Introduo

A tcnica de colorao de Gram uma tcnica de colorao diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactrias por microscopia ptica. Foi descoberta pelo fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve com a colorao realizada uma melhor visualizao das bactrias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactrias coravam com este mtodo o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importncia ao seu mtodo de colorao. Actualmente, esta tcnica fundamental para a taxonomia e identificao das bactrias, sendo utilizada como tcnica de rotina em laboratrios de bacteriologia.

Desenvolvimento
1.1- A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas seguinte sequncia: Corante primrio violeta de cristal: cora o citoplasma de prpura, independentemente do tipo de clula. Mordente soluo de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Agente descolorante lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico. Contrastante safranina ou fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho. O que se verifica, quando se observam as diferentes bactrias sujeitas a esta colorao ao microscpio, que estas tm um comportamento diferente face colorao de Gram, o que permite classific-las em:

Bactrias Gram-positivo (apresentam cor prpura)

Bactrias Gram-negativo (apresentam cor vermelha)

1.2- Diferenas entre as bactrias gran-positivas e as de gran negativas.

Estudos de microscopia electrnica e anlises bioqumicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana a estrutura responsvel pelo diferente comportamento das bactrias colorao de Gram. As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e predominantemente constituda por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel que se forma por aco do mordente, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (prpura).

As bactrias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm peptidoglicano e que mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolvel, que se forma por aco do mordente, removido (camada de peptidoglicano mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as clulas ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.

Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptidoglicano, a responsvel pelo diferente comportamento das bactrias face colorao de Gram.

1.3- Peptidoglicano
O peptidoglicano um heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por cadeias lineares de dois acares aminados NAG (cido n-acetilglucosamina) e NAM (cido nacetilmurmico) ligados entre si por ligaes glicosdicas. As cadeias lineares ligam-se entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos

1.4- Coloraao de Gram

A tcnica consiste basicamente nas seguintes etapas: 1. Preparar uma lmina de vidro com uma fina camada de bactrias fixa (esfregao); 2. Cobrir o esfregao com cristal violeta por 1 minuto. Enxaguar em gua corrente; 3. Cobrir com lugol por 1 minuto. Enxaguar em gua corrente; 4. Descorar com soluo de lcool-acetona por 30 segundos. Enxaguar em gua corrente; 5. Contra-corar com safranina (ou fucsina) por 30 segundos. Enxaguar em gua corrente. 6. Deixar secar ao ar. Uma bactria dita Gram negativa quando sua parede celular incapaz de reter o corante cristal violeta, sendo corada somente pela safranina ou fucsina, que empresta sua colorao rosa s bactrias.

J uma bactria do tipo Gram positiva possui uma parede celular capaz de reter o cristal violeta, e por isso adquire colorao roxa ao microscpio. Veja no esquema abaixo os passos da colorao e o que acontece a nvel microscpico:

A figura abaixo mostra exemplos de bactrias, como so vistas ao microscpio, aps sofrerem a colorao de Gram:

A colorao de Gram se baseia em algumas diferenas estruturais existentes entre a parede celular de uma bactria Gram negativa e de uma Gram positiva. A principal delas que a parede celular de uma bactria Gram positiva, embora mais espessa, quimicamente mais simples, ou seja, apresenta predominantemente um nico tipo de macromolcula (90% peptidioglicano). Veja figura abaixo:

J a parede celular de uma bactria Gram negativa mais complexa. formada por uma ou poucas camadas de peptidioglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espao periplsmico, contendo uma srie de enzimas e protenas. Enquanto nas Gram positivas o peptidioglicano representa de 15 a 50% da massa seca da clula, nas Gram negativas ele representa no mximo 5%. Essas informaes so importantes, pois a quantidade de interligaes existentes entre as cadeias de peptidioglicano e o comprimento dessas cadeias que determinar a forma da clula, e conseqentemente, a forma da bactria.Tanto as Gram positivas quanto as Gram negativas possuem, no entanto, uma caracterstica em comum: suas membranas so constitudas de uma bicamada fosfolipdica

Concluso
Coclumos que a tcnica de colorao de gran uma tcnica ultilizada para destinguer os di grande s gropos de bactria, ultilizada a mais de de 100 anos em laboratrio mdicos. No so vimos que exitem mtodos apropriados para executar esta tcnica, que tem sido til em exames para destinguir as doenas bacteriana.

Bibliografia