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AULA nº 7 – Metabolismo bacteriano:

Metabolismo Energético

Bactérias Quimiorganotróficas e as oxidações


biológicas
O termo metabolismo refere-se à soma das reacções bioquímicas requeridas
para a produção de energia e para o uso dessa energia na síntese de material celular a
partir de moléculas ambientais. Assim, temos uma componente geradora de energia –
catabolismo e outra consumidora de energia – anabolismo. No catabolismo há
produção de energia sob a forma de ATP, que é utilizada nas reacções anabólicas para
construir o material celular. Esta relação pode verificar-se na figura seguinte:

Fig.7.1 – Relação entre anabolismo e catabolismo

As bactérias quimiorganotróficas usam os compostos orgânicos reduzidos


como fonte de carbono e energia. Vivem, muitas vezes, em associação com os animais,
sendo mestres da decomposição e biodegradação ambiental. O metabolismo
quimiorganotrófico é conduzido por dois processos fundamentais: fermentação e
respiração.

Fig. 7.2 – Reacções gerais do metabolismo quimiorganotrófico

Podem dividir-se em:


Fonte de
Categoria Nutricional Fonte de energia Exemplos
Carbono
Eubactérias
Quimiorganoautotrófico CO2 Orgânica metilotróficas
autotróficas
Composto Maior parte das
Quimiorganoheterotrófico Orgânica
Orgânico eubactérias

A Oxidação Biológica ou Desidrogenação


• ATP
Durante o catabolismo, a energia útil é temporariamente conservada na ligação
altamente energética do ATP. Não importa qual a forma de energia que a célula usa
como fonte primária, porque ela será sempre transformada e conservada sob a forma de
ATP.
Devido ao papel central do ATP
no catabolismo, é de esperar
que ele esteja presente como
coenzima na maioria dos
processos celulares produtores
de energia.

Fig.7.3 – Estrutura do ATP

• NAD
O NAD é outra coenzima comummente envolvida no catabolismo. A base da
transformação química normalmente envolve reacções redox. Para que algo se torne
oxidado, os electrões devem ser removidos por um agente oxidante - um aceitador de
electrões que se reduz na reacção. Durante a reacção, o agente oxidante é convertido em
agente redutor e pode adicionar os seus electrões a outra molécula, reduzindo-a, e
reoxidando-se a si mesmo. O NAD é a molécula que funciona como transportador de
electrões nestas reacções acopladas de oxidação-redução, assim como o NADP, o seu
derivado fosforilado. Estes compostos podem oxidar-se ou reduzir-se pela perda ou
ganho de 2 electrões. A forma oxidada do NAD simboliza-se NAD+ e a reduzida
NADH, NADH2, ou NADH + H+.

Fig.7.4 – Estrutura do NAD


Síntese de ATP nos Procariotas

As bactérias podem sintetizar ATP através de dois mecanismos:


• Fosforilação ao nível do substrato – degradação da glucose a ácido pirúvico;
• Fosforilação pelo transporte de electrões – fosforilação oxidativa.
A fosforilação ao nível do substrato é o mecanismo mais simples, antigo e
menos evoluído de produzir ATP. Nela, o ATP é produzido durante a conversão de uma
molécula orgânica. A energia libertada é parcialmente conservada durante a síntese da
ligação de alta energia do ATP. Este tipo de fosforilação ocorre durante a fermentação e
respiração (ciclo de Krebs).

Fig.7.5 – Fosforilação ao nível do substrato.


A degradação da glucose a ácido pirúvico: fosforilação
ao nível do substrato
Existem 3 vias utilizadas pelos microrganismos para catabolizar a glucose:
• Glicólise ou Embden-Meyerhof
• Via das pentoses fosfato
• Via Entner-Doudoroff

Nota: Neste Ponto vou referir-me apenas à via correspondente à fosforilação ao nível do substrato. Mais
à frente encontrarás as restantes vias.

Glicólise ou Embden Meyerhof

É a via mais comum de


degradação da glucose a ácido
pirúvico. Funciona tanto em condições
aeróbias como anaeróbias. Pode ser
dividida em duas partes:
1) No estado inicial, com 6
carbonos, a glucose é
fosforilada duas vezes e
convertida em frutose 1,6 -
difosfato. Este passo não
fornece energia e consome 2
moléculas de ATP. É ele que
inicia o processo através da
adição de grupos fosfato a cada
porção terminal do açúcar.
Estes fosfatos serão usados
para produção de ATP.
2) O passo com 3 carbonos da Fig.7.6 - Glicólise
glicólise dá-se quando a
enzima frutose 1,6-bifosfato aldolase cataliza a clivagem da frutose 1,6-bifosfato
em duas partes, cada uma contendo um grupo fosfato. Um dos produtos é o
gliceraldeído 3-fosfato, que é directamente convertido em piruvato num
processo com 5 passos. O outro produto, a dihidroxiacetona fosfato, é facilmente
convertida em gliceraldeído 3- fosfato, pelo que ambos os produtos da clivagem
da frutose 1,6-bifosfato são usados no passo com 3 carbonos. O gliceraldeído 3-
fosfato começa por ser oxidado com o NAD+ como aceitador de electrões, e um
fosfato é simultaneamente incorporado para dar uma molécula altamente
energética, o 1,3-bifosfoglicerato. O fosfato de alta energia no carbono é
subsequentemente doado ao ADP para produzir ATP. Este processo é
denominado fosforilação ao nível do substrato porque a fosforilação do ADP
está acoplada à quebra exergónica de uma molécula de substrato altamente
energética. Um processo semelhante gera um segundo ATP por fosforilação ao
nível do substrato. O grupo fosfato no 3-fosfoglicerato muda-se para o carbono
2, e o 2-fosfoglicerato é desidratado para formar outra molécula de alta energia,
o fosfoenolpiruvato. Esta molécula doa o seu grupo fosfato ao ADP formando
ATP + Piruvato, o produto final da via.

A via glicolítica degrada uma glucose em 2 piruvatos e produz ATP e NADH. O


balanço de ATP e NADH pode calcular-se considerando as duas fases separadamente.
Na fase com 6 carbonos, dois ATP são usados para formar a frutose 1,6-bifosfato. Por
cada gliceraldeído 3-fosfato transformado em piruvato, forma-se um NADH e dois ATP.
Dado que dois gliceraldeído 3-fosfato surgem a partir de uma molécula de glucose (um
por via da dihidroxiacetona fosfato), o estadio de 3 carbonos gera 4 ATP e 2 NADH por
molécula de glucose. A subtracção do ATP usado na fase de 6 carbonos daquele
produzido na fase de 3 carbonos dá um balanço de 2 ATP por glucose. Assim, o
catabolismo da glicose a piruvato na glicólise pode ser representado por:

Glucose +2ADP +2Pi + 2NAD+  2 piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+


O transporte de electrões e a fosforilação oxidativa. O
fenómeno de quimiosmose. Os inibidores da síntese
aeróbia do ATP.

A maior parte do ATP provém da oxidação do NADH e do FADH 2 na cadeia


transportadora de electrões.

A cadeia Transportadora de Electrões


A cadeia transportadora de electrões da mitocôndria é composta por uma série de
transportadores que operam em conjunto para transferir os electrões de dadores, como o
NADH e o FADH2, para aceitadores, como o O2.
Os electrões
Fig. 7.7 – Potenciais de
passam de Redução
transportadores com
potenciais de redução
mais negativos para
aqueles com
potenciais mais
positivos e
combinam-se com o
O2 e o H+ para formar
água. Os electrões
movem-se no sentido
descendente do
gradiente de
potencial. A diferença
entre os potenciais de redução do O2 e NADH é ampla, cerca de 1.14 V, e torna possível
a libertação de uma grande quantidade de energia. As mudanças de potencial em vários
pontos da cadeia são amplas o suficiente para fornecer energia suficiente para a
produção de ATP. A cadeia transportadora de electrões divide a energia total libertada
em pequenos passos. Alguma desta energia é armazenada sob a forma de ATP. O
transporte de electrões nestes pontos pode gerar gradientes protónicos e eléctricos, que
podem conduzir à síntese de ATP. Os transportadores residem na membrana interna da
mitocôndria e na membrana plasmática da bactéria. O sistema mitocondrial está
organizado em 4 complexos de transportadores, cada um capaz de transportar os
electrões parte do caminho até ao O2. A coenzima Q e o citocromo c ligam os
complexos uns aos outros. A fosforilação oxidativa é o processo pelo qual a energia
proveniente do transporte de electrões é usada para produzir ATP. 3 moléculas de ATP
podem ser sintetizadas a partir de ADP e Pi quando um par de electrões passa do NADH
para o O2.
Apesar de algumas cadeias bacterianas se assemelharem à cadeia mitocondrial,
na generalidade são muito diferentes. Variam nos transportadores (citocromos, p.e.) e
podem ser extensamente ramificadas. Os electrões podem entrar em vários pontos e sair
através de várias oxidases terminais. As cadeias bacterianas podem ainda ser mais curtas
e ter razões P/O mais baixas que as cadeias de transporte mitocondriais. Assim, as
cadeias transportadoras de electrões procariotas e eucariotas diferem nos detalhes da
construção apesar de operarem segundo os mesmos princípios fundamentais. As cadeias
transportadoras de electrões da E.Coli servirão como exemplo destas diferenças.
A cadeia transportadora da E.Coli é bastante diferente da cadeia mitocondrial
apesar de transportar electrões do NADH para aceitadores e mover protões através da
membrana plasmática. É ramificada e contém citocromos diferentes. A coenzima Q doa
os electrões para ambos os ramos mas estes operam sob condições de crescimento
diferentes. O ramo do citocromo d tem alta afinidade para o oxigénio e funciona em
condições com baixos níveis do mesmo. Não é tão eficiente como o ramo do citocromo
o porque não bombeia activamente protões. O ramo do citocromo o tem afinidade
moderadamente alta para o oxigénio, é uma bomba protónica e opera a condições
elevadas de oxigénio.

Fig.7.8 – Membrana Plasmática da E.Coli


A fosforilação oxidativa
A hipótese mais aceite para o funcionamento da fosforilação oxidativa é o
fenómeno da quimiosmose. De acordo com esta hipótese, formulada em 1961 pelo
bioquímico inglês Peter Mitchel, a cadeia transportadora de electrões está organizada de
modo a que os protões se movam para o exterior da matriz mitocondrial e os electrões
sejam transportados para o interior.

Fig.7.9 – O fenómeno da quimiosmose


O movimento protónico resulta de loops
transportadores ou da acção de bombas de protões que recebem energia do transporte de
electrões. O resultado é a força motriz protónica (FMP), composta por um gradiente
de protões e um potencial de membrana devido à desigual distribuição de cargas.
Quando os protões regressam à matriz mitocondrial conduzidos pela FMP, o ATP
é sintetizado numa reacção inversa à da sua hidrólise. Um processo semelhante tem
lugar nos procariotas, com o fluxo de electrões a causar o movimento dos protões para o
exterior através da membrana plasmática. A síntese de ATP ocorre quando estes protões
se difundem de volta ao interior da célula. A FMP também pode conduzir o transporte
de moléculas através das membranas e a rotação do flagelo, tendo assim um papel
central na fisiologia procariota.
A hipótese quimiosmótica é aceite pela maioria dos microbiólogos. Existem
provas consideráveis da geração de protões e gradientes de carga através das
membranas. No entanto, a prova de que são os gradientes de protões a força condutora
directa da fosforilação oxidativa não é conclusiva. Seja qual for o mecanismo preciso, a
síntese de ATP tem lugar na F1F0 ATPase ou ATP sintase. O componente mitocondrial F1
aparece como uma estrutura esférica ligada à superfície da membrana interior por uma
haste e pelo componente F0, que se encontra inserido na membrana. A F1F0 ATPase
encontra-se na superfície interior da membrana plasmática bacteriana. O F0 participa no
movimento de protões através da membrana, e acredita-se que este movimento através
de um canal no F0 conduza a fosforilação oxidativa. F1 é um grande complexo em que
três subunidades α alternam com três subunidades β. A subunidade γ estende-se no
sentido descendente a partir do complexo α3β3; este compõe parte da haste e interage
com o F0. A subunidade δ também se localiza na haste. A maior parte da subunidade γ
está posicionada no centro de F1, rodeada pelas subunidades α e β. A subunidade γ roda
rapidamente no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio dentro do complexo α3β3 e
causa as mudanças conformacionais que conduzem a síntese do ATP aos sítios activos
das subunidades β.

Fig.7.10 – A quimiosmose e a fosforilação oxidativa

Inibidores da Síntese de ATP


Muitos compostos inibem a síntese aeróbia do ATP e podem mesmo matar as
células quando em concentrações elevadas.
Estes inibidores dividem-se em duas categorias:
1) Alguns bloqueiam directamente o transporte de electrões. O antibiótico
Piericidina compete com a coenzima Q; a Antimicina A bloqueia o
transporte de electrões entre os citocromos b e c; o cianeto e azida sódica
param a transferência de electrões entre o citocromo a e o O2 porque são
estruturalmente semelhantes a este último.
2) Um outro grupo de inibidores são os chamados desacopladores, que
param a síntese de ATP sem inibirem o transporte de electrões em si.
Aliás, podem mesmo melhorar o fluxo de electrões. Normalmente, o
transporte de electrões está intimamente ligado à fosforilação oxidativa,
sendo que o balanço da síntese de ATP controla o balanço do transporte
de electrões. Quanto mais rápido for sintetizado o ATP durante a
fosforilação oxidativa, mais rapidamente opera a cadeia transportadora
de electrões para fornecer a energia requerida. Os desacopladores
desligam a fosforilação oxidativa do transporte de electrões, pelo que a
energia produzida pela cadeia é libertada sob a forma de calor e não de
ATP. Muitos desacopladores, como o dinitrofenol e a valinomicina
permitem que iões hidrogénio, potássio e outros atravessem a membrana,
sem activar a F1F0 ATPase. Assim sendo, destroem os gradientes iónicos
e de pH. A valinomicina pode ainda ligar-se directamente à F1F0 ATPase,
inibindo a sua actividade.

Tipos de metabolismo energético


Fermentação
A Fermentação é uma forma anciã de metabolismo, que evoluiu com o
aparecimento de material orgânico no planeta. A energia deriva da oxidação parcial de
um composto orgânico usando intermediários orgânicos como dadores e aceitadores de
electrões. Não estão envolvidos electrões exteriores à via e não é necessário sistema de
transporte de electrões - todo o ATP é produzido por fosforilação ao nível do substrato.
A fermentação é, por definição teórica, tão simples quanto o ilustrado na figura
7. . No entanto, na realidade, as vias da fermentação são um pouco mais complexas,
envolvendo normalmente alguns passos preliminares para fornecer a energia iniciadora
para a oxidação e fosforilações ao nível do substrato.
Figura 7.11 - Fermentação Modelo. (E) O substrato é oxidado num intermediário
orgânico, em que o agente oxidante é o NAD. Alguma da energia libertada pela
oxidação é conservada durante a síntese do ATP pela fosforilação ao nível do substrato.
Finalmente, o intermediário oxidado é reduzido aos produtos finais. O NADH2 é um
agente redutor, balançando a sua habilidade redox para conduzir as reacções produtoras
de energia. (D) Na fermentação láctica, pelo Lactobacillus, a glucose é oxidada a
piruvato e este é reduzido a lactato. O balanço redox é mantido pelas oxidações
acopladas a reduções durante a via. Por exemplo, na fermentação láctica via Embden-
Meyerhof, a oxidação do gliceraldeído fosfato a ácido fosfoglicérico está acoplada à
redução do piruvato a lactato.

Em bioquímica, por uma questão de conveniência, as vias fermentativas iniciam-


se com a glucose. Isto porque se trata de uma molécula bastante simples, que requer
poucos passos catalíticos. Como referido anteriormente, existem 3 vias de degradação
da glucose:

i. Glicólise ou Embden-Meyerhof - descrita acima (vide pag. 5)


ii. Via da Pentose-Fosfato
iii. Via Entner-Doudoroff

Quer uma bactéria seja ou não fermentadora, ela degradará os açúcares através
de uma destas vias ou mais.

Via da Pentose-Fosfato
Também designada via da hexose monofosfato, pode ser utilizada ao mesmo
tempo que a glicólise. Funciona tanto em condições aeróbias como anaeróbias e é
importante tanto na biossíntese como no catabolismo. Inicia-se com a oxidação da
glucose 6-fosfato a 6-fosfogluconato seguindo-se a oxidação deste a ribulose 5-fosfato e
CO2. Durante estas oxidações há a produção de NADPH. A ribulose 5-fosfato é
convertida numa mistura de 3 através
de açúcares fosfatados com 7
carbonos. Existem 2 enzimas
exclusivas desta via que desempenham
um papel central nestas
transformações:
• Transcetolase – cataliza
a transferência de
grupos cetol com 2
carbonos;
• Transaldolase –
transfere um grupo
propilo da sedoheptulose 7-fosfato para o gliceraldeído 3-fosfato.
Fig.7.12
O resultado final é que 3 glucose 6-fosfato são convertidas em 2
frutose 6-fosfato, gliceraldeido 3-fosfato e 3 CO2:

3 glucose 6-phosphate + 6NADP+ + 3H2O  2 fructose 6-phosphate + glyceraldehyde 3-phosphate +3CO2 + 6NADPH + 6H+

Estes intermediários são usados de duas maneiras:


• A frutose 6-fosfato pode ser convertida em glucose 6-fosfato;
• O gliceraldeido 3-fosfato é convertido em piruvato por enzimas
glicolíticas. Este pode ainda ser devolvido à via da pentose-fosfato
através da formação da glucose 6-fosfato. Isto resulta na degradação
completa da glucose 6-fosfato em CO2 e na produção de uma grande
quantidade de NADPH:
Glucose 6-phosphate +12NADP+ + 7H2O  6CO2 + 12NADPH + 12H+ + Pi
A via da pentose-fosfato tem várias funções catabólicas e anabólicas:
1. O NADPH serve como fonte de electrões para a redução de moléculas durante
a biossíntese.
2. A via sintetiza açúcares com 4 e 5 carbonos porque: o açúcar com 4 carbonos
eritrose 4-fosfato é usado para a síntese de aminoácidos aromáticos e vit. B6. A pentose
ribose 5-fosfato é um componente major dos ácidos nucleicos e a ribulose 1,5-bifosfato
é um aceitador principal de CO2 na fotossíntese. De notar que quando um
microrganismo cresce com uma pentose como fonte de carbono, a via pode fornecer
carbono para a produção de hexose (a glucose é necessária para a produção de
peptidoglicano).
3. Os intermediários desta via podem ser usados para produzir ATP. O
gliceraldeído 3-fosfato pode entrar na fase de 3 carbonos da glicólise e ser convertido a
ATP e piruvato. O piruvato pode ser oxidado no ciclo de Krebs, para fornecer mais
energia. Além disso, algum NADPH pode ser convertido em NADH, que origina ATP,
quando este é oxidado pela cadeia transportadora de electrões. Uma vez que as pentoses
são intermediários na via, esta pode ser usada para catabolisar pentoses e hexoses.

Ainda que a via da pentose-fosfato seja fonte de energia em muitos


microrganismos, é mais importante na biossintese.
Via Entner-Doudoroff
Esta via inicia-se com as
mesmas reacções que as da via da
pentose-fosfato: a formação de
glucose 6-fosfato e 6-
fosfogluconato. Ao invés de ser
mais oxidado, o 6-fosfogluconato é
desidratado, formando 2-cet-3-
deoxi-6-fosfogluconato (KDPG), o
intermediário chave nesta via. O
KDPG é clivado pela KDPG
aldolase em piruvato e gliceraldeído
Fig.7.13 – A Via da Pentose Fosfato
3-fosfato. Este último é convertido
em piruvato na porção terminal da
glicólise. O balanço é de 1 ATP, 1
NADPH e 1 NADH por glucose

Fig.7.14 – Via Entner-Doudoroff


metabolizada. A maioria das bactérias contêm a via glicolítica e da pentose fosfato, mas
algumas substituem a via Entner-Doudoroff pela glicólise. A Entner-Doudoroff é
geralmente encontrada nas Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium, e
outros géneros Gram negativos. Muito raras são as bactérias Gram positivas a possuir
esta via, sendo a Enterococcus faecalis rara excepção.

Fig.7.15 – Distribuição das vias de degradação da glucose


Fig.7.16 – Reoxidação do
NADH durante a fermentação.

Tipos de fermentação
Fig.7.17 – Tipos de fermentação

Na ausência de respiração, aeróbia ou anaeróbia, o NADH não é oxidado pela


cadeia transportadora já que não estão disponíveis aceitadores externos de electrões.
Ainda assim, o NADH produzido na glicólise durante a oxidação do gliceraldeído 3-
fosfato a 1,3-bifosfoglicerato pode ser oxidado a NAD+. Se o NAD+ não for regenerado,
a oxidação do gliceraldeído 3-fosfato cessará e a glicólise pára. Muitos microrganismos
resolvem este problema abrandando ou parando a actividade da piruvato desidrogenase
e usando o piruvato ou um dos seus derivados como aceitador de electrões, e hidrogénio
para a reoxidação do NADH num processo de fermentação. Isto pode levar à produção
de mais ATP.
O processo é tão eficaz que alguns quimiorganoheterotróficos não fazem a
respiração mesmo quando o oxigénio está disponível. Existem vários tipos de
fermentação, sendo que cada um é característico de um determinado grupo microbiano.
Em todos eles, o NADH é oxidado a NAD+ e o aceitador de electrões é o piruvato ou
um seu derivado. O substrato é parcialmente oxidado, o ATP é apenas formado por
fosforilação ao nível do substrato e não é necessário oxigénio.
Algumas bactérias fermentam os açúcares a CO2 através da fermentação
alcoólica. O piruvato é descarboxilado a acetaldeído, que depois é reduzido a etanol
pela álcool desidrogenase com o NADH como dador de electrões.
Na fermentação láctica o piruvato é reduzido a lactato. É a mais comum e está
presente nos Bacillus. Os fermentadores do ácido láctico podem dividir-se em
fermentadores homolácticos, que usam a via da glicólise e reduzem directamente quase
todo o seu piruvato a lactato, através da lactato desidrogenase. Os fermentadores
heterolácticos formam quantidades substanciais de outros produtos que não o lactato;
muitos produzem lactato, etanol e CO2 pela via da fosfocetolase.
Muitas bactérias, especialmente as enterobactérias, conseguem metabolizar o
piruvato para originar ácido fórmico e outros produtos num processo denominado
fermentação do ácido fórmico. Este ácido pode ser convertido em H2 e CO2 pela
hidrogenoliase fórmica:

HCOOHCO2+H2

Existem dois tipos de fermentação do ácido fórmico:


1) Fermentação ácida mista, que resulta na excreção do etanol e de uma
mistura complexa de ácidos como o acético, láctico, succínico e fórmico.
Se a hidrogenoliase fórmica estiver presente, o ácido fórmico será
degradado a H2 e CO2. Esta via é verificada na Escherichia, Salmonella e
Proteus, entre outros.
2) O outro tipo é a fermentação butano-glicólica, característica dos géneros
Enterobacter, Serratia, Erwinia e algumas espécies de Bacillus. O
piruvato é transformado em acetoína, que é reduzida a 2,3-butanodiol
pelo NADH. Forma-se uma grande quantidade de etanol, juntamente
com uma pequena quantidade dos ácidos encontrados na fermentação
ácida mista.
Estes tipos de fermentação do ácido fórmico são muito úteis na identificação de
membros das Enterobacteriaceae. Os fermentadores ácido-mistos podem ser
distinguidos dos fermentadores butano-glicólicos de 3 maneiras:
1. Teste Voges-Proskauer, um procedimento colorimétrico que detecta a
acetoína, precursora do butanodiol, e que é positivo com fermentadores butano-
glicolíticos e não com os ácido-mistos. É utilizado para a identificação de
enterobactérias p.e.

Fig. 7.18 – O Teste Vogues Proskauer

2. Os fermentadores ácido-mistos produzem 4 vezes mais produtos ácidos do


que neutros, enquanto os outros formam maioritariamente produtos neutros. Assim, os
fermentadores ácido-mistos acidificam o meio de incubação em muito maior extensão.
Esta é a base do teste do vermelho de metilo. Este teste é positivo apenas para
fermentadores ácido-mistos porque o pH desce abaixo de 4.4 e a cor do indicador muda
de amarelo para vermelho.
Fig.7.19 – Teste do Vermelho de Metilo

3. O CO2 e H2 surgem em quantidades iguais da actividade da hidrogenoliase


fórmica durante a fermentação ácida mista. Na fermentação butano-glicólica produz-se
um excesso de CO2, sendo que a razão CO2 /H2 é de 5:1.
Os fermentadores do ácido fórmico por vezes geram ATP enquanto reoxidam o NADH.
Utilizam o acetil CoA para sintetizar acetil fosfato, que doará o seu fosfato ao ADP:

Acetyl-CoA + Pi  CoASH + acetyl-P

Acetyl-P + ADP  acetate+ ATP

Respiração
A respiração é um meio de oxidação de compostos orgânicos mais complicado
que a fermentação. Resulta na oxidação completa do substrato por um aceitador de
electrões externo. Em adição a uma via da glicólise, 4 componentes metabólicos ou
estruturais são necessários:
1. O Ciclo de Krebs: quando um composto orgânico é utilizado como substrato,
o ciclo de Krebs é utilizado para a completa oxidação desse substrato. O produto final
resultante é sempre o CO2.

2. Uma membrana e um Sistema Transportador de Electrões associado. O STE é


uma sequência de transportadores de electrões na membrana plasmática que transportam
os electrões do substrato através da cadeia até ao aceitador final dos mesmos. Os
electrões entram no STE num potencial redox muito baixo e saem a um potencial redox
relativamente elevado. Esta queda nos potenciais liberta energia que pode ser captada
pelas células durante a síntese de ATP pelo mecanismo da fosforilação por transporte de
electrões. O trabalho do STE estabelece uma força motriz protónica devido à formação
de um gradiente protónico ao longo da membrana.

3. Um aceitador de electrões exterior (“exterior” significa que não faz parte da


via). Para a respiração aeróbia o aceitador de electrões é o O2. O oxigénio molecular é
reduzido a H2O no último passo do sistema transportador de electrões. No processo
bacteriano de respiração anaeróbia, os aceitadores finais de electrões podem ser SO4 ou
S, NO3 ou NO2 ou outros compostos inorgânicos ou orgânicos, como o fumarato.

4. Uma ATPase transmembranar (ATP sintetase). Esta enzima utiliza a força motriz
protónica estabelecida na membrana (pelo STE) para sintetizar ATP na fosforilação por
transporte de electrões.

O diagrama da respiração aeróbia, abaixo representado, integra estes processos


metabólicos num esquema que representa o processo total do metabolismo respiratório.
Um substrato como a glucose é completamente oxidado a CO2 pelas vias combinadas da
glicólise e ciclo de Krebs. Os electrões removidos da glucose pelo NAD são inseridos
no STE da membrana. Com os electrões a atravessar o STE, uma FMP é estabelecida ao
longo da membrana. Os electrões reduzem o aceitador exterior, O2, a H2O. A FMP na
membrana é utilizada pela ATPase para sintetizar ATP na fosforilação oxidativa.
Fig.7.20 - Modelo da respiração aeróbia.

A reacção global para a respiração aeróbia a partir da glucose é:

Glucose + 6 O2  6 CO2 + 6 H20 + 688 kcal (total)

Que pode escrever-se:

Glucose  6 CO2 + 10 NADH2 + 2 FADH2 + 4 ATP

(2 NADH2 da glicólise, 8 NADH2 das duas voltas do ciclo de Krebs, 2 FADH 2 das duas
voltas do ciclo de Krebs; 2 ATP da glicólise, 2 ATP (GTP) das duas voltas do ciclo de
Krebs)

Na E. coli, 2 ATP são produzidos por cada par de electrões introduzidos no STE
pelo NADH2. 1 ATP é produzido pelo par de electrões introduzido pelo FADH 2. Assim,
a equação será:

Glucose + 6 O2  6 CO2 + 6 H20 + 20 ATP (ETP) + 2 ATP (ETP) + 4 ATP (SLP) + 688 kcal (total)
Dado que um total de 26 ATP são formados, com a libertação de 688 kcal de
energia, a eficiência da respiração é 26x8/688 - cerca de 30%.

Nas Pseudomonas, devido à natureza exacta do STE, 3 ATP são produzidos por
cada par de electrões introduzidos no STE pelo NADH2 e 2 ATP são produzidos por
cada par de electrões introduzido pelo FADH2. Assim, a reacção geral nas
Pseudomonas, utilizando as mesmas vias que a E. coli, é:

Glucose + 6 O2  6 CO2 + 6 H20 + 38 ATP + 688 kcal (total)

Dando uma eficiência correspondente de cerca de 45%.

Fig.7.21 – Respiração aeróbia na E.Coli


A respiração em alguns procariotas é possível utilizando aceitadores de electrões
que não o O2. É a designada respiração anaeróbia, realizada na ausência de oxigénio. Na
sua forma mais simples, representa a substituição ou uso de um composto que não o O 2
como aceitador final de electrões na cadeia transportadora. Os aceitadores de electrões
utilizados pelos procariotas são descritos na figura seguinte.

electron reduced end


name of process organism
acceptor product
Escherichia,
O2 H2O aerobic respiration
Streptomyces
anaerobic respiration:
NO3 NO2, N2O or N2 Bacillus, Pseudomonas
denitrification
anaerobic respiration: sulfate
SO4 S or H2S Desulfovibrio
reduction
anaerobic respiration:
fumarate succinate Escherichia
using an organic e- acceptor
Fig.7.22 – Aceitadores de electrões nos procariotas

Fig.7.23 – O oxigénio é o aceitador de e- mais eficiente

A desnitrificação é um processo importante na agricultura por remover o NO3 do


solo. O NO3 é a maior fonte de fertilizantes de azoto. O uso do nitrato como aceitador
de electrões na respiração é uma alternativa usual ao uso de oxigénio. Bactérias do solo,
como as Pseudomonas utilizam o O2 como aceitador se este estiver disponível,
desprezando o NO3. A E. coli utiliza o NO3 (assim como o fumarato) como aceitador,
sendo capaz de respirar no habitat intestinal, anaeróbio. Fig.7.24 –
Bactérias desnitrificantes

As bactérias
anaeróbias têm um papel
fundamental nos ciclos
biológicos do carbono,
azoto e enxofre. No geral, convertem as suas formas oxidadas num estado mais
reduzido.

O teste da oxidase
Detecta a presensa da citocromo c oxidase, que é capaz de reduzir o O2 e
aceitadores de electrões artificiais. Importante na distinção das espécies Neisseria e
Moraxella (+) das Acinetobacter (-), e entero (todas -) das pseudomonas (+).Utiliza-se
para diferenciar os bacilos Gram -.

Fig.7.25 – O teste da Oxidase

O papel de filtro é humedecido com algumas gotas de tetrametil-p-


fenilenediamina 1%. Com um aplicador de madeira, as colónias de um meio de agar são
transferidas para o papel. Um teste positivo é o desenvolvimento de uma cor púrpura.

Teste de Hugh e Leifson


As bactérias utilizam a glucose e outros hidratos de carbono no seu
metabolismo. Algumas vias são oxidativas e outras fermentativas.
O teste de Hugh e Leifson, ou teste de oxidação-fermentação, é usado para
determinar qual a via utilizada. Aplica-se na diferenciação entre espécies,
principalmente de bacilos Gram -.
O produto final do metabolismo de um hidrato de carbono é um ácido. Este
método consiste num meio semi sólido em tubos, contendo glucose (ou outro HC) e um
indicador de pH.
Dois tubos são inoculados e um é imediatamente selado para ficar sob condições
anaeróbias. Os organismos oxidantes, como as Pseudomonas, produzem uma reacção
ácida apenas no tubo aberto. Os organismos fermentativos, como as
Enterobacteriaceae, produzem uma reacção ácida em ambos os tubos.
Os organismos que não conseguem quebrar a glucose aerobia nem
anaerobiamente, como a Alcaligenes faecalis, produzem uma reacção alcalina no tubo
aberto e não se verificam mudanças no tubo selado.

Fig.7.26 – Teste de Hugh e Leifson


Fig.7.27 Produção de energia nos quimiotróficos

Bibliografia da AULA nº7


• PRESCOTT, Lansing M; “Microbiology”; 5th Edition; The McGraw−Hill Companies; 2002
• Slides das aulas teóricas 2007/2008
• http://textbookofbacteriology.net/metabolism.html
• http://www.hpa-standardmethods.org.uk/documents/bsopTP/pdf/bsoptp27.pdf
Sites consultados a 5 e 6 de Abril de 2008