HIBRIDOMA DON.

3: ANTICORPO MONOCLONAL PARA CONFECO DE COLUNA DE IMUNOAFINIDADE ANTI-DON Joice Sifuentes dos Santos (1), Simone Fujii (1), Luciana Hayashi (1), Elisabete Yurie Sataque Ono (2), Eiko Nakagawa Itano (3), Osamu Kawamura (4), Elisa Yoko Hirooka (1) (1) Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Cincia e Tecnologia de Alimentos, Londrina PR, CEP: 86051-990 Caixa Postal: 6001 E-mail: joicess@msn.com, elisahirooka@hotmail.com, (2) Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Bioqumica e Biotecnologia, Londrina PR. E-mail: eysono@uel.br, (3) Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Cincias Patolgicas, Londrina PR. E-mail: itanoeiko@hotmail.com, (4) Kagawa University, Faculty of Agriculture, Department of Biochemistry and Food Science, Ikenobe, Miki-cho, Kita-gun, Kagawa, Japan, 761-0765, Phone: 81-87-891-3021, E-mail:kawamura@ag.kagawa-u.ac.jp. A produo de imunorreagentes essencial para reduzir dependncia de kits importados no controle de qualidade de micotoxinas. A confeco de coluna de imunoafinidade para a deteco de deoxinivalenol (DON), tricoteceno citotxico de ocorrncia relevante em trigo, est em andamento, empregando hibridoma DON.3 fornecido por intercmbio japons, para suprir anticorpo monoclonal (AcM). As clulas reativadas no meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino (SFB) foram estocadas em alquotas de 0,5 mL (5 x 106 a 2,5 x 107 clulas viveis) em criotubo. A reativao das clulas foi realizada em microplacas (24 orifcios) com adicioo de meio RPMI suplementado com 20% de SFB, e incubao a 37 C (5 % CO2). No dia seguinte a reativao, o contedo celular de cada orifcio foi dividido e adicionado novo meio. No terceiro dia, o contedo dos poos foi reunido, centrifugado e expandido para frascos de 25 cm2. Aps 1 semana, assegurada a viabilidade, prosseguiu-se para a etapa de expanso empregando frascos de 75 cm2 contendo RPMI + 10% SFB. No dcimo quinto dia, iniciou-se a substituio gradual do meio RPMI adicionando 25, 50 e 75 % de meio Hybridoma-SFM (serum free medium, H-SFM) suplementado com 100 U/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina e 2 mM de glutamina. As clulas adaptadas foram cultivadas em frascos de 150 cm2 contendo 100 % de meio H-SFM at saturao celular e removidas por centrifugao. Este sobrenadante foi novamente inoculado com 2,5 a 5 x 104 clulas/mL e mantido sem substituio de meio por 15 dias para saturao celular e morte. O cultivo foi centrifugado (5000 r.p.m., 10 min a 4 C), obtendo-se o sobrenadante, sendo este mantido sob refrigerao para posterior purificao dos anticorpos. Ao trmino de 2 cultivos, foram obtidos 6340 mL de sobrenadante. A concentrao protica foi determinada por absoro a 280 nm, adotando coeficiente de absoro (E280) de 1,35 para IgG. A concentrao mdia de anticorpos obtida foi de 0,15 mg/mL. Apoio: CNPq, CAPES, UGF-SETI-Fundo Paran, Fundao Araucria.