Replicagado do DNA e dos Cromossomos PNT VAT Caracteristicas basicas da replicagao de DNA in vivo ' Replicacéo de DNA em procariotos '» Aspectos especificos da replicacdo de cromossomos eucaridticos Eles sdo idénticos? Desde que Merry ¢ Sherry nasceram, a5 pessoas confundem as dase tem sido assim desde a sua infénciae adolescéncia até a ida adulta. Quando estao separadas, mulLas vezes Merry € cha- mada de Sherry e Sherry & confundida com Merry. Até mesmo 05 pais tém dificuldade em distingu-las. Merry e Sherry sao gémeas ‘monozigéticas("idrtcas"); abas se deserwolveram a partir e ‘um nico ovécitoferilizado. Em um estagio nical da clivagem, 0 embridodivdiu-se em duas massas de clus, cada grupo de cé- {ulas Geu onigem a um embnao compieto. ambos os emnioes de- serwolveram-se normalmente, ,em 7 de abi de 1985, nasceram as duas meninas, uma recebeu o nome Merry ¢a outa, Sherry. (Quatro duplas de gémeos com suas maes na lowa State Far. ‘As pessoas costumam explicar os fenétipos quase idénticos de ‘gémeos monozigéticos como Merry e Sherry dizendo que “eles {én up resus gests”. E Uru que Su HU € verdaUe. Pate set preciso, deve-se dizer que gémeos idénticos contém réplicas dos imesmos genes parentais. Mas esse coloquialismo simples sugere ‘que 2 matora das pessoas realmente acredita que as replicas de tum gene so idénticas. Se 0 genoma humano contém cerca de 20.500 genes, as répicas de todos esses genes s80 exatamente Iguals nos gemeos idénticos? ‘Avida humana origina-se de uma tinicacéula, uma esfera dim ruta com didmetro aproximado de 0,1 mm. Essa céula d origem a centenas de bithoes de outras celulas urante o desenvolvimento fetal. Um ser humano aduito de tamanho médio tem cerca de 65 trithdes (65:000.000.000.000) de células. Com algummas excecses, cada uma dessas células contém uma ré- plica de todos os cerca de 20.500 genes. Além disso, as células do corpo no s80 estaticas; em alguns tecidos, a5 celulas antigas s80 continuamente substituidas por novas células. Por exemplo, as células da medula 6ssea de um individuo sau- vol prodieram cerca do 7 mithtec de hhemacias por minuto. Embora nem todas as réplicas dos genes no corpo humano sejam idénticas, a precessn de plicacan desses genes & muito preciso. Q geno- rma haploide hurmano contém cerca de 2 109 pares do nuclootidias do ONA, que s0 todos duplicados a cada diviséo celular, Neste capitulo, examinaremos 0 mecanismo de replicagSo do DNA, des- tacando os mecanismos que garantem a fidelidade desse proceso,‘Coptuto 10 | Replicacio do DNA e dos Cromossomos 223 Caracteristicas basicas da replicagao de DNA in vivo ‘A replicagao de DNA é semiconservativa, inicia-se em origens tinicas e geralmente é bidirecional a partir de cada origem de replicacéo. Em seres humanos, a sintese de um novo filamento de DNA ocorre na proporcio aproximada de 3.000 nucleo- dios por minuto. Em bactérias, cerca de 30,000 nucleo- tidios sio acrescentados por minuto a uma cadeia de DNA nascente. Sem diivida, € essencial que @ mecanisine celular responsavel pela replicacdo de DNA seja muito rapido, mas é ainda mais importante que seja muito pre- iso. Na verdade, a fidelidade da replicagio de DNA é surpreendente, com uma média de apenas um erro por bilhao de nucteotidios meorporados depors da sintese € da correcio de ertos durante € imediatamente aps a re- plicacao. Assim, a maioria dos genes de gémeos idénticos € realmente idéntica, mas alguns sio modificados por cerros de replicacio © outros tipos de mutacdes (Capitu lo 13). Jf se conhece a maioria das caracteristicas prin- cipais des mecaniema que possiilita a replieagn répica € precisa do DNA, embora ainda haja muitos detalhes moleculares a esclarecer. Assintese de DNA, a exemplo da sintese de RNA (Ca- pitulo 11) e proteinas (Capitulo 12), tem trés etapas: (1) iniciagio da cadeia, (2) extensio ou alongamento da ca deia e (3) finalizacdo da cadeia, Neste © nos préximos dois capitulos, examinamos os mecanismos das trés eta- pas na sintese celular dessas importantes macromolé las. Primeiro, porém, apresentamos algumas caracteristi- ‘cas principais da replicacio de DNA. REPLICACAO SEMICONSERVATIVA. Quando Watson € Crick deduziram a estrutura em due pla hélice do DNA com seu pareamento de bases com- plementares, cles imediatamente reconheceram que a especificidade do pareamento de bases poderia ser 0 fundamento de um mecanismo simples de duplicacao do tanto, 5 semanas depois de seu artigo sobre a cstrutura em dupla hélice do DNA, Watson e Crick pu- blicaram um artigo descrevendo um possivel mecanismo de replicacio da dupla hélice. Eles propuseram que os ois filamentos complementares da dupla hélice se de- senrolam ¢ se separam, ¢ que cada filamento guia ain tese de um novo filamento complementar (Figura 10.1)..A sequéncia de bases em cada filamento parental é usada como molde, e as restricées de pareamento de bases na dlupla hélice determinam a sequéncia de bases no fila- jemto recémrsintetizado. A adenina, por exemplo, no ft lamento parental serve de molde, gracas a seu potencial dle ligacao de hidrogénio, para a incorporacao de timina no filamento complementar nascente. Esse mecanismo «le replicacio do DNA € chamado de replicagdo semiconser- vativa (porque ha conservacio de metade da molécula pa- rental) para distinguilo de outros possiveis mecanismos de replicacio (Figura 102). Na replicacdo conservativa, a dupla hélice parental seria conservada, ¢ uma nova dupla hice seria sintetizada. Na replicagio dispersive, segmen tos de ambos os filaments da molécula de DNA parental seriam conservados € usados como moldes para a sintese Ligagies - de hirogénio — pores Ligacoes covalerres Novos iomentos hols; a ropiagto acts ‘conchida . 2 ° a 1m ictieA 191 Replicacaa comiconcervativa de, DNA Watson @ Crick foram os primeiros a propor esse mecanismo de replicacao de DNA, ‘com base no parcomento de bazes complementares entre of dow fllamentos da dupla hélic. Observe que cada filament parental & conservado e serve de molde para a sintese de um novo filamento complementar; cu seja, asequéncia de bases em cada novo filamento determinada pelos potencais de ligagao de hidrogénio das bases no fllamento parental224 Fundamentos de Genética ‘Semiconeorvativa DNA parental g Primeira gerarao de DNA ino Segunda geracdo de DNASINO sm Ficiina 109 0 tebe pnecuele macaniernne da replicactn de DNA (1) cemicnneanativn, na qual cada fllamentn da Aupla hace parental 6 conservado e guia a sintese de um novo filamento complementar; (2) conseratvo, no qual a dupla hele parental € conservada e guia a sintese de uma nova dupla hice: ¢ (3) dspersivo, ne qual segmentos de cada filamento parental so conservadose gulam a sintese de novos segmentes de fiamentos complementares que, em seguide, 80 unids para formar os novos flaentos-flos. de segmentos complementares que, depois, seriam uni- os para produzir os novos filamentos de DNA. Fm 1958, Matthew Meselson e Franklin Stahl demons: traram que a replicacio do cromossomo de Eicherichia ‘oli é semiconservativa. Mais tarde, em 1962, John Cairns demonstrou que 0 cromossomo de E. coli era um tinico diiplex de DNA. Juntos, os resultados apresentados por Cairns e por Meselson ¢ Stahl mostraram que a replica- Go do DNA em E. coli é semiconservativa. Meselson ¢ Stahl cultivaram células de E, coli durante _muitas geracées em iim meio no qual a isstopa leve, nor ‘al, de nitrogénio, 'N, fora substituido pelo isstopo pesa- do, ®N. As bases purinias€ pirimidimmas no DNA conten ni- trogénio. Portanto, 0 DNA de células cultivadas em m contendo !'N tem maior densidade (massa por unidade de volume) que o DNA de eélulas cultivadas em meio con- tendo ™N. As moléculas de diferentes densidades podem ser separactas por centrifugacio de equilibrio por gradiente de den- sidade, Usando essa técnica. Meselson ¢ Stahl conseguiram Leia aresposte do problema no site ‘ttp:l/gen-io.grupogen.com.br.226 Fundamentos de Genética oh, ‘@ As cébies de Ecol sio cutvadas em "N nevis practi. ee, CO DNA € extra w aaa (veh pavea pasa or cenifugaedo em gracente aaa a de veda eon SCL a ‘bs cts sto rates para io Geacdo0 — pose cine ontendo "por uma geracéo. : Drecso de — sedimertagao ge, (AORN extra (DNA da pene ca = primeire gereczo eanalsado, pee ae Gerardo 1 Pov sine gore f : i Pod oe , Netade do DNA da ODWA dextran aa vole da segunda ‘eracdo¢horida e ony ‘erarao 2 metaoee eve. 4 My ODNAgextrado earals Gerardo 3 ©, Um quarto do DNA da role da terceira ‘Beragao enibrido © ‘res quartos solves. | FICURA 10.4 DemonstragBo por Meselson e Stahl da repicacdo semiconservativa de DNA em E, coll. ilustraglo mostra que os resultados de seu experimento séo os esperados na replicacao semicanservativa do cromassamra de E.coli. Os resultados abtidos seria diferentes se a replicerin de NA wn F enlifinem ernment oo epention (gen 40) assim como a fotografia torna possivel obter uma ima- gem do que vemos. A diferenga € que o filme usado para autorradiografia é sensivel a radioatividade, enquanto 0 filme usado na cdmera € sensfvel & luz visivel. A autor radivgiafia € auity Gul uu cotudy dy uetabotiony dy DNA em vista da possibilidade de marcacio especifica do DNA por cultura das células em *H-timidina, desoxirribo- nuucleosidio de timina que contém um is6topo radioativo de hidrogénio (tritio). A timidina é incorporada quase exclusivamente 20 DNA; nao est presente em nenhum ‘ontro componente importante da célula. ‘Quando Taylor ¢ colaboradores usaram a autorradio- grafia para examinar a distribuico da radioatividade nos cromossomos de Vicia faba na primeira cmetéfase, as duas cromatides de cada par eam radioativas (Figu- '9 10.54). Na segunda cmetafasc, porém, apcnas uma das cromatides de cada par era radioativa (Figura 10.58). Esses sio exatamente os resultados esperados se a replicagao do DNA for semiconservativa, admitindose uma molé cula de DNA por cromossomo (Figura 10.5C). Em 1957, ‘aylor e seus colaboradores concluiram que a segregacao do DNA cromossémico em Vicia faba era semiconservati- vaa cada divisio celular. A conclusio de que a replicacio «da dupla hélice era semiconservativa na fava teve de espe- rar dados subsequentes indicativos de que cada cromos- somo contém uma s6 molécula de DNA. Experimentos anélogos foram realizados com varios outros cucariotos, ‘¢, em todos os casos, 0s resultados indicam que a replica- ‘cio é semiconservativa. Teste seu conhecimento sobre a replicacio de cromossomos acompanhando o Problema resolvido: Previsio dos padrdes de marcacao com *H em ‘cromossomos. ORIGENS UNICAS DE REPLICACAO John Cairns estabelecen a existéncia de um local de ini ‘cio ou origem de replicacdo no cromossomo circular de E. of, uias nav sugetiu se thavia umn Toval expectfiey de vsie ‘gem ou se esta ocorria em locais aleatSrios em uma popu- lacao de cromossomos em replicacdo. Os cromossomos bacterianos e virais geralmente tém uma origem ‘nica por cromossomo, a qual conirola a replicacio de todo 0 cromossomo. Nos grandes cromossomos de eucariotos, ‘miltiplas origens controlam coletivamente a replicaciogh i yw Tam B. Segunda metafase depois de outa replicas er ‘Htimidna, Twn ‘A Primera metfase dencis da repleagio em ‘Hm, ‘Ceptuio 10 | Repicacio do DNA e dos Cromossomos 227 © dupicario sen timitina marcada Sp oO Autorradonratia ome | YY - | La. wis as C. Interpretacio das autorradiogrefias mostradas em (A) ¢(B) em terms de repicacto semiconsenvatva. | FIGURA 10.5 Comprovagao da replicacao semiconservativa de cromossomos na fava, Vicia faba. Os resultados obtidos por laylor, Woods & Hughes (A,B) so prevstos pela replicagdo semiconservaiva do DNA (C). da molécula gigante de DNA de cada cromossomo. Da- ‘dos atuais indicam que essas maltiplas origens de replica- ‘Go em cromossomos eucaridticos também ocorrem em sitios especificos. Cada origem controla a replicacao de luna unidade de DNA clramadka répticon; ass, unaioria dos cromossomos procariéticos contém umn tinico répli ‘con, a0 passo que 0s cromossomos eucaridticos geral- mente contém muitos réplicons. A origem tinica de replicacao, chamada oriC, no cro- mossomo de £, coli foi caracterizada com bastante deta- Ihes. oriC tem 245 pares de nucleotidios de comprimento contém duas sequéncias repetidas conservadas diferen- igura 10.6). 114 uma sequéncia de 13 pb presente como trés repeti¢des consecutivas. Essas trés repeticbes sio ricas em pares de bases AT, facilitando a formacio de ‘uma regio localizada de separacio dos filamentos deno- ‘minada bolha de replicagdo. Lembre-se de que os pares de bases A:1 sao umdos por apenas cuas ligacoes de hicro- ‘génio, ao contrario das trés ligacdes existentes nos pares de bases G:C (Capitulo 9). Assim, os dois filamentos de rogides ricas em A:T do DNA afastam-sc com mais faci- lidade, isto é com menor gasto de energia. A formacao de uma zona localizada de desnaturacao € uma prime’ a etapa extencial na replicacin de tacos ox TINA hifila- ‘mentares. Outro componente conservado de ori é uma sequéncia com 9 pb repetida quatro vezes ¢ intercalacia ‘com outras sequéncias, Essas quatro sequéncias sio locais de ligacao de uma proteina que participa da formacio da bolha de replicagio, Adiante neste capitulo comentare ‘mos outros detalhes do proceso de inicio da sintese de DNA nas origens e das proteinas participantes. ‘As miiltiplas origens de replicacio em cromossomos ‘eucari6ticos também parecem ser sequéncias de DNA especificas. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, foram identificados e caracterizados segmentos de DNA cro- mossémico que permitem a replicacdo de um fragmen- to de DNA circularizado como unidade independente (autnoma), isto é, como unidade autorreplicativa ex- tracromossémica. Essas sequéncias sio denominadas dlenenus ARS (de Auwnouiously Replicating Sequenves, sequéncias de replicacio auténoma). Ha boa correspon- déncia entre sua frequéncia no genoma da levedura € 0 niimero de origens de replicacio, ¢ demonstrou-se ex- perimentalmente a atuacio de algumas delas como ori- gens. Os elementos ARS tém cerca de 50 pares de bases de comprimento ¢ incluem uma sequéncia central rica em AT com II pb, ATTTATPUTTIA, TAAATAPYAAAT (em Pa é qualquer uma das duas purinas e Py é qualquer uma das duas pirimidinas), e outras cépias imperfeitas dessa sequencia. A capacidade dos elementos AKS de atu- rem como origens de replicacao é extinta por trocas de pares de bases nessa sequéncia central conservada. ‘A maioria das tentativas de caracterizar as origens de replicagéo em eucariotos multicelulares nao teve éxito. Apesar dos indicios de que a repli sequiéncias expecificas in ninne da digpar quéncias de genomas inteiros, os componentes de uma origem ativa continuaram indefinidos. Aparentemente essa incapacidade de identificar origens de replicacao tem duas razdes principais. Em primeiro lugar, os en- ‘aioe fancionais uondoo em levedurea @ capacidade da origem de propiciar a replicacio de um plasmidio o} cromossomo artificial ~ nao produzem resultados confi veis em outros eucariotos. As sequéncias que propiciam areplicacéo de plasmidios em células de mamiferos, por exemplo, geralmenve levam ao infclo da replicacao em sitios aleat6rios ou miiltiplos. A segunda razio é que atu-228 Fundamentos de Genética PROBLEMA RESOLVIDO Previsdo dos padrées de marcacdo com 3H em cromossomos PROBLEMA Haplopappus gracilis @ uma planta diploide com dois pares de cro- rmossomos (2n = 4), Uma célula ¢essa planta em estago G, nunca antes exposta 3 radoatvidade, foi posta em meio de cultura conten- do 'H-tmiina, Depois de uma geracdo de crescimento nesse meio, > dss celuas da poke forat avedas we ev ny teva © ‘ransfridas para meio contendo 'H-timidinae colcicina, Ela cres- ceram messe meio por mais uma geragdo celular e até a metéfase céua Duplicarao do rdmera de cromassomas outra reoicacdo em ‘Htimidna, interropida na rmetatase — (Os quatro cromossomos de H. gracilis produzem dois cromossomos metafssicos, como mostra 2 figura acima. Ne auterradiografia des eromossomos metafésicos produsides, a distrbulgis da radioetvidade (indicada por pontos vermelhes) nos eta cromossomos serd a seguinte. oe Se OS Sue A as ¢ gpSequéncias 13mer Quatro sitios = surseuulves deligacéo mer ara protenas eiriciogsg |m FICURA 10.6 Estrutura de or a origem nica de replcacio no cro- mossomo de Ecol. almente ha mdicios consideraveis de que o mnicio da re- plicacdo requer sequéncias de DNA relativamente longas ~até varios milhares de pares de bases — em metazoarios, dificultando a caracterizagio de suas origens. ‘Ceptuio 10 | Repicacio do DNA e dos Cromossomos 229 VISUALIZAGAO DE FORQUILHAS DE REPLICACAO POR AUTORRADIOGRAFIA. ‘Acestrutura geral dos cromossomos bacterianos em repli- cacao foi determinada pela primeira vez por John Cairns, cur 1969, mais uma vee por autvrsadivglafia. Gaissns cule tivou células de E, coliem meio contendo “Ftimidina du- rante perfodos variados, provocoua lise das células cuida- ‘dosamente para nao romper os cromossomas (maléculas ‘de DNA longas sao sensfveis as forcas de cisalhamento) € coletou os cromossomios em fitros de membrana. s+ ses filtros foram afixados a laminas de vidro, recobertos com emulsio sensivel a particulas B (os elétrons de baixa nergia cmitidos durante o decaimento do tritio) ¢ arma- zenados no escuro por um perfodo para que houvesse de- caimento radioativo suficiente. Quando 0s filmes foram reveladloe, as autorradiagrafiae (Figura 10.78) mastraram que 0s cromossomos de E. coli sio estruturas circulares que existem como intermediarios em forma de 9 durante a replicacio. As autorradiografias indicaram ainda que © desenrolamento dos dois filamentos parentais comple- mentares (necessario para sua separagio) ¢ sua replica cio semiconservativa € simultdneo ou esta intimamente acoplado. Como é preciso que a dupla hélice parental rode 360° para desfazer cada giro da hélice, é impres divel que haja algum tipo de “pivé". Agora os geneticistas sabem que o piv necessdrio € uma quebra unifilamentar Ofgem Fors de eo 100 an Frau de replicas 00:50 82 B. Repcacio bidrecional do cromossomo creular de E. col, 1 actina 107 Imagem da eepicacko de cramascoma de Fei pee autoradingrfia. A. Lima das atoradiogrfias de Cairn de eromassomn ‘em replcacio em formato de @ de uma célua cultvada por duas geracSes na presenca de *H-timidina, com ailustraco explicatva na parte superior esquerde. Os filamentos radioetivs de DNA s8o epresentades come linhass6lides os filementos nBo redoetives, como linhes te ‘cejadas.As alcas Ae B concllram uma segunda replicacBo na presenca de H-timidina: secdo C permanece para se replcar pela segunda vez. BA iustracdo mostra como os resuttados de Caims so explcados pela repicagobidirecional do cromassomo de E.coli niciada na origer Unica de replicacéo.230 Fundamentos de Genética transitéria (clivagem de uma ligagio fosfodi filamento da dupla hélice) produrida pela aco de enzi- ‘mas chamadas topoisomerases. A replicacio do cromossomo de E. colié bidirecional a partir da origem tinica de replicacao. Cada estrutura em Touma de ¥ € una torquitha de repticarao, «as das Forqui- has movem-se em direcdes opostas sequencialmente em toro do cromossomo circular (Figura 10.78). A replicagio bidirecional do cromossomo cireular de E, coli que acabamos de comentar ocorre durante a sio celular. Nao deve ser confundida com a replicago por circnlo rolante. que medeia a transferéncia de cro- ‘mossomos das células Hfr para células F (Capitulo 8). Alguns cromossomos virais replicase pelo mecaniso do circulo rolante; veja a secdo Replicacdo por circulo rolante adiante neste capitulo. REPLICAGAO BIDIRECIONAL A replicagio bidirecional foi demonstrada convineente- ‘mente pela primeira vez por experimentos com alguns dos pequenos virus bacterianos que infectam a E. cali. O ‘hacteriAfagn lambeia (Fago X) cantém ma iinica malécrla linear de DNA com 17,5 pm de comprimento. O cromos- somo do fago A € um pouco incomum porque tem uma re- ‘0 unifilamentar, com 12 nucleotidios de comprimento, naextremidade 5" de cada filamento complementar (Figu- ra 100). Essas extremiclades unifilamentares, denominadas “coesivas’, sio complementares. Portanto, pode haver pa- reamento das bases das extremidades coesivas de um cro- ‘mossomo lambda para formar uma estratura circular com ligagdes de hidrogénio. Um dos primeiros eventos a ocor rer depois da injeco do cromossomo de um fago lambda em uma célula hospedeira é sua conversio em molécula Gircular fechada por ligacio covalente (Figura 10.8). Essa comersio da forma circular com ligagdes de hidrogénio em forma circular fechada por ligacao covalente € catali- sada pela DNA ligase, enzima importante que sela quebras unifilamentares em duplas hélices de DNA. A DNA ligase € necesséria em todos 0s organismos para replicacio do DNA, reparo do DNA e recombinacao entre moléculas de DNA. Da mesma maneira que o cromossomo de E. coli, 0 cromossomo lambda replica-se em sua forma circular por :ncio de intermediarios em forma de 0. A caracteristica do cromossomo lambda que facilitou a demonstracio da replicagao bidirecional sua diferen- Giagio em regides que contém alta concentragio de ade- nina e timina (regides ricas em AT) ¢ regides com gran- de quantidade de guanina ¢ citosina (regioes ricas em GO), Em particular, estes tém alguns segmentos com alto contetido de AT (grupos ricos em AT). No fim da década de 1960, Maria ScliuiGs e Russ Taman usar ain esses Lupus ricos em AT como marcadores fisicos para demonstrar, por meio de uma técnica chamada mapeamento de des- naturagio, que a replicacio do eromossomo lambda tem origem tinica e é bidirecional. (Quando as moléculas de DNA sio expostas a alta tem- peratura (100°C) ou 2 pH elevado (11.4), as ligacdes de tnremigaaes “coesivas’uniamentares com 12 pases tt Forma circular com ligacdes de hidrogénio i _ DNA i Endonuclease especia para tgaee ¥ | sequtncia de beses Forma circular fechada por ligacao covalente 1m FIOURA 100 Tres formas de cromossomo do fago lambda. A figure mostra as conwersbes do cromassomo linear de A, com suas extrem ‘daces coesivas complementares, em cromossomo circular de A com ligagdes de hidrogénio e, depois, em cromossomo circular de fecha- cdo por ligacia covalente.A forma linear do cramassomo parece Ser uma adaptacia para failitar sua injecda da caheca da fagn atraués a pequene abertura na cauda do fago, para a célula hospedeire durante 1 Infecybo, Antes de repicagBo ne oélulahoapedelra,o eromossomno € cconwertido na forma circular fechada por igacao covalente, Somiente ‘as extremidades do cromossomo do fago raduro sao mastradas, a linha vertical denteada indica que a porgdo central do cromassomo iio 6 mostrada.O cromossomo lambda tem ao todo 48,502 pares de ruceotidios de comprimento. hidrogénio e hidrofobicas que unem os filamentos com- plementares na dupla hélice sio quebradas, ¢ os dois fi- Tamentos se separam — um processo clrasado destratu- racio. Como os pares de bases AT so mantidos unidos Por apenas duas ligacdes de hidrogénio, em comparacao ‘com trés ligagdes de hidrogénio em pares de bases CC, a moléculas ricas em AT desnaturam-se com mais facilidade (em pH ou temperatura menores) que as moléculas ricas ‘em GC. Quando cromossomos lambda sio expostos a pH fr 11,05 por 10 min em condicdes apropriadas, os grupos ricos em AT desimawuramse © formant bolas de deste racdo, detectaveis por microscopia eletrOnica, enquanto as regides ricas em GC continuam no estado diiplex (Figu- ra 109). Essas bolhas de desnaturacio podem ser usadas ‘como marcadores fisicos esteja 0 cromossomo lambda na forma linear madura, circular ou de intermedisrios repli cativos em forma de 0, Ao examinarem as posicées dos‘Ceptulo 10 | Repicacio do DNA e dos Cromossomos 231 =n tot eemannoomemole Orr > bed etek id 01234567 & 91011 121314151617 [A Sitios de desnaturaco rcos em AT no cromossomo linear de 2. BB. ‘Sos de desnaturagao rcos em AT na forma circular do cromossomo 2. C. Boas de desoaracto rics em AT em um comossomo a em oleae em foma de 8. Irterpetacdo ovigem i = O00 50. ved vy D. lustraco na forma near doiteretiiorepcativo de & mostrado em (C) 1 AGUKA 109 © uso de stios de desnaturagao cos em AT como marcadoresfscos para comprovar que a repiacao do cromossomo do fago 26 bidrecional, ndo unidireional. A figura mostra as poses das bolhas de desnaturagSo rcas ern AT das formas linear (A) e circular (8) do ‘cromessomo A.A microgafiaeletrénica (C] mostra as posicbes das bolhas de desnaturacio(\dentificadas como a) e das foruihas de replicagdo (cireuladad) ern um exomessomo 2 parialmentereplicado. A estrutura do cromossomo pariaiment replicado em (C) éiustrada em (0) Pontos de ramificacao (estruturas em Y) em relagio &s po- ao redor do cromossomo circular. A Figura 10:10 mostra os sicdes das bolhas de desnaturacio em um grande niimero resultados esperados no experimento de Schnés e Inman de intermedisrios replicativos em forma de 0, Schnise In- se a replicacdo for (A) unidirecional ou (B) bidirecional. ‘man mostraram que os dois pontos de ramificagio sio for Os resultados mostraram claramente que a replicagio do quilhas de replicagéo que se movem em diregdes opostas_cromossomo lambda € bidirecional. Replicagio unidirecional i ©- ¢) ©) i -©- Q-O) Desnatura Desnatirardo mere parcial HO -@OO iGURA 10.10 Principio do processo de mapeamento da desnaturacdo in por Schnés e Inman para distinguir entre os mecarismos (A) unidirecional e (8) bidrecional de repicacdo do cromossomo.