Capitulo ASPECTOS BASICOS DE FISIOLOGIA E MULTIPLICACAO DE BACTERIAS FITOPATOGENICAS Cantas bacterianas podem ser visualizadas como méquinas quimicas que realizam reagdes gragas a enzimas e complexos enzimaticos por elas mesmas sintetizados. Podem também ser consideradas unidades bioinformacionais, uma vez que armazenam constitutivamente, processam, multiplicam, assim como intercambiam, informagées genéticas com seus pares. Adicionalmente, além da enorme diversidade de tipos de vida encontraveis no universo dos microrganismos a que convencionamos denominar bactérias, uma determinada espécie de bactéria sempre exibe uma espantosa versatilidade fisiolégica e bioquimica. Bactérias e Geracao de Energia Ser capaz de gerar energia € uma das caracteristicas_ mais jnerentes aos seres vivos e todos eles precisam fazé-lo, incessantemente. Bactérias também requerem energia continuamente entagdio de seus processos vitais, como crescimento, para a implem e assim por diante. multiplicagao, diferenciagio, recombinagaoBactérias ftoparogénicas 86 20 qual pertencem, podem sctria,dapendendo do grupo 20 qual perteneem. pod ce sotoffeas) ou pela captura da energia solar (fototricas). Nao se ire ‘cee opsogenia ots.” Apurentements, Pea as iadas algas verde-azuis @ mais comum entre as chamadas alg : rae ale tem oceanosesgua doce como habit eque sap oeietnck por min Je O87 do onigénio gerado na supericie do planeta (STANIER et al., 1986). hactérias quimiotrficas so. classificadas__ em imiorenousheas, quando geram energia pela metabolizagio dos amposts orginices, e quimiolitotréicas, quando fazem o mesmo em felagio a compostos inorginicos. As bactérias ftopalogénicas.sio, tipicamente, quimiorganotréficas (KIRALY et al., 1970). Bactérias e Interagdes com o Ambiente actérias so perfeitamente equipadas com —_sensores, que as circunda, posto estarem continuamente sujeitas a varios tipos de pias einesperadas mudangas no ambiente, como osilagdes na disponibilidade de nutrientes, acidez, temperatura, disponibilidade de ‘gua e assim por diante (MADIGAN et al., 2000). Para sobreviver neste ambiente continuamente mutante, a bactéria precisa estar apta a monitorar as condigdes externas e ser capaz de ajustar, de maneira répida e precisa, sua estrutura, fisiologia e comportamento. Para isso, elas precisam alterar a expressio de seus genes eficiente e rapidamente em resposta a sinais do ambiente (CHARLES et al., 1992; HOOYKAAS e BEUERSBERGEN, 1994). A titulo de exemplo, A. ‘tumefaciens ~ uma baciéria que induz tumores em plantas ¢ penetra or ferimentos — possui genes (Genes ChvG) em seu cromossoma Principal capazes de detectar altergBes no pll do sitio por onde Penetrou, alteragSes essas decorrentes do ferimento, Essa percep¢io biotégica do aumento de acidez desencadeia todo o processo de c6pia € transferéncia de uma regio do plasmideo Ti para a célula da planta, transformando-a (LI et al., 2002) Aspectos bisicos de fsiologia e mubiplicagdo de bactérias flopatosenicas 87 SERRE eos de foto e muhiplicasdo de bactérias lopaiogenicas 87 Temperatura ‘Temperatura talvez seja um dos fatores do meio ambiente 20 qual bactérias exibem mais sensibilidade e dependéncia para multiplicagio e exercicio de suas fungées metabdlicas vitais, O metabolismo bacteriano, como o de qualquer ser vivo, guarda estrita dependéncia do seu aparato enzimatico, e enzimas, como se sabe (LEHNINGER, 1976), 18m sua atividade bioldgica dependente da temperatura, O grupo de seres vivos aos quais denominamos bactérias € to diverso que podem ser encontrados espécimes vivendo normalmente {anto em regides polares como em fontes de aguas termais (STANIER et al., 1986). Ha espécies que podem tolerar temperaturas acima do Ponto de ebuli¢ao da agua e outras que toleram temperaturas abaixo 40 ponto de congelamento, AAs bactérias sfo classificadas, em fungio de suas faixas étimas de temperatura para multiplicagio, em termofilicas (altas femperaturas), mesofilicas (temperatura ambiente, compativel com a vida de mamiferos, por exemplo) e psicrofficas (baixas temperaturas). A arqueobactéria Pyrolobus fumarii & guisa de exemplificagao, € capaz de se multiplicar a 113°C, a0 passo que Chlamydomonas imvalis, uma alga procaridtica verde-azul, € capaz de se multiplicar dentro da neve (MADIGAN et al., 2000). Bactérias fitopatogénicas sdo tipicamente mesofiticas, com um Stimo de temperatura para multiplicagio na faixa de 25°C 4 28 °C Tanto assim que laboratérios de fitopatologia que trabalham com Fitobaetériastém suas incubadoras com a temperatura Padronizadamente ajustada para 28°C. Em contraposigio, bactérias Patogénicas a mamiferos, por exemplo, t&m una temperatura otima Para crescimento bem acima: em tomno de 37°C. Tolerancia Osmotica Todo ser vivo necessita de gua em quantidade suficiente isponivel; sem gua, mio hi vida de nenhuma espécie. Pisponibilidade de gua, contudo, nio significa apenas este ee Peralta: Meo, ois a quantdade realmente disponivel de gua, Beralmente conhecida como “atividade da agua", depende’ daBactérias fopatogenicys resente, Moléculas de substincigg quantidade de a on aie a estabelecer interagdes com FH guises a govas para uso imedias pak moléculas de see DIG, JANet al., 2003). Explicando de maneira microrganismos (I de gua destilada contém muito mais gua figurada, ae actéria que um litro com substincias nely disponivel dissolvidas. é assificadas em halofiticas (so capazes a cs ee ei) fas concentragdes de sais no m oe ftopatogénicas so tipicamente nto-halofiticas sit 1970), No inicio da Bacteriologia de Plantas como CKIRALY et aly amese ou utilizavam-se meios de cultura ciéncia tone eriologia Medica, geralmente contendo 54% ou mais Gomuns em BetTimente, hi meios de cultivo espectficos pan eae g como 0 meio 523 (KADO e HESKETT, 1970), fiobacternente empregado para cultivo de fitobactérias “no aaron Bacterilogia de Planas e Controle Biol6gico da UFY, rae mesmo contém NaCl em sba composiga. Potencial Hidrogeniénico (pH) 3s de A acidez de solugdes, meios e ambientes € media oo potencial hidrogeniico ou [H+ por uma escala propests pot guimico sueco Sorensen, variando o pH de 0 (maxi ae (méxima bascidade). Em verdade, pH € 9 cology concentragio hidrogeniGnica expressa em molardade, Att eustalembrar que a escala de pH Togaritmiea e variate unidade de pH correspondem a 10 vezes mais dci ‘a i és Dependendo do pH stimo requerido pela bacté a ese multiplicar, ela pode ser considerada acidéfila, neuroils o bose Nao se pode esquecer que 0 timo de acidez requerid® Diy) bactéria di2 respeito ao pH do meio externo a oélula bactetN, terior da célula, independentemente de qual bactéria s precisa estar em torno do neutro. Aspectos bisicos de fsiologiae multipi de bactérias fuoparogénicas gg As fitobactérias slo tipicamente neutrfilas, com um otimo de PH em tomo de 7.0 (KLEMENT et al., 1990). Padronizadamente & PH de meios para cultivo de bactérias fito patogénicas é ajustado para, p65 a autoclavagem, ficar em torno do ne “tro. Relac6es com o Oxigénio Livre Quando se diz que o oxigénio & essencial & vida, fala-se da vida humana, de mamfferos ou de plantas superiores. Contudo, no mundo procariético existem bactérias inclusive, a dive ue prescindem de oxigénio e outras, S quais 0 oxigénio é téxico ~ mais um exemplo da ersidade de formas de vida entre os organismos procariotas Curiosamente, certos procariotas possuem at enziméticos para degradar formas t6xicas de oxisé al., 2000). Por exemplo, certas. bactéri enzimético denominado genericamente cat gua oxigenada, t6xica, como se segue mecanismos io (MADIGAN et jaS possuem um complexo talase, capaz de decompor a HO; + H:0; => 2H,0 + 0; Outro complexo enzimético semelhante é a superéxido- desmutase: (0; + 02 => 2H"+ 2H0 +0, As bactérias, em relagio a0 oxi classificadas em: aerdbicas estritas (s6 se nio livre, podem ser multiplicam na presenga de ©;), anaerdbicas estritas (so incapazes de sobreviver na Presenga de Oz), anaerébicas facultativas (sto versatilmente capazes de se multiplicar tanto na presenga como na auséncia de 02) © microaersfilas (que s6 conseguem se multiplicar sob baixas tenses de 02). Incorporando eélulas viiveis de uma bactéria a um meio adequado de cultura, fundente, vertendo-o em placas e depositando uma lamfnula estéril na superficie do meio sdlido, observa-se um padrio como mostrado na Figura 4.1. As aerébicasig ja laminula; as anaerdbicas estritas 56 io crescem debaixo da estritas no cresc tpaixo da laminula e distante dos bordos; as anaersbicas jebaixo da aa ‘escem indistintamente tanto embaixo quanto fora da facultativas cresc pte bios de itor emulapicario de acti flpatognices 9g) Quadro 4.1 - Algumas caracteristicas passiveis de serem utlizadas Para diferenciar os géneros de fitobactérias ‘mula; e as microaerdfilas crescem debaixo da laminula, mas iamaol etn hal ; i ij ri,dl 4 préximas dos bordos. ot fiidi fal diihi aad [estents amareios ou rargaem VDC ou NEY } ell eL EH eenctoneneen eltettet- betel Penis i -tom dcee AT 5 oo lv fefa- [naa fin as ar tell vv EEE EEE EECEeEr Microaerétit xigénio livre Figura 4.1 - Teste simples para estudo das relagoes com 0» passiveis de serem exibidas por bactérias. Santas. Entre as bactérias capazes de incitar doengas em pl ). Como tods existem aerdbicase anardbicasfacultativas (Quad 4.1), Como tet as fitobactérias na facultativas, 0 oxigénio é importante no cultivo; por i850, eae Possivel, cltvo em meio liuido€ feito sob agitagto, pare i a aeragdo (dissolugdo de mais Os no iquido, & medida qu sendo consumido pela cultura em crescimento). Fonte: adaptado de Schaad etal 2001). Requerimentos Nutricionais Bactérias ndo-fastidiosas, como as que sio objeto deste livro, usualmente so muito verséteis dos pontos de vista metabslico, fisiol6gico e bioquimico. A maioria das bactérias fitopatogénicas nio- fastidiosas, como as pertencentes aos géneros mosttados no Quadro 4.1, sto quimiorganotréficas ¢ crescem com relativa facilidade em meios de cultura simples, desde que contenham fontes orginicas de C e N. Espécies do género Xanthomonas, todavia, Fequerem fatores de crescimento adicionais (STARR, 1981), sendo esta, inclusive, uma das diferengas entre espécies de Xanthomonas e de Pseudomonas (KRIEG e HOLT, 1984). A experigncia tem ‘mostrado também que bactérins fitopatogénicas do grupo Corineforme ™ultiplicam-se melhor em meios mais ricos e mais completos.Bactérias ftopatogénicas 2 jologia de Plantas © Controle Bacteriologia St No. erat t ederal de Vigosa uliza-se, cone pa, oer KAD HESKETT, 1970), cuja composigio achase meio 523 (KAI e explictada no Quadro 4.2. Jeio 523 de Kado e Heskett, que pode ser utilizado, com 4.2 - Meio Quadro 42 Meveso. no cultivo. da maioria das bactérias fitopatogénicas am Sacarose : oa Casefna dcida hidrolisada Boe Extrato de levedura ee K HPO, (anidro) a MgSO,,7H,0 a i 4.s.p 1.000 mi Agua destilada (q-p.) Fonte: adapado de Kado e Heskett (1970). a ina é uma No meio 523, a fonte de carbono € a sacarose, a casein ane fonte de aminodcidos ¢ peptideos de cadeia curta (C ¢ b Dees de levedura fornece vitaminas, fatores de crescimento e mi Crescimento Bacteriano Consideradas as reduzidas dimens6es da célula ee estudo © na pesquisa de fungGes biol6gicas como pote ee reproducio, habitvalmente, 0 enfoque nao € feito em in art em populagdes. Assim, interessa ao pesquisador mais ii Haris Gindmica de uma populago' de elulas bacterianas em fungio & certos fatores que se concentrar em eventuais variagdes x = softer uma tnica e dada célula em fungio desses mesmos fal ne Dessa forma, ao se falar em crescimento, estaremos nos sferndo crescimento de populagdes de células e no crescimento de cane consideradas isoladamente como individuos (STANIER et al, VOLK e WHEELER, 1973), Aipectesbésicns de fsiotosiae muliplicagio de bactérias \ftoparogénicas ga, Em qualquer sistema biol6gico, crescimento pode ser definido Bacteting cree? Ordenado de todos os componentes quimices Bactérias crescem e multipliam-se por um proceso, reset (nio- Sexuado), biologicamente muito simples, denominado fide ne divisdo Sinples (Figur 4.2). Desse modo, a0 atingir matundade fisiolégica fuficente, a célula bacteriana simplesmente divide-se em duc células- filhas, Cromossoms Cheplsna Fonte: redesenhado a partic de Darnell et al. (1990), Figura 4.2 - Multiplicagdo de bactérias por fissio ou divisto simples, Gm que uma eélula, atingindo a maturidade fisioldgica, divide-se em duas, © tempo que uma bactéria leva para se multiplicar (originar djuas células-filhas) & chamado periodo de geragao (PG), que € uma Faweleristica da espécie (Quadro 4.3). Na maioria das bastérine fitopatogénicas, 0 PG varia de 20 a 60 minutos Teoricamente, a reprodugio por fissio levaria a um aumento de populagao, em que 0 nimero de individuos aumentaria em progressio. geomnétrion de Fezio 2, em fungdo do tempo. Em outras palavras, sob condigdes ideais de temperatura, aeragao, nutrigao etc., 0 niimero de individuos dobraria a cada periodo de geragio (Figura 4.3)Baciérias fitopatogenica, 94 geragio (PG) de algumas especies Quadro 43 Perfodo ees nuticfonals Gtimas e emma bacteriana Iiquido, sob agit Temperatura | Perfodo de geragao (horas) teria a ‘chia colt 40°C ee Bacillus subtilis 40°C i Pseudomonas putida | 30°C os Nitrobacter agilis 2 Fonte: adapta de Stanier et. (1986). ai a lula Figura 4.3 - Perfodo de geragio - tempo necessdrio para uma cél a bacteriana originar duas eélulas-filhas. fn clei ei, que sve inclusive pa liner Imes Helene ee baste pose dese malipiems, un Glen bars om PG igual @ 20 minutos, & qual fossem propiciadas todas condigdes ideais, apds 48 horas, originaria uma biomassa ae 4.000 vezes o peso da terra (STANIER et al., 1986). Obv a Jsso no acontece, pelo menos com a dramaticidade do rout Supramencionado. Primeiramente porque o meio onde ae cresce exaure-se rapidamente em nutrientes. Em segundo bactérias exeretam, no meio, substincias t6xicas a elas proprias. a Suponhamos que uma célula bacteriana vidvel seja trae Para um frasco contendo meio de cultura ideal e que este frasc dea ‘cubado sob condigdes érimas de temperatura, aeragao etc. € es ermine, a diferentes intervalos de tempe, o niimero de ¢ parteranas presentesnesse mesmo fiasco. A dindmica da populagdo ppresentard padrio semelhante 20 da curva hipotética mectada vo Figura 4.4. Nesta curva, as principais fases seria Ae cmatiodo chamado lg fas, fase de laténcia ou de adaptagao. O crescimento, quando ocorte, nio & balanceado, e esse €o periods exe {ue Pequena populagdo baeteriana procura se adaptar ao hove mein Produzir enzimas ete. BC = Fase loguritmica ou exponencial de crescimento, Nesta fase, a muliplicagio ocorre com velocidade maxima e, teoricamente’ a opulago dobra a cada perfodo de geragio, CD = Fase estaciondris. O nimero de eélulas vidveis permanece mais Cu menos constante, A multiplicago, na qualidade, nfo cessa, mas Iiimero de eélulas que nascem € equivalente a0 de célulay que ‘morrem. Como o nimero de células vidveis permanece constante, tte Se a impressio errénea de que a multiplicagio cessou, A’ face estacionaria coincide com o inicio de exaustao do meio em nutrientes € Com o inicio também do actimulo de secregdes tixicas no meio, DE = Fase de morte ou declinio. Também é exponencial ou logariimica, Nesta fase, o mimero de células vidveis deeresce rapidameate, pois 0 numero de eélulas que morre é bem maior que o daquelas que se dividem. Além da exaustio do meio em nutrientes, 0 acumulo de substiincias téxicas tora a multiplicagio cada ver mais lenta 7 2 ~\ g e a A Tempo Figura 4.4 - Curva tipica de erescimento de uma bactéria, em meio liquido de cultura, mostrando as fases tipicas. eS tae96, Do ponto de vista fitopatolégico, hi grande interesse em se compreender como buctérias se multiplicam ou se reproduzem, Primciramente, o pesquisador earece de conhecer 0s prineipios que governam essa multiplicago para que possa eficientemente cultivar Fitobaetécia com que tabalha e preparar inéculo para testes de inoculagay autificial. Além disso, a compreensio da velocidade de multiplicagio de bactérias explica a facilidade com que o potencial de inéculo aumenta no campo, ocasionando surtos epidémicos ¢ dificultando sobremodo adogdo de medidas de controle que sejam eficientes, em tempo habil. Por tiltimo, ¢ interessante observar que a dinamica da populagéo de uma fitobactéria multiplicando-se nos tecidos da planta é em tudo semelhante 4 da mesma bactéria multiplicando-se in vitro, em meio adequado de cultura, Embora escape ao objetivo deste trabalho a metodologia empregivel para se investigar e quantificar a populagio de uma fitobactéria multiplicando-se nos tecidos da planta hospedeira, essa metodologia € muito simples ¢ executada quase como rotina, quando necessiria. A titulo de exemplo, na Figura 4.5 esti a curva de crescimento de Pseudomonas syringae py. garcae, agente etiolégico da mancha aureolada do cafeeiro, nos tecidos da folha do hospedeiro, em fungio do tempo. As fases de adaptagao (fase "Iag"), exponencial, estaciondria e de morte podem ser visualizadas. Moa 296 120 Horas ap6s a inoculagio Fonte: adaptado de Oliveira eta. (1991). Figura 4.5 - Curva de crescimento de P. syringae pv. garcae em tecidos de folha de cafeeiro, artficialmente inoculados. 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