UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE TECNOLOGIA FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

GYORGY RONALDO SAMPAIO FERREIRA 10091001901

RELATRIO SOBRE ATIVIDADE DA PEROXIDASE NA POLPA DE AA (Euterpe oleracea)

Relatrio apresentado como pr-requisito para obteno de nota para a disciplina Bioqumica de Alimentos II, referente s aulas prticas dos dias 15 de setembro, 13 e 27 de outubro de 2009, sobre a atividade enzimtica da peroxidase presente no aa.

BELM OUTUBRO- 2009

1. INTRODUO O aa (Euterpe oleracea) um fruto tpico da Amaznia, matriaprima para produo de polpa ou suco, alimento altamente energtico, por possuir significativo teor lipdico, e com grande contedo funcional em razo do contedo de antocianinas, fibras e outras substncias nutracuticas. Porm, esse produto altamente perecvel. Essa perecibilidade pode estar associada, principalmente, elevada carga microbiana presente no fruto, e agravada s prticas ps-colheita a que o fruto submetido, relacionada com a colheita dos cachos, remoo dos frutos desses cachos, transporte e condies ambientais desfavorveis, como altas temperaturas e alta umidade relativa. Alm disso, no processo de obteno da polpa, a manipulao favorece a proliferao de microrganismos e reaes enzimticas, principais responsveis pela

deteriorao desse produto. (MENEZES et al., 2008) Essas reaes enzimticas so responsveis por mudanas nas suas propriedades organolpticas e nutricionais, com destaque para a peroxidase que, por ser a enzima mais termorresistente, a sua inativao utilizada como indicadora da eficincia nos tratamentos trmicos. A degradao do aa pode decorrer da ao da enzima polifenoloxidase. (EMBRAPA, 2006) As peroxidases (POD) e polifenoloxidases (PFO), presentes na maioria dos vegetais, so as principais responsveis por alteraes indesejveis das caractersticas originais. Essas enzimas catalisam a oxidao de substncias polifenlicas, naturalmente presentes em vegetais in natura (MENEZES et al., 2008). A peroxidase (E.C.1.11.1.7., doador H2O2 oxidorredutase) uma enzima associada a reaes de deteriorao oxidativa em frutas e vegetais e produtos processados. Podem causar mudanas indesejveis no aroma, gosto, cor, textura e tambm a perda de nutrientes, participar da destruio de vitamina C, catalisar o branqueamento dos carotenides na ausncia de cidos graxos insaturados e a descolorao de antocianinas. Catalisa a reao de degradao de cidos graxos insaturados, produzindo volteis que alteram o sabor (BRITO et al., 2005). Enzimas tm um pH timo(ou intervalo de pH) no qual sua atividade mxima. Em extremos de pH (muito cido ou muito alcalino) essa atividade diminui. (LEHNINGER et al., 2006)

A peroxidase termorresistente, pois sua inativao s se inicia a partir de 70C. geralmente admitido que, se a peroxidase inativada, todas as outras enzimas tambm sero. Por est razo, est enzima muitas vezes utilizada como indicador das outras enzimas presentes no mesmo alimento. (ROGEZ, 2000) No aa, em que enzimas naturais termorresistentes esto presentes, h limitao na temperatura mxima que pode ser atingida no processo. Este mximo ocorre devido o processo trmico fornecer suficiente letalidade para os microrganismos, mas insuficientes para a inativao da enzima. Isto uma conseqncia da diferena de degradao microbiana e enzimtica temperatura (D e Z). (MAGALHES, 1992) O objetivo destas trs prticas foi avaliar o comportamento da atividade enzimtica da peroxidase presente no aa variando o pH, tempo e temperatura.

2. MATERIAL E MTODOS 2.1. MATERIAL Os materiais utilizados nas aulas prticas dos dias 15 de setembro, 13 e 27 de outubro esto listados abaixo. Polpa de aa; Solues tampo pH 3, 4, 5, 6 e 7; Soluo de p-pda (phenylenediamine); Soluo de perxido de hidrognio (H2O2); Ultrassom (UltraSonic Clear); Banho-maria (Quimis Q-215 M2); Espectrofotmetro (BioPharma Ultrospec 200) Balana semi-analtica; Termmetro; Cronmetro; Tubos de inox; Cubetas; Tubos de ensaio; Micropipetas; Balo volumtrico; Papel filtro; Funil;

2.2. MTODOS 2.2.1. Prtica I: Solues tampo Nesta aula prtica foram feitas solues tampo de pHs 3, 4, 5, 6 e 7. Para isso foram feitos os clculos de suas concentraes e atravs delas calculou-se a massa/volume utilizada de cada reagente. As equaes utilizadas esto nas Figuras 1, 2 e 3 respectivamente. Para o pH 3 foi utilizado cido ctrico (C6H8O7) e hidrxido de sdio (NaOH). Para os pHs 4 foi utilizado sdio de acetato anidro (CH3COONa) e cido actico glacial (CH4O2); e para os pHs 6 e 7 fosfato de sdio monohidratado (NaH2PO4.H2O) e fosfato de sdio difsico (Na2HPO4).

[ [
Figura 1:

] ]
Figura 2: Equao Figura 3: Equao utilizada para encontrar a massa de reagente slido. utilizada para encontrar o volume de soluo em razo da densidade.

Equao

utilizada para encontrar a concentrao.

2.2.2. Prtica II: Determinao de pH timo e determinao de KM e VMX Para se determinar o pH timo de ativao enzimtica foi preparada uma soluo de p-pda. Nessa soluo foram pesados 0,2 g de p-pda em uma balana semi-analtica e essa massa foi colocada em um balo volumtrico de 10 mL protegido de papel alumnio e foi ento solubilizada com as solues tampo descritas acima, esses bales volumtricos foram levados a um banho de ultrassom para que o p-pda fosse homogeneizado totalmente na soluo tampo. Aps a homogeneizao as solues foram transferidas para os tubos eppendorf, e foram ento armazenadas dentro de um isopor para que pudessem ficar sob refrigerao e no fossem expostas a luz. Para o preparo da soluo de perxido de hidrognio (H2O2) a 30% foi colocado em bales volumtricos de 50 mL, que continham solues tampo de pHs 3, 4, 5, 6 e 7, 76,5 L de H2O2 com uma micropipeta e estes foram armazenados no isopor ao abrigo da luz e sob refrigerao. Para o preparo das amostras foram pesadas, em cubetas de 3000 L, 7 amostras cada uma contendo cerca de 1 g de aa, em seguida foram adicionadas a elas suas solues tampo de pH respectivo a um fator de diluio de 1:9. As amostras foram ento filtradas em papeis filtro e que estavam dentro de tubos de ensaio. Foram ento diludas novamente a um fator de 3,33 e foram ento transferidas para cubetas. A essas cubetas foi adicionado 2700 L de tampo, 100 L de H2O2, 100 L de aa diludo em seu respectivo tampo e 100 L de p-pda a 2%. Essas cubetas foram ento homogeneizadas e levadas ao

espectrofotmetro para que fosse feito a leitura de absorbncia para se determinar o pH timo atravs da maior absorbncia. De posse da determinao do melhor pH foi feito ento a determinao de K M e VMX.. Para isso foram utilizadas certas quantidades de soluo tampo, H 2O2, aa e p-pda. Essas quantidades esto na Tabela 1. Aps a adio de cada, as

cubetas foram levadas ao espectrofotmetro para que se pudesse saber o valor KM e VMX.
Tabela 1: Quantidades de solues adicionadas s cubetas

Cubeta 1 2 3 4* 5 6 7

Soluo tampo (L) 2790 2790 2780 2750 2700 2600 2400

H2O2 (L) 100 100 100 100 100 100 100

Aa (L) 0 100 100 100 100 100 100

p-pda 2% (L) 10 10 20 50 100 200 400

*A amostra foi feita em triplicata. 2.2.3. Prtica III: Determinao de D e Z. Primeiramente foram pesadas 5 amostras de aa cada uma contendo cerca de 20 g dentro de tubos de inox, sendo que uma amostra foi feita em triplicata. Esses tubos foram colocados em um banho-maria para que as amostras atingissem determinadas temperaturas em tempos diferentes (Tabela 2). Quando as amostras atingiram a temperatura e o tempo desejado foram resfriados a uma temperatura de 21C.
Tabela 2: Tempo de incubao pela temperatura a qual cada amostra sofreu

Tubos 1 2a 2
b c

Tempo de incubao 1s 30 s 30 s 30 s 10 min. 1s 1s

Temperatura(C) 85 85 85 85 85 75 65

3 4 5

Aps este tratamento trmico foi pesado em um tubo de ensaio um grama de cada amostra e tambm uma nova amostra que no havia sofrido tratamento trmico, em funo desta massa foram ento diludas a um fator igual a 1:9 com o tampo ideal. Aps esta diluio foram filtradas e transferidas para um tubo de ensaio e foram novamente diludas a um fator igual a 3,33. Em cubetas foi adicionado 2700l de tampo, 100l de perxido, 100l da diluio

do aa e 100l da soluo de p-pda (2%); estas foram ento homogeneizadas e levadas ao espectrofotmetro. 3. RESULTADOS E DISCUSSO 3.1. RESULTADOS 3.1.1. Determinao do pH timo Para a determinao de pH timo foi feito um grfico (Figura 4) em que mostrado os resultados desta aula prtica.
0.4

0.3

UA/min

0.2

0.1

0.0 2 3 4 5 pH 6 7 8

Figura 4: Grfico de atividade enzimtica em funo da peroxidase.

De acordo com o grfico (Figura 4) foi possvel notar que atividade enzimtica da peroxidase em funo do pH (3, 4, 5, 6 e 7) teve-se uma atividade enzimtica mxima no pH prximo a 6, e que em no pH 3 e quando est se passando do pH 7 e indo para um pH mais alcalino a atividade enzimtica comea a decrescer. 3.1.2. Determinao de KM e VMX Para a determinao de KM e VMX foi primeiramente necessrio ser feito da absorbncia em cada cubeta em funo da concentrao de p-pda (Tabela 3). E ento foi com os clculos da absorbncia foi feito o clculo da concentrao de produto formado atravs da equao da reta da curva de calibrao (Figura 5). A tabela 4 mostra esta concentrao de substrato em cada cubeta e o grfico (Figura 6) mostra o comportamento da reao medida que aumentada a concentrao de substrato.

Tabela 1: Mdia da absorbncia em cada cubeta em funo da concentrao de p-pda.

Cubetas 1 (branco) 2 3 4** 5 6 7

Mdia da Absorbncia 0,001 0,043 0,052 0,0623 0,062 0,069 0,078

p-pda 2% L 10 10 20 50 100 200 400

** O ponto 4 foi feito em triplicata, sendo que ele apresentou uma mdia de 0,0623, um desvio padro de 0,0021 e um coeficiente de variao de 3,4633.

Figura 5: Equao da curva de calibrao Tabela 2: Concentrao de produto formado e a concentrao de substrato.

Cubetas Produto formado 1 2 3 4 5 6 7 0,0460 0,0839 0,0920 0,1013 0,1010 0,1073 0,1154

[S] 0,6167 0,6167 1,2333 3,0833 6,1667 12,3333 24,6667

mM eq produto formado

0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0 5 10 15 [S] 20 25 30

Figura 6: Quantidade de produto formado pela concentrao de substrato adicionado

Foi possvel notar que medida que concentrao de substrato foi aumentada maior foi a quantidade de produto formado. A partir destes valores encontrados foi feita a determinao de KM e VMX, fazendo a inverso do produto formado pela concentrao de substrato o resultado est na Tabela 5 e esse comportamento mostrado no grfico da linearizao de Lineweaver-Burk (Figura 7). A partir da equao da linearizao mostrada na Figura 7 obtiveram-se os de KM e VMX, atravs da equao mostrada na Figura 8.
Tabela 3: Valores encontrados

Cubetas 1/Produto formado 1 2 3 4 5 6 7 21,7451 11,9247 10,8725 9,8724 9,9018 9,3193 8,6641

1/[S] 1,6216 1,6216 0,8108 0,3243 0,1622 0,0811 0,0405

1/mM eq produto formado

14 12 10 8 6 4 2 0 0.0 0.5

y = 1.7926x + 9.184 R = 0.9061

1.0 1/[S]

1.5

2.0

Figura 7: Grfico de linearizao de Lineweaver-Burk

[ ]

Figura 8: Equao utilizada para o clculo de KM e VMX,

Os valores de KM e VMX, foram iguais, respectivamente, a 0,0187 e 0,1089

3.1.3. Determinao de D e Z Aps o submetimento das amostras ao tratamento trmico foi feita a leitura no espectrofotmetro os resultados obtidos esto na Tabela 6. E o comportamento da enzima em funo do tempo e em funo da temperatura est na Figura 9 e 10, respectivamente.
Tabela 4: Mdia da absorbncia.

Tubo 1 2 3 4 5 6

Mdia de absorbncia 0,0204 0,0147 0,0094 0,0739 0,0803 0,0731

0.025 0.02 UA/mim 0.015 0.01 0.005 0 0.0 5.0 Tempo (mim) Figura 9: Determinao de D (absorbncia em funo do tempo, temperatura constante.) 100 80 UA/mim 60 40 20 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Temperatura (C) Figura 10: Determinao de Z (absorbncia em funo da temperatura, a tempo constante.) y = -276.84x + 91.112 R = 0.8291 10.0 y = -0.0009x + 0.0178 R = 0.7688

A partir das equaes da reta, pode-se ento calcular os valores de D e Z.

No clculo de D foi obtido o seguinte resultado:

E no clculo de D foi obtido o seguinte resultado:

A partir dos resultados obtidos foi possvel concluir que o tratamento trmico a 62,04C e a 0,17 minutos houve uma reduo de 90% na atividade enzimtica. E que tambm quanto maior a temperatura maior o inativao enzimtica.

4. REFERNCIAS BRITO, A.K.; SATO, H.H.; SPIRONELLO, A.; SIQUEIRA, W.J. Caractersticas da atividade da peroxidase de abacaxis (Ananas comosus (L.) Merrill) da cultivar IAC Gomo-de-mel e do clone IAC-1. Cincia e Tecnologia de Alimentos,
Campinas, v. 25, n. 4, 2005

COHEN, K.O.; ALVES, S.M. Sistema de produo do aa: Processamento embalagens e concervao. Belm, PA: EMBRAPA. 2. ed. 2006 LEHNINGER, A.L.; et al.. Enzimas. Princpios de bioqumica. 4. ed. So Paulo: Sarvier, 2006, p.: 189-222 MAGALHES, M.M.A. Estudo cintico da inativao trmica de enzimas termorresistentes, com ou sem adio de sacarose na polpa de mamo formosa (Carica papaua L.) acidificada e o estabelecimentodo

processamento trmico requerido. 1992. 166 f. Tese (Doutorado em Cincia e Tecnologia e Alimentos) Universidade Estadual de Campinas MENEZES, E.M.S.; ROSENTHAL, A.; SRUR, A.S.; CAMARGO, L.; CALADO, V.; SANTOS, A. Efeito da alta presso hidrosttica na atividade de enzimas da polpa de aa. Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 28, 2008 ROGEZ, H. Aa: preparo, composio e melhoramento da conservao. Belm: UFPA, 2000. 313p.