Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde Departamento de Nutrição Disciplina de Bioquímica dos Alimentos

ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO POR POLIFENOLOXIDASE(PFO)

Discentes: Ana Gabriella Costa Lemos da Silva Hoziana Cunha de Medeiros Ramon Morais Lopes

Docente: Nély Holland

Natal/RN 2010.2

operações como corte. descascamento e contusão são suficientes para causa escurecimento enzimático. As reações que seguem as oxidações enzimáticas não são enzimáticas. na conversão de fenol. O escurecimento enzimático devido à PFO é de importância comercial particularmente em tecidos vegetais. A exposição das superfícies de frutas e vegetais cortados ao ar resultam em rápido escurecimento devido à oxidação enzimática dos compostos fenólicos presentes para ortoquinonas. etc) são ativas somente nos primeiros passos da reação. lipoxidase. referido como fenol hidrolase ou cresolase. referida como atividade de catecolase ou polifenoloxidase. o substrato fenólico é oxidado e o oxigênio serve como aceptor de hidrogênio. A polifenoloxidase contém o cobre como produto prostético. Na reação catalisada PFO. . etc) estão separados da PFO em tecidos intactos e o escurecimento não ocorre. ascorbato oxidase. enediol ou grupos funcionais dienos conjugados para compostos carbonilas ativos. que por sua vez polimerizam-se rapidamente para formar pigmentos marrons de melaninas. as oxidases (polifenoloxidase. A fenolase ou a polifenoloxidase catalisa dois tipos de reação: a) Hidroxilação de monofenóis para difenóis. ácido clorogênico. b) Oxidação de difenóis para ortoquinona. ácido protocatechico. Normalmente. Assim. podendo este ser removido. tornando a enzima inativa. os substratos fenólicos naturais (ácido caféico.1 – INTRODUÇÃO No escurecimento enzimático. monofenol ou terosinase.

Foram pipetados 4 ml de catecol 0.5 de amostra obtida anteriormente. as quais foram adicionadas.2 . para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor. ácido cítrico.5 ml de água destilada e 0.05 M pH 6. verificar o efeito do ácido ascórbico e do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase e verificar o efeito do ácido ascórbico.2% em tampão fosfato 0. para que em seguida a coloração obtida pudesse ser observada.0 e em seguida adicionados 0. Os tubos de ensaio foram encubados em banho-maria termostatizado a 40 °c durante 20 minutos.Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0. Foram adicionados também 0.2% em tampão fosfato 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela. 0.25%.2 – OBJETIVOS Inativar termicamente a polifenoloxidase (método do branqueamento). 3 – METODOLOGIA 3. respectivamente. Foram adicionadas 30 g de batata em água fervente por 1 minuto e outras 30 g por 2 minutos.05M pH 6. 3.Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) No procedimento foram utilizados os seguintes componentes.1%. como amostra: batata.05% e 0.5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos. inclusive a 0. Em seguida cada amostra foi resfriada em água fria e homogeneizada.0 em 5 tubos de ensaio. banana.1. . A partir de soluções de ácido ascórbico 0. nos 5 tubos de ensaio. O processo foi seguido com as três amostras seguintes.02%.5%. maçã e berinjela. em liquidificador com 300 ml de água destilada. 0.5%. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0.

para que em seguida fossem observadas suas colorações diante de cada solução.0%.02%.2% em tampão fosfato 0. As amostras foram trituradas com bastão de vidro em suas respectivas placas. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0.05% e 0.3 .5%. as quais foram adicionadas.5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos. nos 5 tubos de ensaio.02% e cloreto de sódio a 1.Efeito do ácido ascórbico.4 .05M pH 6. 0. 0.1%.1%.5%. 0.05% e 0. inclusive a 0. 0.25%. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela Foram preparadas 30 ml de solução de ácido ascórbico a 0. A partir de soluções de bissulfito de sódio 0. para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor.7 cm de espessura e foi colocada uma fatia sobre cada placa de Petri. Uma berinjela foi descascada e cortada em fatias de 0.Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0.5%.0 em 5 tubos de ensaio. 3.25%. Foram adicionados também 0. ácido cítrico. bissulfito de sódio a 0. .5% e 1. 0.0% e 0. 30 ml de cada concentração foram colocadas em placas de Petri numeradas. ácido cítrico a 0.3.5%.5%.

: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de intensidade leve O branqueamento é um processo bastante utilizado na indústria de alimentos. Esse processo inativa a enzima polifenoloxidase (PPO).1. catecol e água destilada ao calor é eficiente para inativar a PPO em apenas 1 minuto. concluise isso pela ausência de cor do líquido.Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) A mudança de cor de acordo com tempo em que as amostras foram imersas em água fervente pode ser observada na tabela 1. O resultado mostrou que o a exposição da mistura contendo extrato da batata. as quais são responsáveis pelo escurecimento das frutas.4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES 4. uma vez que a exposição da mesma a altas temperaturas pode causar mudanças na sua forma dimensional (desnaturação) tirando sua capacidade de catalisar reações de oxidação dos compostos fenólicos. Tabela 1: Mudança de cor das amostras de acordo com o tempo de imersão em água fervente PFO Batata Banana Maça Berinjela 1 minuto ++ ++ 2 minutos + Legenda: . Para inativação do PPO da banana foi necessário 2 minutos na água em temperatura de fervura. pois ao fim desse tempo a . onde esse é exposto à água em temperatura de pré-fervura e em seguida exposto a uma baixa temperatura. Consiste na promoção de um choque térmico no alimento.

10% 0.mistura contendo catecol.50% 0. água destilada e extrato de banana gerou uma solução incolor. gerando escurecimento. a exposição da mistura contendo catecol.02% + ++ + ++ +++ + ++ + ++ PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: .: incolor +: marrom de intensidade muito leve . A exposição da mesma mistura durante 1 minuto na água em temperatura de fervura resultou em um líquido de cor classificada como marrom de intensidade média. água destilada e estrato de maçã durante 1 minuto foi o suficiente para inativar a enzima PPO. a mistura gerou respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade média e marrom de intensidade leve.Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de ácido ascórbico pode ser observada na tabela 2. pois o resultado foi um líquido incolor. 4. A exposição da mistura contendo catecol. Assim como na batata.05% 0. Isso indica que a enzima não foi inativada e desenvolveu sua atividade catalítica da oxidação dos fenóis. indicando que houve atividade enzimática de escurecimento realizado pela PPO.2 . Tabela 2: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de ácido ascórbico Ácido ascórbico 0. água destilada e extrato de berinjela à água em temperatura fervente durante 1 e 2 minutos não foi suficiente para inativar a enzima PPO.25% 0.

Para a banana a mínima concentração foi 0.25%.Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de bissulfito de sódio pode ser observada na tabela 3.10%. essa ação favorece a inibição da atividade da polifenoloxidase. impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas. . Essa mínima concentração permaneceu para manutenção da cor de colheita da maçã e da berinjela. a qual tem máxima atividade por volta de pH 6. Já na banana a concentração de 0. responsáveis pela coloração amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados. atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior. a mínima concentração do ácido ascórbico capaz de não permitir a reação de escurecimento enzimático é igual a 0. Como se pode perceber através da análise da tabela 2.++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária O ácido ascórbico é um potente antioxidante que atua de duas formas na manutenção das cores naturais das frutas. 4. isso indica que essa concentração não foi capaz de inibir a reação de escurecimento. Outra ação desse ácido é a sua capacidade de diminuir o pH do meio.3 . sendo assim a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenóis não será iniciada e as frutas permanecerão com a cor de colheita por um bom tempo.10% foi responsável por uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. A propriedade já citada desse ácido. conhecido popularmente por Vitamina C.

02% para batata.Tabela 3: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de bissulfito de sódio Bissulfito sódio 0.10%. . Para que a inativação ocorrese foi necessário uma mínima concentração de 0. Essa mesma concentração usada na banana gerou uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. Ou seja.: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária Comparando a ação do bissulfito sobre a conservação da coloração natural dos frutos com a ação do acído ascórbico. A menor concentração desse composto responsável pela inativação da polifenoloxidase foi igual a 0. mesmo se o escurecimento tiver sido iniciado e estiver nas fazes citadas. pela análise da tabela 3. o cobre. maçã e berinjela. Isso demonstra que ela não foi inativada.10% 0.25% 0. Quando isso ocorre essa enzima perde sua capacidade de hidroxilação dos fenois.02% ++ + +++ ++ ++ de PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: . não ocorrendo o escurecimento enzimático.5% 0. o bissulfito tem a capacidade de reverter. Essa alta eficácia é garantida pela capacidade que esse composto de fórmula NaHSO3 tem de se complexar ao grupo prostético da enzima polifenoloxidase.05% 0. Ela também atua revertendo a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenois e reação de oxidação dos orto-difenois em orto-quinonas. que aquele é mais eficaz. podemos perceber.

5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. Tabela 4: Mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico. ácido cítrico. o bissulfito de sódio tem seu uso limitado pela legislação por ser tóxico e seu resíduo causar vários problemas ambientais (Oga.05% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. cítrico 1. cítrico 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela A mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico.5% RESULTADO ++++++ ++ +++ ++++ + + ++ +++++ ++++ Legenda: -: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de iIntensidade leve +++: marrom de intensidade intermediária . ácido cítrico.5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.0% Berinjela + 30 mL ác.5% Berinjela + 30 mL ác.0% Berinjela + 30 mL NaCl 0.02% Berinjela + 30 mL NaCl 1.1% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.25% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. 4. ácido cítrico. ascórbico 0.Efeito do ácido ascórbico.Apesar dos resultados bastante efetivos na inativação da polifenoloxidase. bissulfito de sódio e cloreto de sódio pode ser observada na tabela 4.4 . bissulfito de sódio e cloreto de sódio PLACAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AMOSTRA Berinjela + 30 mL água Berinjela + 30 mL ác. 1996).

formando sulfonatos sem coloração. O bissulfito de sódio pode agir diretamente nas enzimas pela diminuição do número de pontes dissulfeto no centro catalítico (SAYAVEDRA-SOTO e MONTGOMERY. normalmente com o aumento da concentração do bissulfito de sódio ocorre diminuição da atividade da polifenoloxidase.0%.25% e 0. para a prática experimental. Na prática experimental a melhor concentração para inativação da polifenoloxidase foi 0. 1999).1% e 0.++++: marrom de intensidade forte +++++: marrom de intensidade muito forte ++++++: marrom super intenso Agentes acidulantes são freqüentemente usados para manter o pH do meio mais baixo que o pH ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos.5% e 1. Ele pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase.1% geraram uma líquido incolor.05%. o ácido cítrico não foi um bom inibidor do escurecimento enzimático nas concentrações 0. ou reduzindo-os aos fenóis precursores (WONG.02 uma cor marrom de iIntensidade leve. No entanto na literatura os resultados para essa prática não são coerentes com esse resultado. Segundo Macedo (2005) as polifenoiloxidases são enzimas que possuem os íons Cu2+. ARAÚJO. pois o resultado foi um líquido classificado como incolor. com isso pode se concluir que o aumento da concentração desse ácido provoca diminuição da atuação da polifenoloxidase da berinjela. No entanto. Exemplos de acidulantes que podem inibir o escurecimento enzimático são os ácidos cítrico. As concentrações 0. indicando a inativação da enzima. 1995.05% e 0. que resulta em um líquido incolor. Na prática experimental foi utilizado o ácido cítrico que age de duas formas para o cancelamento do escurecimento enzimático. 1990). 1988. os mesmos apresentaram respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade forte e marrom de intensidade intermediária. As concentrações 0. ou nos compostos de reação. A remoção desses íons do sítio ativo por quelação inativa a enzima. málico e fosfórico (ZEMEL et all.5% garantiram uma coloração para o líquido que circundava a berinjela classificado como marrom de intensidade muito leve e a concentração 0. WALKER e FERRAR. 1998). .

onde as únicas enzimas que estavam agindo eram provenientes da superfície do tecido vegetal que tinha sido cortado da berinjela. no primeiro experimento contendo ácido ascórbico e berinjela. O ácido ascórbico foi usado na presente prática experimental para inativação da polifenoloxidase da berinjela em dois momentos. O ácido ascórbico. pois para ela ocorrer é necessário. isso pode ter resultado em uma melhor extração da polifenoloxidase. . causando sua inibição. podendo agir com maior eficácia. a qual foi classificada como marrom super intenso.5% resultou em um líquido incolor. além da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato. impedindo a formação dos pigmentos escuros (SAPERS e MILLER. no segundo a mesma concentração promoveu uma coloração classificada como marrom de iIntensidade leve. a enzima foi obtida através do extrato de berinjela. Na água a concentração do O2 é muito limitada quando comparada com a concentração do ar. que ficou em maior concentração. no entanto ela ainda se processa e na prática experimental a imersão da berinjela em água destilada resultou na coloração mais intensa do estudo.A imersão do tecido vegetal em água após injúria mecânica ou corte faz com que a reação de escurecimento enzimático não seja realizada. ou vitamina C. além de atribuir valor nutricional aos alimentos.1% gerou uma coloração marrom de intensidade muito forte. A concentração de 0. é preciso o oxigênio. já que grupos diferentes realizaram os experimentos. O NaCl não apresentou um bom resultado para o bloqueio da reação de escurecimento enzimático. Esse fato pode ser explicado por duas causas.05% foi responsável pela coloração do líquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentração 0. 1998). (2) reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenóis. no primeiro a concentração de 0. Juntamente com seus sais neutros compõe um dos principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reações oxidativas de duas maneiras: (1) agindo diretamente na enzima. quando comparado com o segundo experimento. também apresenta ação redutora. por esse motivo na água a reação de escurecimento enzimática é mais lenta. Isso indica a fraca ação do NaCl para o bloqueio dessa reação. complexando o cobre do grupo prostético da PPO. Outro motivo pode ter sido advindo de erros na legenda. os compostos fenóis.

S. São Paulo: Química Nova. 7 .SAYAVEDRA-SOTO. n. 2. Goiás: Acta Scientiarum: Biological Sciences. 2005.WONG. Análise da imagem em química analítica: empregando metodologias simples e didáticas para entender e prevenir o escurecimento de tecidos vegetais. ed.OGA. 4 . p. 2003. D. v. 1999. Food Sci. p. p. temperature. MONTGOMERY. storage.1998. In: Fundamentos de toxicologia. A. M. Química de los alimentos: mecanismos e teoria. 2 – CARNEIRO. S. G. Cristine et al. Aditivos alimentares. 1988. 405-440. Karina et al.. L.SAPERS. São Paulo: Atheneu. 365. p.. 53. 63. J. J. W.. and sulfur dioxide on color of dried apples. Food Sci.LUPETTI. Response contour diagrams to describe effects of moisture. 1995. 3.REFERÊNCIAS 1 . J. L. n. 1996.ARAÚJO. 342-346. MILLER. M. Browning inhibition in fresh-cut pears. 372. M. . Química de alimentos: teoria e prática. Zaragoza: Acríbia. W. 233-236. 2. p. 319-329. parte 5. 5 . Viçosa: UFV. A. 2.. 6 . v. 643-644. R. Estudo das atividades de peroxidades e polifenoloxidase de guariroba (Syagrus oleracea Becc) sob a ação de diferentes inibidores.

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