Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde Departamento de Nutrição Disciplina de Bioquímica dos Alimentos

ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO POR POLIFENOLOXIDASE(PFO)

Discentes: Ana Gabriella Costa Lemos da Silva Hoziana Cunha de Medeiros Ramon Morais Lopes

Docente: Nély Holland

Natal/RN 2010.2

A fenolase ou a polifenoloxidase catalisa dois tipos de reação: a) Hidroxilação de monofenóis para difenóis. O escurecimento enzimático devido à PFO é de importância comercial particularmente em tecidos vegetais. A polifenoloxidase contém o cobre como produto prostético. descascamento e contusão são suficientes para causa escurecimento enzimático. .1 – INTRODUÇÃO No escurecimento enzimático. que por sua vez polimerizam-se rapidamente para formar pigmentos marrons de melaninas. podendo este ser removido. A exposição das superfícies de frutas e vegetais cortados ao ar resultam em rápido escurecimento devido à oxidação enzimática dos compostos fenólicos presentes para ortoquinonas. etc) são ativas somente nos primeiros passos da reação. ácido clorogênico. ascorbato oxidase. ácido protocatechico. As reações que seguem as oxidações enzimáticas não são enzimáticas. na conversão de fenol. monofenol ou terosinase. referida como atividade de catecolase ou polifenoloxidase. b) Oxidação de difenóis para ortoquinona. o substrato fenólico é oxidado e o oxigênio serve como aceptor de hidrogênio. referido como fenol hidrolase ou cresolase. operações como corte. Na reação catalisada PFO. lipoxidase. Normalmente. as oxidases (polifenoloxidase. tornando a enzima inativa. os substratos fenólicos naturais (ácido caféico. Assim. etc) estão separados da PFO em tecidos intactos e o escurecimento não ocorre. enediol ou grupos funcionais dienos conjugados para compostos carbonilas ativos.

25%.5%. A partir de soluções de ácido ascórbico 0.1%.02%. em liquidificador com 300 ml de água destilada. Foram adicionados também 0.Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0. inclusive a 0. como amostra: batata.2% em tampão fosfato 0.2 – OBJETIVOS Inativar termicamente a polifenoloxidase (método do branqueamento). Em seguida cada amostra foi resfriada em água fria e homogeneizada.05 M pH 6.1.0 e em seguida adicionados 0.2% em tampão fosfato 0. nos 5 tubos de ensaio. maçã e berinjela. 0.05% e 0.05M pH 6. 3.2 . O processo foi seguido com as três amostras seguintes. ácido cítrico. verificar o efeito do ácido ascórbico e do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase e verificar o efeito do ácido ascórbico. 0. as quais foram adicionadas. banana.Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) No procedimento foram utilizados os seguintes componentes.5 de amostra obtida anteriormente. para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor. Os tubos de ensaio foram encubados em banho-maria termostatizado a 40 °c durante 20 minutos. Foram pipetados 4 ml de catecol 0. Foram adicionadas 30 g de batata em água fervente por 1 minuto e outras 30 g por 2 minutos. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela.5 ml de água destilada e 0. para que em seguida a coloração obtida pudesse ser observada.0 em 5 tubos de ensaio. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0. respectivamente. .5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos. 3 – METODOLOGIA 3.5%.

Efeito do ácido ascórbico. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela Foram preparadas 30 ml de solução de ácido ascórbico a 0. . 0.7 cm de espessura e foi colocada uma fatia sobre cada placa de Petri. bissulfito de sódio a 0.2% em tampão fosfato 0.5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0. inclusive a 0. para que em seguida fossem observadas suas colorações diante de cada solução. 0.5%.02% e cloreto de sódio a 1. A partir de soluções de bissulfito de sódio 0. 30 ml de cada concentração foram colocadas em placas de Petri numeradas. As amostras foram trituradas com bastão de vidro em suas respectivas placas. ácido cítrico.5%.5%. 0.05M pH 6.05% e 0.05% e 0.0%.0% e 0. Uma berinjela foi descascada e cortada em fatias de 0. ácido cítrico a 0. as quais foram adicionadas.25%.1%. 0.5% e 1.3 .4 .25%.02%.Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0.0 em 5 tubos de ensaio.1%. 3. para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor.5%.3.5%. 0. nos 5 tubos de ensaio. Foram adicionados também 0.

Consiste na promoção de um choque térmico no alimento. onde esse é exposto à água em temperatura de pré-fervura e em seguida exposto a uma baixa temperatura. catecol e água destilada ao calor é eficiente para inativar a PPO em apenas 1 minuto. Esse processo inativa a enzima polifenoloxidase (PPO).1. Para inativação do PPO da banana foi necessário 2 minutos na água em temperatura de fervura.4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES 4. concluise isso pela ausência de cor do líquido. as quais são responsáveis pelo escurecimento das frutas. uma vez que a exposição da mesma a altas temperaturas pode causar mudanças na sua forma dimensional (desnaturação) tirando sua capacidade de catalisar reações de oxidação dos compostos fenólicos.Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) A mudança de cor de acordo com tempo em que as amostras foram imersas em água fervente pode ser observada na tabela 1. Tabela 1: Mudança de cor das amostras de acordo com o tempo de imersão em água fervente PFO Batata Banana Maça Berinjela 1 minuto ++ ++ 2 minutos + Legenda: .: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de intensidade leve O branqueamento é um processo bastante utilizado na indústria de alimentos. O resultado mostrou que o a exposição da mistura contendo extrato da batata. pois ao fim desse tempo a .

02% + ++ + ++ +++ + ++ + ++ PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: . a exposição da mistura contendo catecol. Tabela 2: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de ácido ascórbico Ácido ascórbico 0. Isso indica que a enzima não foi inativada e desenvolveu sua atividade catalítica da oxidação dos fenóis.2 .10% 0. água destilada e extrato de berinjela à água em temperatura fervente durante 1 e 2 minutos não foi suficiente para inativar a enzima PPO. a mistura gerou respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade média e marrom de intensidade leve. pois o resultado foi um líquido incolor. gerando escurecimento.mistura contendo catecol.25% 0. Assim como na batata. água destilada e estrato de maçã durante 1 minuto foi o suficiente para inativar a enzima PPO.05% 0. A exposição da mistura contendo catecol. água destilada e extrato de banana gerou uma solução incolor.: incolor +: marrom de intensidade muito leve .Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de ácido ascórbico pode ser observada na tabela 2. 4. A exposição da mesma mistura durante 1 minuto na água em temperatura de fervura resultou em um líquido de cor classificada como marrom de intensidade média.50% 0. indicando que houve atividade enzimática de escurecimento realizado pela PPO.

a mínima concentração do ácido ascórbico capaz de não permitir a reação de escurecimento enzimático é igual a 0. sendo assim a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenóis não será iniciada e as frutas permanecerão com a cor de colheita por um bom tempo.Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de bissulfito de sódio pode ser observada na tabela 3. . conhecido popularmente por Vitamina C. essa ação favorece a inibição da atividade da polifenoloxidase. Outra ação desse ácido é a sua capacidade de diminuir o pH do meio. impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas. Como se pode perceber através da análise da tabela 2. a qual tem máxima atividade por volta de pH 6.3 .++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária O ácido ascórbico é um potente antioxidante que atua de duas formas na manutenção das cores naturais das frutas. atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior.10%.10% foi responsável por uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. 4. Para a banana a mínima concentração foi 0. Já na banana a concentração de 0.25%. Essa mínima concentração permaneceu para manutenção da cor de colheita da maçã e da berinjela. A propriedade já citada desse ácido. isso indica que essa concentração não foi capaz de inibir a reação de escurecimento. responsáveis pela coloração amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados.

pela análise da tabela 3.10% 0.Tabela 3: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de bissulfito de sódio Bissulfito sódio 0. Isso demonstra que ela não foi inativada. não ocorrendo o escurecimento enzimático. Ou seja. A menor concentração desse composto responsável pela inativação da polifenoloxidase foi igual a 0. Ela também atua revertendo a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenois e reação de oxidação dos orto-difenois em orto-quinonas. maçã e berinjela. o bissulfito tem a capacidade de reverter. o cobre.02% para batata. Essa alta eficácia é garantida pela capacidade que esse composto de fórmula NaHSO3 tem de se complexar ao grupo prostético da enzima polifenoloxidase. Essa mesma concentração usada na banana gerou uma coloração classificada como marrom de intensidade leve.: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária Comparando a ação do bissulfito sobre a conservação da coloração natural dos frutos com a ação do acído ascórbico.5% 0. Para que a inativação ocorrese foi necessário uma mínima concentração de 0. podemos perceber. que aquele é mais eficaz. .25% 0.10%. mesmo se o escurecimento tiver sido iniciado e estiver nas fazes citadas.05% 0.02% ++ + +++ ++ ++ de PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: . Quando isso ocorre essa enzima perde sua capacidade de hidroxilação dos fenois.

Apesar dos resultados bastante efetivos na inativação da polifenoloxidase. cítrico 0.1% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.5% RESULTADO ++++++ ++ +++ ++++ + + ++ +++++ ++++ Legenda: -: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de iIntensidade leve +++: marrom de intensidade intermediária . ácido cítrico.Efeito do ácido ascórbico.0% Berinjela + 30 mL ác. bissulfito de sódio e cloreto de sódio pode ser observada na tabela 4. o bissulfito de sódio tem seu uso limitado pela legislação por ser tóxico e seu resíduo causar vários problemas ambientais (Oga. 1996). ascórbico 0.5% Berinjela + 30 mL ác. bissulfito de sódio e cloreto de sódio PLACAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AMOSTRA Berinjela + 30 mL água Berinjela + 30 mL ác. ácido cítrico. 4.05% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. Tabela 4: Mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela A mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico. ácido cítrico.4 .5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.25% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.0% Berinjela + 30 mL NaCl 0. cítrico 1.02% Berinjela + 30 mL NaCl 1.

As concentrações 0. 1999).1% e 0. formando sulfonatos sem coloração. ou reduzindo-os aos fenóis precursores (WONG.25% e 0. Exemplos de acidulantes que podem inibir o escurecimento enzimático são os ácidos cítrico. Segundo Macedo (2005) as polifenoiloxidases são enzimas que possuem os íons Cu2+. As concentrações 0.05% e 0. No entanto. 1988. 1995. 1998). indicando a inativação da enzima. 1990). o ácido cítrico não foi um bom inibidor do escurecimento enzimático nas concentrações 0. Na prática experimental foi utilizado o ácido cítrico que age de duas formas para o cancelamento do escurecimento enzimático. WALKER e FERRAR. Na prática experimental a melhor concentração para inativação da polifenoloxidase foi 0.5% e 1. para a prática experimental. ARAÚJO.5% garantiram uma coloração para o líquido que circundava a berinjela classificado como marrom de intensidade muito leve e a concentração 0. pois o resultado foi um líquido classificado como incolor.05%. os mesmos apresentaram respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade forte e marrom de intensidade intermediária. . que resulta em um líquido incolor. No entanto na literatura os resultados para essa prática não são coerentes com esse resultado.1% geraram uma líquido incolor. málico e fosfórico (ZEMEL et all. O bissulfito de sódio pode agir diretamente nas enzimas pela diminuição do número de pontes dissulfeto no centro catalítico (SAYAVEDRA-SOTO e MONTGOMERY.++++: marrom de intensidade forte +++++: marrom de intensidade muito forte ++++++: marrom super intenso Agentes acidulantes são freqüentemente usados para manter o pH do meio mais baixo que o pH ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos. A remoção desses íons do sítio ativo por quelação inativa a enzima. Ele pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase.0%. normalmente com o aumento da concentração do bissulfito de sódio ocorre diminuição da atividade da polifenoloxidase. ou nos compostos de reação. com isso pode se concluir que o aumento da concentração desse ácido provoca diminuição da atuação da polifenoloxidase da berinjela.02 uma cor marrom de iIntensidade leve.

a enzima foi obtida através do extrato de berinjela. também apresenta ação redutora. no entanto ela ainda se processa e na prática experimental a imersão da berinjela em água destilada resultou na coloração mais intensa do estudo. no segundo a mesma concentração promoveu uma coloração classificada como marrom de iIntensidade leve. complexando o cobre do grupo prostético da PPO. . ou vitamina C. Isso indica a fraca ação do NaCl para o bloqueio dessa reação. isso pode ter resultado em uma melhor extração da polifenoloxidase. Juntamente com seus sais neutros compõe um dos principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reações oxidativas de duas maneiras: (1) agindo diretamente na enzima. onde as únicas enzimas que estavam agindo eram provenientes da superfície do tecido vegetal que tinha sido cortado da berinjela. O ácido ascórbico foi usado na presente prática experimental para inativação da polifenoloxidase da berinjela em dois momentos. podendo agir com maior eficácia. O NaCl não apresentou um bom resultado para o bloqueio da reação de escurecimento enzimático. causando sua inibição. Esse fato pode ser explicado por duas causas. (2) reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenóis. além da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato. A concentração de 0. que ficou em maior concentração.5% resultou em um líquido incolor.A imersão do tecido vegetal em água após injúria mecânica ou corte faz com que a reação de escurecimento enzimático não seja realizada. é preciso o oxigênio. pois para ela ocorrer é necessário. 1998). Na água a concentração do O2 é muito limitada quando comparada com a concentração do ar. quando comparado com o segundo experimento. no primeiro a concentração de 0.1% gerou uma coloração marrom de intensidade muito forte. por esse motivo na água a reação de escurecimento enzimática é mais lenta. além de atribuir valor nutricional aos alimentos. a qual foi classificada como marrom super intenso. O ácido ascórbico.05% foi responsável pela coloração do líquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentração 0. impedindo a formação dos pigmentos escuros (SAPERS e MILLER. no primeiro experimento contendo ácido ascórbico e berinjela. já que grupos diferentes realizaram os experimentos. Outro motivo pode ter sido advindo de erros na legenda. os compostos fenóis.

n. p. G. v. and sulfur dioxide on color of dried apples. 3. 319-329. M. temperature. Estudo das atividades de peroxidades e polifenoloxidase de guariroba (Syagrus oleracea Becc) sob a ação de diferentes inibidores. p.SAYAVEDRA-SOTO. M. p. A.. . 405-440. Food Sci. n. MONTGOMERY..LUPETTI. p. 372. 2005.. Goiás: Acta Scientiarum: Biological Sciences. Análise da imagem em química analítica: empregando metodologias simples e didáticas para entender e prevenir o escurecimento de tecidos vegetais. v. Food Sci. Química de los alimentos: mecanismos e teoria.1998. parte 5. Response contour diagrams to describe effects of moisture. L.OGA. Zaragoza: Acríbia. In: Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Atheneu. 2003. 6 .ARAÚJO. 1988. 1999. 1995. Browning inhibition in fresh-cut pears. W. 2. 4 . 365. J. J. Química de alimentos: teoria e prática. p. M. L. A. 2. 643-644. 53.WONG.. ed. storage. 63. W.SAPERS. MILLER. 2. R. S. D.REFERÊNCIAS 1 . São Paulo: Química Nova. J. 7 . 5 . Karina et al. 233-236. Cristine et al. Viçosa: UFV. 2 – CARNEIRO. 1996. S. 342-346. Aditivos alimentares.

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