76.734.11 6.736.133 0.004.000 -

23 B

bacilo G+

Api 50 CHB

Bacillus subtilis Staphylococcus hominis Staphylococcus warneri

24 B 25 B

coco G+ coco G+

Api Staph Api Staph

6.214.012 6.336.133