a CEILS LSD ae, 44 : - Replicagao, organizagao e expressio génica R. B. Medeiros 8.1 Virus de RNA de senso positivo O RNA é a tinica biomolécula capaz de apresentar, ao mesmo tempo, atividade enzimatica (na forma de ribozimas), e também codificar informagio genética. Portanto,o RNA deve ter tido um papel fundamental na evolucao da vida (ver capitulo 2). Assim, o estudo da replicagio do RNA, utilizando-se os virus que possuem este tipo de genoma, pode levar nao somente a descoberta de meios de controle de viroses, mas também pode oferecer importantes respostas para 0 melhor entendimento da origem das biomoléculas, das células e da propria vida. Os virus de RNA de senso positive sio assim chamados por possuirem RNAs que sio reconhecidos pela célula diretamente como RNA mensageiros (mRNAs), ou seja, so fraduzidos para proteina diretamente pelos ribossomos celulares. Em outras palavras, as sequéncias de nucleotideos contidas no RNA viral correspondem diretamente as sequéncias de aminodcidos das proteinas virais. Ja nos virus de RNA de senso negativo, o RNA gendmico (viral) é uma cépia complementar ao mRNA viral, portanto, nesses virus, o RNA. viral precisa ser inicialmente franscrito (copiado para mRNA), para que entdo as proteinas virais possam ser sintetizadas pelos ribossomos. Assim, tais virus (senso negative) precisam trazer sua polimerase inserida CAPETULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 219ue éaenzima responsdvel pela replicacio e trans: fut épi a Ca emos no proximo topico. Os virus de RNA i . i le precisam trazer sua polimerase insey da nm na particula viral, q do RNA viral, como vel senso positivo, entretanto, nao particula. Em linhas gerais, 0 process de repli da seguinte forma: ao entrar na célula o RNA € quase que imediatament desencapsidado, os genes do virus sao reconhecidos e traduzidos pele intética celular: ribossomos, tRNAs ¢ aminoécidog icagao desse tipo de virus oto s maquinaria bil A seguiras proteinasviraisenvolvidas na replicagio (em alguns casosapena uma tinica polimerase viral, em outros casos duas ou mais protefnas virais) recrutam o RNA viral e associam-se a proteinas da célula (proteinas ds | hospedeira utilizadas pelo virus), formando o complexo replicativo,em geral em estruturas associadas as membranas celulares. O complexo replicativo produz entio as fitas de RNA complementares & fita do genoma do virus, que sao usadas como molde para a sintese de novas fitas de RNA viral (gen6mico), a qual é mais tarde, por sua vez, encapsidada, formando novs particulas do virus (Figura 8.1). Clones infecciosos, que sio importantes ferramentas experimentais utilizadas no estudo molecular dos virus, podem ser obtidos partir do RNA genémico com relativa facilidade, por meio da produsio de fitas de cDNA (que significa DNA complementar) a partir do RNA viral, utilizando-se em reagdes de laboratério a enzima transcriptas reversa (que sintetiza DNA a partir de RNA). A partir destes CDNAS transcritos infecciosos sio produzidos por transcrigdo in vitro, usando 4 enzima RNA polimerase II (que sintetiza RNA a partir de DNA). Tais clones infecciosos podem ser manipulados em laboratétis por meio de técnicas moleculares de mutagénese, por exemplo® | as muutagdes inseridas nos genes virais podem acabar permitind?* | identificagao da fungio de cada gene viral, assim como, as sequen de nucleotideos mais importantes, Por causa dessa relativa Sule a fe Sones infecciosos, resultante do tipo de ser | eee nto molecular sobre os virus de RNA de Positivo é bem maior do que aquele sobre os virus de senso negative 220 | viRoL | OGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classiicagio e controle ee gdVirus de RNAC+) 24 Ci ~ Réerutamento da fila molde ‘Capa proteica Act o— Montage! de novas partictlAs seta ee Sintese da fita positiva Figura 8.1 — Ciclo replicativo dos virus de RNA de senso positivo Diferentes dominios da polimerase e diferentes proteinas estao envolvidas conjuntamente no processo replicativo, desempenhando as fungées de (Figura 8.3): + Helicase, altera a conformagio e estrutura do RNA. + Metiltransferase, transfere grupos metil para o RNA. + Protease, cliva o RNA. + Polimerase em si, também chamada replicase, sintetiza a nova fita. Em outras palavras, para determinados virus a polimerase contém a maioria das fungGes necessirias para a replicago viral contida em uma s6 protefna, para outros virus cada proteina envolvida no processo desempenha uma fungio especifica. Como exemplos: para os Pofyvirus, Comovirus e Luteovirus, por exemplo, a proteina viral adicional envolvida na replicagao e tradugao é VPg (sigla para Viral Protein genome-linked), que nao contém os dominios acima ¢ parece desempenhar uma fungio CAPITULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZAGKO E EXPRESSAO GENICA | 221 EE llr rrr™rLr™r™—Lr™rr™r™—hrT rr r——™—r———_——Dcstrutural, igando-se & regio amino terminal dos RNAS genémicg« complementar, e servindo de primer para o inicio da replicacio, Para o, Potyvirus a proteina da inclusio citoplasmética também esta envoyig, na replicagio. Figura 8.2 ~Tipos de genomas de virus de planta Para este tipo de virus (RNA de senso positive) a decapsidacio ¢ cotraducional, ou seja, corre a0 mesmo tempo que o RNA é tradusido, € a capa protcica nao participa de processos enziméticos. Fatores in i (va mesma molécula de RNA) e in erans (em moléculas diferentes) estio. envolvidos na replicagao. 0 RNA viral é, portanto, molde para todos os seguintes processos: + Decapsidagao. + Tradugéo. + Sintese da fta negativ + Bneapsidagte, coats eee ee Figura 8.3 — Dominios encontrados nas polimerases de virus de planta: met" “transferase (M7), helicase (Hel) ¢ polimerase (Pel) ' 222 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos,cassncacdo e controle© RNA complementar, que € a cépia do RNA gendmico (e também chamado fita negativa) é 0 molde para a sintese da fita positiva (Figura 8.1, 8.4 € 8.5). Todos esses processos, selecionados evolutivamente, sao regulados criteriosamente. Qualquer desbalango pode provocar uma interrupgdo na replicagdo e, consequentemente, no processo infectivo, Tradugao (produgao de proteinas) e sintese da fita negativa (a partir da fita positiva), ocorrem separadamente ria molécula de RNA, senao haveria choque dos complexos enzimiticos (ribossomo e polimerase), j4 que ocorrem em sentido contrario no RNA. Os virus de RNA de senso positivo tém sido divididos entre aqueles da superfamilia ipo-picornavirus e os da superfamilia tipo- alfavirus (Figura 8.4 ¢ 8.5). sic annananaan 3’ (RNA genémico) {replicase 3. (RNA complementar) | replicase so aananannand’ (MRNA progenia) Figura 8.4 — Diagrama da replicagio de virus de RNA de senso positivo, su- perfamilia tipo-picornavirus A tradugao pelos ribossomos ocorre no sentido se ateplicagio 2 —S corre no sentido 3’5’. Esta regulacdo e a separagao desses processos na molécula de RNA, ocorre, principalmente, pela formagio e interacao entre estruturas secundarias na molécula de RNA, ¢ interagées entre €ssas estruturas o complexo de replicacao, principalmente a polimerase do virus (Figura 8.6). Como a polimerase viral pode fazer varias cépias do RNA a partir de uma tnica molécula molde, em pouco tempo hé um excesso de fitas de RNA positivo. CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 223= ian (RNA genic) ~ 2 ees 5) (RNA complementar) : 1 transcriptase replicase a 3! (mRNA subgendmico) snnsannand (MRNA progenia) srr ——_———__] D ode virus de RNA de senso positivo, 4. Figura 8.5 — Diagrama da replicaga r > a amilia sipo-alfavirus. ‘As fungées replicase € transcriptase so, em gera) perf ung ma proteina viral condutidas pela mesn utilizado pelos virus, este um mecanismo ui para a separagao desses dois processos, icagdo viral no interior de membranas Outro mecanismo geral, e que também contrib & a compartimentalizagio da rep! intracelulares (mais detalhes abaixo). A replicagdo é altamente especifica, RNAs celulares nao sio reconhecidos pelas polimerases virais, e vice-versa, ¢ a replicagao sempre ocorre associada & membranas celulares, que podem ser parte do reticulo endoplasmatico, complexo de Golgi, mitocéndria, ou mesmo membranas nucleares. O excesso de fitas de RNA positivo, na razo de 50-100 vezes mais do que fitas de RNA negativo, é causado pelo fato dessas serem as fitas gen6micas, que inserem mecanismos selecionados evolutivamente que resultam em uma maior taxa de sintese, e serem aquelas utilizadas na montagem das particulas, e as fitas negativas servirem apenas paraa sintese da fita positiva. 224 | vIROL | OGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, Classificacao e controleFigura 8.6 - Regulacio da expressio génica e replicacao de virus de RNA posi- tivo: (A) RNAs decapsidados s4o expostos na célula, (B) estruturas secundarias no terminal amino (5’) séo reconhecidas pelos ribossomos, que comegam a traduzir as proteinas virais, (C) os genes virais (4 e B) sio separados por outra estrutura secundaria, também reconhecida pelos ribossomos (frameshifi), (D) a polimerase do virus, agora jé presente em quantidades razodveis, reconhece a estrutura secundaria no terminal carboxi (3) ¢ inicia a sintese da fita negativa, (E) a polimerase desfaz a estrutura existente no inicio do gene B, ribossomos nao reconhecem mais o RNA nesta posigio, e portanto cessam a tradugio do gene B, (F) a polimerase prossegue no fita molde ¢ rompe a estrutura presente no terminal amino (5’), por complementaridade na sequéncia, 0 que impede 0s ribossomos de reconhecerem também o gene A, assim a polimerase pode finalizar a sintese da fita negativa, pois esta encontra-se livre de ribossomos A interagao das protefnas virais envolvidas na replicagio com proteinas da célula hospedeira parece exercer um papel crucial na especificidade da replicagao de virus de RNA positivo. E possivel obter- se a replicagio do RNA viral em condigoes de laboratério, in vitro, adicionando-sea(s) protefna(s) virais (polimerase e auxiliares) purificadas 20 RNA viral (isolado), além de uma solugio-tampio adequada nucleotideos, Entretanto, tais reagoes in vitro sempre mostram-se pouco especificas, pouco eficientes (apenas pedagos do RNA sao replicados) e 0s mecanismos de iniciagao da replicagao mostram-se falhos. CAPETULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 225,Por isso, acredita-se que a fungio dos fatores da hospedeira que auxiliam na replicagdo do virus esteja relacionada & especificidade qe reconhecimento do RNA viral & eficiéncia da reagao, talvez por meio da alteragio da estrutura do RNA ou no recrutamento do complex replicative ao sitio celular apropriado a replicacdo. Reacées in vit, apresentam melhores resultados quando extratos celulares so adicionados e ensaios de replicaggo do RNA s6 so perfeitos quando utilizam-se a propria hospedeira do virus ou culturas de células de tal hospedcira Para os virus de plantas, estas seriam as culturas de protoplastos. Diversas proteinas de plantas hospedeiras que auxiliam na replicagio viral tém sido identificadas, sempre encontradas fisicamente associadas aos complexos de replicacao do virus. Alguns exemplos estao listados a seguir e exemplos adicionais estio listados nos préximos pardgrafos: * Complexos enziméticos de replicagio viral contendo até dez diferentes proteinas tem sido extraidos de células infectadas com BMV, destas apenas duas sendo virais, 1a ¢ 2a (NOUEIRY; AHLQUIST, 2003). + A replicase do Tomato bushy stunt virus — TBSV (género Tombusvirus), chamada p92”, interage e requer a Heat shock protein 70 (Hsp70) para sua atividade (POGANY ET AL. 2008). Hsp70 e outras chaperonas do grupo também estio envolvidas na replicagao de diversos virus humanos, incluindo HIV, HBV, HCV e Influenza. Tom1/2, proteinas da membrana de tonoplastos em Arabidopsis, que interagem com 0 dominio de helicase 42 replicase do TMV (OHSHIMA ET AL., 1998). O primeiro evento na sintese de uma nova fita de RNA, @pés seu reconhecimento pelo complexo replicativo, é chamado reagio iniciasao da cadeia, significando a formagio de uma ligagao fosfodiét” entre o primeiro € o segundo nucleotideos da nova fita. Para que Teaso ocorra muitas vezes os virus de RNA utilizam-se de determinad’s 226 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, Classificagao e controleestruturas que servem de primers para a reagao. O exemplo principal para este grupo de virus ja foi dado anteriormente: os Potywirus utilizam-se da VP¢ para tal fungao. O segundo evento na sintese da nova fita éa reagio de elongamento da cadeia, ou seja, a continuidade da sintese. Evidéncias experimentais vindas de virus diferentes indicam haver mudangas na estrutura secundaria do RNA, que fariam com que 0 complexo replicativo torne- se mais estavelmente ligado a fita molde. Outros fatores que parecem contribuir sio a formagao de complexos oligoméricos ou multiméricos da polimerase (varias cdpias da polimerase so comumente encontradas nos complexos replicativos) e o recrutamento de fatores de auxilio da hospedeira, como mencionado acima. No caso dos virus do tipo dsRNA (RNA de fita dupla, como os Reovirus), a replicase também € carregada dentro da particula viral, e \ a sintese da fita positiva a partir da negativa, e vice-versa, é realizada dentro da particula, tao logo o virus entra na célula. A traducio das fitas positivas € realizada posteriormente e entio a replicase é incorporada as novas particulas virais (Figura 8.7). uD [rotease ow 3 (RNA genémico, progenia) Figura 8.7 ~ Diagrama da replicagio de virus de RNA de fita dupla (dsR- NA). As fungées replicase ¢ transcriptase sio, em geral, conduzidas pela mesma proteina viral Além do complexo de replicago, determinadas estruturas do RNA Viral sio essenciais para que 0 processo ocorra, como jé mencionado. Sequéncias do RNA capaz “ccrutar 0s complexos de replicagio ¢ tradusio, ¢ estruturas do tipo de formar estruturas secundarias ¢ ‘RNA no terminal carboxi da fita de RNA, por exemplo, servem como CAPITULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZAGAO E EXPRESSAO GENICA | 227228 promotores da sintese de RNA negativo, — essenciais Para a ligacay do complexo replicative ao RNA. Estudos pioneiros com o bacteriofagy Qbeta determinaram a existéncia € a importancia dessas estruturas no RNA viral. O uso de moléculas que interfiram na estrutura secundéria do RNA viral ja tem sido testado e representa uma estratégia adiciona para o controle de viroses via interferéncia na replicacao. Figura 8.8 - Mecanismos de expresso génica: RNA celular contendo a es- trutura cap no terminal amino (5°) é reconhecido pelos fatores de iniciacio da tradusio celulares, PABP reconhece ¢ ligase & cauda poli (A), elFA4E liga-se a estrutura cap, elF4d é uma helicase No mRNA celular a tradusio € iniciada por meio da ligacio dos chamados fatores de iniciagao da tradugao (proteinas como PABP, o1F3, eIF4d, elF4E, elF4G ¢ outras), que ligam-se a cauda poli (A),via PABP, que fica no terminal carboxi do mRNA, e & estrutura chamada ‘ap (que é um grupo metil adicionado a GTP, para a qual usa-se 0 simbolo m’GpppN), localizada no terminal amino, resultando numa conformasio circular do mRNA, que associa-se aos ribossomos ¢ é necessaria & tradusio deste (Figura 8,8). Polimerases de um grande numero de virus de ssRNA Positivo, visto que esses sio muito similares aos mRNA celulares, ligam-se ¢ requerem fatores de iniciaya? da tradusao da célula hospedeira Para a sua replicagao (Tabela 8.1). VIROLOGIA ‘ { VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificagéo e controleTabela 8.1 — Exemplos de virus, fator de iniciagao da tradugao envolvido hospedeira na qual tal associagio foi encontrada Tia For denice da Wadugis | Hope man 73 Coad mV of Corte cw a alg Tv rE Abit BY RE Cap TE io Abi “ieee Cm Ti BP Tino ne a6 ais atv | artione Anis *BaYMV: Barley yellow mosaic virus, BMV: Brome mosaic virus, CMV: Cucumber mosaic virus, LMV: Lettuce mosaic virus, PVY: Potato virus ¥, TEV: Tobacco etch virus, TMV: Tobacca mosaic virus e TuMV: Turnip mosaic virus No caso do TMY, existe uma sequéncia chamada 6mega no terminal amino do RNA viral, que provoca um aumento na traducdo do RNA em até trés vezes, e que recruta o elF4F, requerido para a iniciagio da traducao. Entretanto, virus de plantas evoluiram utilizando uma variedade de estruturas para esta funcao. Luteovirus (como BYDV) e Carmovirus, por exemplo, nao possuem estrutura cap ou cauda poli(A), € utilizam apenas estruturas secundarias do seu RNA (estrutura do tipo caule, algumas com a sequéncia GGAUCCUGGGAAACAGG), para unir as regides carboxi ¢ amino terminais do RNA viral (também chamadas regides UTR), além de sequéncias complementares a0 rRNA 18S (0 mesmo acontece com varios Tombusvirus). Potyvirus, Bymovirus e Comovirus sao exemplos dos que possuem cauda poli(A) e VPg, mas nfo estrutura ‘ap, enquanto que Tobamovirus ¢ Cucumovirus apresentam estrutura cap, mas nfo cauda poli(A) (Figura 8.9). CAPITULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 229B % A Figura 8.9 ~ Estrategia de aproximagio dos terminais carboxi (3) ¢ amino (5) nos RNAs de Thonip mosaic virus ~TuMV (A) ¢ Barly yellow dwarf virus BYDY (B) Em todos os virus de RNA de senso positivo j estudados quanto 20 sitio celular de replicagdo, ou seja, 0 local especifico dentro da célula na qual ocorre a replicacio do virus, incluindo nisso os virus de plantas, animais,¢ humanos, foi observado que a replicago ocorre no interior de membranas intracelulares, como mencionado acima. De fato a replicagao acontece em invaginagées globulares oriundas dessas membranas intracelulares. Para o BMV (Brome mosaic virus), um dos virus para o qual conhecem-se mais detalhes em relagio aos mecanismos de replicacio, mostrou-se que essas invaginagdes server como compartimentos, OU miniorganelas, para a replicacio do RNA, e que a estrutura, formacio ¢ fungio dessas miniorganelas tem muitas similaridades com os polos de replicagao de Retrovirus e de virus de RNA de fita dupla, ou seja, parecem ser caracteristicas bastante abrangentes, mesmo para grupos de virus tio diversos. Nocasodo BMV foidemonstrado que taisinvaginagdes globulares podem ser induzidas pela expressio da proteina Lado virus, sugerindo qu a simples expresso dessa proteina viral desencadeia a formagio desses parma mens nal por meio, provavelmente, da ae je a rana da oe Mecanismos simu : s devem ser utilizados por outros vit 230 | VIR | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, Classificagio e controle agO formato de tais invaginagées varia pouco: vesiculas individuais ou agrupadas, que nao estio completamente fechadas, formadas por membranas duplas, as vezes achatadas, como observado com 0 BMV ¢ com os Tombusvirus, entre os virus de plantas, e também observado para inimeros virus humanos da superfamilia dos virus Tipo-Alfavirus. O tamanho dessas vesiculas varia de 70-100 nm em diametro, e em geral acumulam-se na regiao perinuclear. O acesso ao citoplasma acontece via um orificio formando um tipo de pescoso nas vesiculas. Além de prover um ambiente celular estivel e especializado para a replicagao viral, acredita-se que tais vesiculas também protejam o virus, até um certo ponto, do sistema de defesa da hospedeira, ‘As capas proteicas virais, além de encapsidarem 0 genoma do virus, também esto envolvidas diretamente na regulacao da expresso génica viral (Figura 8.10). A expresso da capa proteica do BMV a um determinado nivel estimula o acimulo de RNA viral, enquanto niveis mais altos de expressio inibem a tradugao celular e replicagdo do RNA viral. A traducao celular é regulada, entre outras coisas, por uma sequéncia no RNA chamada caixa B, que € critica para a montagem do complexo de replicagao. jese de acide nucléico Proteinas tardias ticluas virais Proteinas iniciais sad ate Quantidade Tempo InfecSio (T=0) Figura 8.10 - Regulagao da expressio génica CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 231ca do BMV também liga-se preferencialmente a um, secuiéncia no RNA chamada SLC, que contém 0 promotor central para = : . a sintese da fita de RNA negativa, Para elucidar em maiores detalhes s ‘um grupo de pesquisadores usou uma interacio entre RNA e capa proteica, ; técnica conhecida como cross-linking-peptide fingerprinting (algo com identificagio via ligagao peptidica). Esta técnica Pee a identificacao de peptideos (grupo pequeno de aminoacidos) no capsideo que encontram-se em contato direto coma SLC. Mutagdes nessa regiao levou a modificacées nas taxas de acumulagao de RNA viral (YI ET AL., 2009). Outra questio central em relagdo & replicacao aos virus de RNA positivo € entender como a replicagio do RNA viral iniciada pela polimerase (que é do tipo RNA-dependent) no molde de RNA correto tsando o nucleotideo correto, na célula infectada.O AMV (Aifalfa mosaic airs) e espécies de Iarvirus sio exemplos atipicos de virus de RNA de senso positivo e seus RNAs sfo replicados apenas na presenga da capa proteica. Também diferem de outros membros da familia Bromoviridae porque nao possuem a estrutura do tipo tRNA (TLS) no terminal A capa protei carboxi. A capa proteica € necessdria e suficiente (um termo bastante utilizado em biologia molecular, e portanto em virologia, para ressaltar a importincia crucial de um determinada estrutura ou componente) para o recrutamento da replicase. A indugao da organizacaio estrutural do terminal carboxi do RNA do AMV pela capa proteica parece ter uma fungao homéloga a estrutura do tipo ¢RNA, permitindo portanto, 0 reconhecimento especifico do RNA pela RNA polimerase RNA-dependent ‘A capa proteica liga-se especificamente 4 regido do terminal carboxi nao-traduzivel (também denominada 3’ UTRs), encontrada nos quatro segmentos de RNA do AMV e muda a estrutura do RNA. Esta regiéo contém 180 nucleotideos, formando estruturas secundarias do tipo Aairpin (formato de grampo de cabelo), com seis diferentes hairpins separados por sequéncias repetidas de AUGC. O terminal amino (5) da capa proteica contém uma sequéncia Pro-Tbr-x-Arg-Ser-x-*- Ty" (PTRSxxY), que 6 0 dominio conservado de ligagao ao RNA (em AMV e Ilarvirus).O RNA de AMY é infeccioso apenas quando contém a capt 232 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificagéo e controleproteica ligada ao seu terminal carboxi (3’). Estudos estruturais utilizando o RNA € 0 capsideo cristalizados mostraram que ambas estas regides dobram-se quando estio interagindo (GUOGAS ET AL, 2004). Umas das estratégias de regulacio da expressio génica mais comuns em virus de ssRNA de senso positivo é a chamada leitura do tipo read-through (termo que pode ser traduzido como /eitura continua), que caracteriza-se pela presenga de um cédon fraco de terminagdo da tradugao (Figura 8.11). No caso do TMV os ribossomos celulares terminam a sintese do polipeptideo viral com uma frequéncia de 95% das vezes neste determinado cédon, mas visto que esse tem uma capacidade de terminagéo fraca, os ribossomos continuam a tradugio a partir deste ponto em 5% das vezes, resultando na formagao de um polipeptideo viral maior e, portanto, diferente. No caso do TMV este polipeptideo maior é justamente a sua polimerase, a qual o virus nio necessita em grandes quantidades (comparando-se com a capa proteica). Genoma viral Proteinal Figura 8.11 — Presenga de um cédon fraco de terminagio (UGA) resulta na sintese de uma segunda proteina (read-through ou leitura continua) CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 233de regulagio génica comum nos Virus de sensy poliproteinas (Figura 8.12), caracteristicg idae ¢ Tymoviridae. Neste caso o5 Outra estratégia positivo & o processamento de marcante das espécies de Pofyvir a partir do RNA viral, uma tnica poliproteing na qual um dos componentes & uma protease (enzima), capaz de autoclivagem e clivagem das demais proteinas virais, liberando na célula as varias proteinas individuais do virus. —$§.." viral -Poliproteina meee a | | | Proteinas finais | | BOR LOO Figura 8.12 ~ Processamento de poliproteinas ribossomos traduzem, Uma estratégia adicional de regulacao génica comum nos virus de senso positivo é 0 chamado frameshift (Figura 8.13), onde, em resposta 2 sinais no mRNA (em geral estruturas secundarias) 0 ribossomo move-s¢ para uma ORF diferente ¢ continua a tradugao, gerando uma proteina diferente da original. Constitui-se em um mecanismo de regulagio extremamente raro em eucariotos, 234 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificacdo e controle 4.-TTAAUG TTC CGC GGAATT TIT GCG TAG CGT GCC GCT TAA... ORF ..TTAAUG TTC CGC GGAATT TIT G CGT AGC GTGCCG CTT AAG,.. ORF Genoma viral Protea I (estrutura ) | Proteina (estrutura 2) Proteina2 (estiutura 2!) Figura 8.13 ~ Frameshift: neste exemplo ao invés do cédon GCG 0 cédon CGT é lido pelos ribossomos Outra estratégia adicional de regulagao génica comum nos virus de senso positivo € a utilizagao de sitios internos de entrada dos ribossomos (IRES) (Figara 8.14), em que um mesmo mRNA produz mais de uma proteina a partir do reconhecimento de mais de um sitio de ligaco ao ribossomo, que sao regides relativamente conservadas (em bactérias chamada regitio Shine-Delgarno). A tradugio dependente de terminal 5’ livre foi antes imaginada ser a tinica possivel. IRES os ae 3°mRNA viral nbovono | | | | Proteina2 Proteina Figura 8.14 — Sitios internos de entrada dos ribossomos (IRES) CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 235,8.1.1 Estrutura tercidria do RNA Como ja mencionado RNA. viral é molde para diferentes, ¢ mutuamente exclusivas, reagdes na célula hospedeira, que sio traducig ¢ replicagao. Tais processos sio finamente regulados. O RNA que infecta a célula precisa regular a quantidade de proteina viral traduzida, controlando quando uma certa quantidade suficiente da polimerase ¢ produzida, reduzindo entio sua tradugio a partir de um dado momento, para que as poucas cépias da polimerase passem entao a fazer miltiplas cOpias da fita complementar, e posteriormente, ¢ a partir desta, da fita gendmica, quando uma nova fase é iniciada, com a montagem das novas particulas. Além das estruturas secundarias simples mencionadas (cap hairpins, UTRs, tRNAs), 0 RNA viral forma estruturas tercidrias complexas, tridimensionais, maiores em tamanho, que exercem papel fundamental na regulagao de todos 08 estégios do ciclo infectivo do RNA viral. Além disso, diferentes estruturas tercidrias precisam ser formadas na molécula de RNA durante esses processos regulatérios, ¢ portanto, o RNA viral precisa apresentar uma certa plasticidade estrutural, ou seja, uma certa facilidade em assumir diferentes estruturas tercidrias em diferentes momentos do seu ciclo infectivo. Adicionalmente, a estrutura tercidria do RNA viral pode ser prevista a partir da estrutura priméria (a sequéncia de nucleotideos), por meio do uso de programas de computador que incorporaram, para cada grupo de virus, os respectivos dados estruturais obtidos experimentalmente, via cristalografia de raio-X ou por métodos bioquimicos. Como exemplo ilustrativo tomemos 0 Turnip crinkle virus (TCV), O TCV € outros membros dos Carmovirus (Tombusviridae) estio entte 0s menores virus de ssRNA de senso positivo. O TCV é encontrado associado a um virus satélite, chamado sa¢(, que é parcialmente derivado do genoma do TCV. Os Carmovirus tem a capacidade de formar varias estruturas distintas nos seus terminais carboxi, todas com fungdes "™ replicagio e/ou tradugao. 236 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificagao e controleUna dessas estruturas, também de formato tipo Aairpin, porém de maior tamanho, chamada Pr, foi identificada como o promotor para a sintese da fita negativa, ou seja, €o local em que a polimerase liga-se inicialmente ao RNA positivo para o inicio da replicagao da fita negativa. Essa estrutura foi encontrada primeito no safC, o que ajudou na sua identificagao no RNA do TCV. Diretamente acima da Pr de praticamente todos os membros da familia Tombusviridae encontra-se uma estrutura semelhante, chamada H5, que € critica para o actimulo de RNA viral, E acima de HS encontra-se uma estrutura do tipo Aairpin/pseudoknot (grampo/né false), chamada H4a/ H4b,requerida tanto para a replicago quanto para a tradugao do RNA viral (SIMON; GEHRKE, 2009). Estruturas ter que acabam substituindo a tradicional estrutura cap dos eucariotos, si0 elementos tinicos de virus de plantas. As estruturas até agora conhecidas podem ser classificadas em trés categorias: ias no terminal carboxi, * Tipo caule (longa e larga): Satellite tobacco necrosis virus, que serve como dominio de aumento da tradugio. + Tipo caule multiple: Luteovirus, Dianthovirus e Necrovirus. + Tipo galho: Tombusviridae. 8.2 Virus de RNA de senso negativo Os virus de RNA de senso negative, como um todo, também apresentam algumas caracteristicas comuns. Nao sio_traduziveis diretamente pelos ribossomos, precisam ser inicialmente copiados para as fitas de mRNAs (via ¢ranscrigdo), para estes serem entio traduzidos, Ou seja, a transcrigdéo & 0 primeito processo enzimatico do ciclo de replicagao desses virus. Precisam, portanto, carregar a polimerase (ou replicase), que é a enzima também responsavel pela transcrigao, dentro da particula. O genoma do virus é, portanto, complementar aos mRNAs Virais. Portanto, os RNAs desses virus nfo sao diretamente infecciosos € 0 processo_replicativo ocorre via uma fita de RNA intermediério, positiva, distinta dos mRNAs virais (Figura 8.15a 8.17). CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 237Além da polimerase viral, chamada L para todos os virus de RNA de senso negativo, a capa proteica (chamada N) € necessiria ag processo de replicagao € forma um complexo ribonucleoprotéico (RNP) la hospedeira ¢ com 0 RNA viral, com polimerase, com proteinas d turas secundarias no RNA viral, aparentemente desfazendo as estrul Os mRNAs virais sto encontrados nas células infectadas para cada uum dos genes virais. RNPs também sao necessarios para o processo de transcrigio, e os mRNAs possuem una estrutura cap e, em pelo menos alguns casos, cauda poli(A), isto é, s40 poliadenilados. : Tais estruturas esto relacionadas com a iniciagdo da tradugao e coma estabilidade domRNA.O capsideo (NM) também parece regular o mecanismo de troca de transcri¢do para replicacao, por meio de ligago aos promotores dos genes. As espécies de virus pertencentes a esse grupo também possuem hairpins (estraturas secundérias no RNA) para terminagao da transcricio, ocalizados na regides intergénicas. Cada proteina, portanto, é expressa em mRNAs chamados subgendmices, que so complementares € menores que os RNAs genémicos, e codificam um tinico gene. ‘Virus de RNAG) Fi -E nso nega ‘igura 8.15 ~ Esquema de um ciclo replicativo dos virus de RNA de " se : 238 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classifica fo e controle /EGET 7 , classificacdOs Tespovirus ilustram os virus de ambisenso ¢ de genoma segmentado de virus (da familia Bunyaviridae) segmentos (L,M e §) de ssRNA. RNA de senso negativo/ (Figuras 8.16 ¢ 8.17). Esse grupo oo paacannrannn 3 (mRNA) 5 T transcriptase ————— 5 IRNA genémico) 7 Y rey licase 8 e 3 (RNA complementar) . 4 replics 3 _APIESSE _ 5'(RNA genémicoprogenia) Figura 8.16 ~ Diagrama da replicagio de virus de RNA senso negativo/seg- mentado. As fungoes replicase © ransriptasesio, em geral, conduzidas pela ‘mesma protena vial O RNAL (senso negativo, cerca de 8.9 kb) codifca a polimer:se viral (Z), com cerca de 300 kDa de tamanho (o que dificulta bastante sua clonagem e o seu estudo molecular). RNA-M (cerca de 5.4 kb, ambisenso) codifica 0 precursor das glicoproteinas Gy ¢ G,, responsiveis pela transmissio por tripes vetores, ¢ a proteina nio-estrutural Sm, responsavel pelo movimento viral na planta. O RNA-S (cerca de 2.9 kb, ambisenso) codifica 0 nucleocapsideo N, responsével pela encapsidagio do acido nucleico viral ¢ também envolvido na replicago, e a proteiaa nlo-estrutural Ss, upressora do silenciamento génico. Os trés RNAs contém sequéncias conservadas de cerca de 60 nucleotideos, complementares e repetidas, nos seus terminais amino € carboxi, que, por serem complementares, hibridizam-se € resultam em uma conformagio semi-circular dos RNAs, chamada panbandle ou cabo de panela, que é essencial & replicagdo do RNA viral. Essa estrutura serve para ancorar a ligasio do complexo replicativo ao RNA. Ambos o RNA-M e RNAS servem de molde para a transcrigio de mRNAs subgendmicos e contém estruturas secundarias do tipo airpin na regiio CCAPETULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZACRO E EXPRESSHO GENICA | 239240 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classifi fo da transcrigao. Os trés RNAs intergénica, que servem para a terminag : também contém regides de 12-20 nucleotideos no terminal amino, que nao servem de molde para a replicagiio, mas que englobam a estruturg cap, requerida para transcrigao. gee (*) ()__ 3° (RNA genémico) fens replicase 5m 3 (mRNA) ae 6 3 3_0 (4) (RNA complementar) versio licase (mana) swt 3° |TPnCaS 5rcon 3° (RNA genémico, progenia) cop Figura 8.17 ~ Diagrama da replicagiio de virus de RNA ambisenso (parte po- sitivo e parte negativo). As fungdes replicase e transcriptase sao, em geral, conduzidas pela mesma proteina viral Apés a infecgio 0 complexo ribonucleoproteico (RNPs, que sdo os RNAs encapsidados por NV ¢ algumas cépias de L) é liberado no citoplasma. © nucleocapsideo N contribui para a replicagio de maneira estrutural e regulatéria, pois € requerido para a iniciagdo da replicagio e da transcrigao. Além disso N interage com as glicoproteinas na montagem da particula. Demonstrou-se que N forma dimeros que ligam-se preferencialmente a moléculas de ssRNA, mas no a dsRNA,¢ que mutantes de NV podem inibir fortemente a replicagio do virus. A polimerase L é uma proteina de tamanho considerivel ¢ contém 0 motivo SDD (Ser-Asp-Asp) no dominio da polimerase, encontrado nas RNA polimerases RNA-dependentes de todos os virus de senso negativo, além dos dominios de N'T’Pase, nuclease e helicase, sendo dese modo bastante similar as polimerases dos outros géneros da familia (com? Orthobunyavirus, Hantavirus ¢ Phlebovirus). A capacidade da polimerase icacdo € controleLem formar oligémeros tem sido documentada para muitos virus deste grupo, como também ocorre com os virus de RNA de senso positivo, Os RNPs servem de molde Para a transcrigio dos mRNAs virais, que neste caso nao sao poliadenilados, mas possuem estrutura cap & sequéncias heterogéneas capturadas de mRNAs da hospedeira, no seu terminal amino. Tais Sequéncias sio geradas por um Processo denominado cap-snatehing (captura de cap), no qual L. eliva cerca de 20 nucleotideos junto com a estrutura cap de mRNAs da hospedeira e os incorpora ao terminal amino do mRNA viral sintetizado. L também sintetiza os RNAs antigenémicos, que servem de molde para a cépia de RNAs gendmicos (KNIPPENBERG ET AL., 2005). Fatores da hospedeira, ainda em sua maior parte desconhecidos para 08 virus de sengo negstive, otic envalvidos em todos esses Processos, visto que estudos de replicacio e transcrigao desses virus in vitro demonstraram que extratos de células so necessdrios para que a replicagao € transcrigéo ocorra de modo eficiente. Um dos poucos exemplos especificos conhecidos, seja para virus de RNA de senso negativo de plantas, animais ou humanos, é um aparente fator de transcrig¢ao (chamado FoTF) do inseto vetor Frankliniella occidentalis, onde o virus também replica. Este fator de transcrigao foi clonado e identificado por apresentar afinidade pela polimerase L de TSWV, ¢ a simples expresso deste fator em linhagens celulares humanas tornou tais células 5 permissivas dinfeccao por TSWV (0 virus nao consegue entrar na célula, mas se introduzido na célula consegue replicar-se), 0 que indica, por exemplo, 0 quanto esses virus sdo préximos das outras espécies em outros géneros da familia Bunyaviridae que infectam humanos ¢ animais (MEDEIROS ET AL., 2005). Outro exemplo é a interacio da polimerase do Influenza virus com uma proteina humana denominada CLE, que também é um fator de transcrigao (HUARTE ET AL., 2001). Ja espécies de Rhabdovirus representam o grupo de virus de RNA de senso negativo nao-segmentado (Figura 8,18). Esses virus contém, de modo geral, pelo menos cinco genes em seu RNA, com sequéncias nao CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZAGAO E EXPRESSAO GENICA | 241e carboxi, chamadas leader (I) € trailer (2,na ordem conservada: 3-1-N,P,M,G,L- 1-5’, As regides intergénicas siio agrupadas em trés components, contendo uma sequéncia pali(U) no terminal carboxi de cada gene (elemento ‘), uma pequena sequéncia nao- traduzivel que separa cada gene (elemento II), e uma sequéncia conservada no inicio de cada gene subsequente (elemento II). A polimerase, também denominada L, com mais de 200 kDa d ligagio a RNA € de sintese de RNA, ¢ requer as proteinas N (capsideo) e P (fosfoproteina, ausente nos Tospovirus) para sua atividade. codificadoras nos terminais amino le tamanho, contém dominios de gee_3' peg’ 81022. 3 (MRNAS) Transcriptase : 3: ————_ 5 (RNA gendmico) replicase] 3—_—? (RNA complementar) Lrepticase 2 3—_S (RNA gendmico-progenia) Figura 8.18 - Diagrama da replicagao de virus de RNA senso negativo/nao- -segmentado. As fungdes replicase ¢ transcriptase sao, em geral, conduzidas pela ‘mesma proteina viral Como no caso dos Tospovirus, os mRNAs, um para cada gene, sio complementares ao genoma. Apésa entrada na célula o virus associa-se a0 reticulo endoplasmético para liberar os RNPs no citoplasma (alguns,como os do género Nucleorhabdovirus, movem-se para o nicleo). A transcrigao dos mRINAs virais é entdo iniciada, No caso dos nucleares esses mRNAs sfo exportados entio para o citoplasma, para que sejam traduzidos. ‘A acumulagio das proteinas Ne P regulam a sintese de mRNA € a sintese de RNA genémico e anti-genémico (complementat) Com o aumento na abundancia de Ne P, suficiente para encapsidat os RNAs genémicos sintetizados, inicia-se a sintese de RNA ante gendmico. A diminuigao nos niveis de Ne P livres, apés a encapsidagi0 da progenia, ativa novos ciclos de transcrigdio de mRNAs para rect"S* 242 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificacdo e controle —_ |da concentra¢ao de Ne P. Mais tarde a proteina M (matriz) associa-se aos RNPs formados (contendo RNA, NV, P ¢ L), formando estruturas enroladas e condensadas, que nao servem de molde para a transcri¢ao. Essas estruturas reconhecem sitios no reticulo endoplasmatico ocupados por G (glicoproteina) e a particula completa é entio formada. Para os virus de RNA de senso negativo a troca entre os processos enzimaticos de transcri¢io para replicacao é um ponto crucial no ciclo replicativo, visto quea transcrigo de mRNAs a partir do RNA genémico necessariamente tem que ocorrer primeiro, como mencionado acima. Os fatores que regulam esse processo dinamico de troca da atividade enzimatica da polimerase parecem ser: a composigao do complexo replicativo, com a ligago de fatores da hospedeira e participagio da capa proteica, como mencionado acima, e mudangas na estrutura do RNA, que permitem a polimerase evitar ou néo-reconhecer os sinais de terminagao da transcricao presentes na fita molde. O Influenza virus (Figura 8.19), pertencente aos Orthomyxoviridae, talvez, seja um dos virus de RNA de senso negativo mais importantes no mundo, em termos de satide publica, e portanto aquele em que, prova- velmente, mais recursos tem sido gastos em pesquisa ao longo dos anos, ec Mal a Figura 8.19 - Influenza virus, por microscopia eletronica de transmissio [Fon- te: Center for Disease Control -CDC/F. Murphy, Public Health Image Library (EUA); dominio publico} CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZAGAO E EXPRESSAO GENICA | 243Paralelamente o Vesicular stomatitis virus (VSV), que pertence familia Rhabdoviridae e que infecta principalmente animais, tem sido um importante modelo experimental. Muito do que esta descrito para outros virus de RNA negativo foi primeiro descoberto com 0 Influenza virus ou com 0 VSV, € depois confirmado pra outros virus de RNA de senso negativo. Uma estratégia de regulagao comum nos virus de senso negativo é a utilizagio de eédons fracos de iniciayio, que constitui-se na utilizao de diferentes AUG posicionados em diferentes ORFs, que sio ambos reconhecidos pelos ribossomos como cédons iniciadores, dessa forma produzindo mais de uma proteina de um mesmo gene (Figura 8.20) ‘AAUGTTCCGCGGAA...AUGTTGCGTAGCGTGCCGCTT. pe Genoma Proteinal | Figura 8.20 - Cédons fracos de iniciagao Outra estratégia de regulacio génica comum nos virus de senso negativo € a utilizagio de re-iniciagao (Figura 8.21). Neste caso, apos a terminacio da primeira ORF, o ribossomo continua a leitura até * proxima ORF, portanto ha uma regiao intercistronica. Este fendmeno & raro em eucariotos, mas muito comum em procariotos. Figura 8.21 ~ Estratégia de reiniciagao 244 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classficacBo e controle$.3 Virus de DNA infet (sistema vascular da genoma viral ; € tranportado até 0 aiieleo permanece em sua maior parte desconheci lo. 7 iniciagao °° ssDNA (genoma) ©) — de formas multiméricas ligase| ~—_Leespwa: fita 4) J. ese da fia negative: ds | a clivagent © Figura 8.22 — Ciclo replicativo dos Geminiviridae (mecanismo cfreulo rolante): oligonucleotideos de RNA (em azul) so co-putificados com o genoma viral (em vermelho) e serve de primers (iniciagdo) para a sintese de formas multi- méricas de dsDNA (stntese da fita negativa), o que tequer a DNA polimerase celular; posteriormente ocorre a sintese de ssDNA a partir de dsDNA, que é i clivado do dsDNA (clivagem), formando a fita positiva continua, e finalmente } ligado, via a enzima /igase, para formagio do genoma circular (ssDNA) sintese da fita positiva «6 : © mecanismo de replicagio foi batizado de cfreulo rolante, € | Possui trés estagios: I) conversio do DNA genémico (ssDNA, circular) em uma forma de dsDNA intermadiario, chamada jorma replicativa J, que apresenta-se enrolada como DNA bacteriano (supercoiled), II) amplificagao da forma replicativa I, pelo mecanismo circulo rolante, II) sintese e encapsidagio do ssDNA gendmico. Todo esse processo | €extremamente similar a replicagdo de plasmideos bacterianos (Figura 8.22), Oestagio I comega com aativagio do sitio de origem de replicagao do ssDNA genémico por priming, seguido pela sintese da fita negativa CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 245de ssDNA. Para os Mastrevirus (um dos géneros na familia) j4 existe ago de ssDNA na particula, anelado ao genoma do virus pequeno ped 0. Para Begomovirus em que age como primer para o inicio da replica Curtovirus (outros dois géneros na familia), no entanto, pedacos de RNA celulares é que atuam como primers. Assim uma molécula intermediérig de dsDNA é formada: circular, enrolada, com varias voltas em torno de si, provavelmente associada a histonas, € covalentemente fechada, como um mini-cromossomo. Este dsDNA intermediario serve de molde paraa sintese da fita positiva (genémica) de DNA e também para a transcrigao dos genes virais (Figura 8.22). Para a sintese da fita positiva o complexo de replicacao (Rep, REn, e outros) liga-se a um sitio especifico de reconhecimento, prdximo 4 regido intergénica do DNA, que contém a estrutura do tipo stem-loop (ou caule) e a sequéncia conservada TAATATTAG, ¢ cria o terminal carboxi necessirio para que a DNA polimerase celular sintetize a fita positiva, que ¢ enfim encapsidada. A replicase dos Begomovirus (principal género da familia Geminiviridae) & chamada Rep (codificada pelo gene AC1), e contém cerca de 300 a 400 aminodcidos. Essa replicase contém varios motivos conservados, um dominio tipo helicase (para desenrolar 0 DNA) no terminal carboxi (3’), um dominio do tipo ATPase, ambos essenciais para a replicagao, além de fungées de nuclease (capacidade de cortar 0 DNA) e digase (para re-ligar pedagos de DNA). Para a sintese de DNA em si os Geminiviridae utilizam DNA polimerases da célula, ainda ni0 especificamente identificadas, sendo candidatas as DNA polimerases de planta tipo alfa e tipo delta. Ha uma regio intergénica no DNA, com uma estrutura do tipo stem-/oop (ou caule), que serve para inicio da replicagao, na qual liga-se um primer (pedago de acido nucleico 4! promove o inicio da sintese da nova fita de DNA). Os membros da lo familia Geminiviridae subvertem 0 “1 celular ¢ estimulam a proliferagio celular, provavelmente como mecanismo para induzir um aumento na replicagio do DNA celulas ® assim, promover a replicagao do DNA do virus, expondo 0 seu DNA 246 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificacio e controlea DNA polimerase celular. Mecanismos similares sio utilizados por virus de DNA causadores de tumores em humanos, como espécies de Papillomavirus © Adenovirus, A Rep interage com proteinas envolvidas na regulacdo negativa do ciclo celular (como homélogos da proteina retinoblastoma e a histona H3), 0 que sugere ser essa proteina o principal componente do virus responsivel pela alteragio do ciclo celular. Adicionalmente, o gene AC2 codifica uma proteina chamada TrAP (de 15 kDa) que ativa a transcri¢io dos outros genes virais, atuando como promotora da capa proteica (CP, gene AV1) ¢ NSP (gene BV), como se fosse um fator de transcrigdo, além de atuar como supressora do silenciamento. O gene AC3 codifica uma proteina auxiliar da replicagao (REn), que nao € essencial para infectividade, mas que na sua auséncia a manifestagdo dos sintomas sao atenuados. Caulimovirus, que por sua vez sto dsDNA, utilizam uma transcriptase reversa e apresentam um ciclo replicative (Figura 7.4) similar ao de retrotransposons. O DNA circular (também chamado minicromossomo), com cerca de 8 kb, apresenta descontinuidades em determinados pontos, que servem de primers para o inicio da replicagio. A transcrigéo (fase 1 da replicagéo do virus) ocome no niicleo ¢ & assimétrica, resultando em um mRNA maior que o genoma. Este, por sua vez, serve de molde para ambos: transcrig&o reversa (RNA—dsDNA), que € a fase 2 da replicacao e que ocorre no citoplasma, e a transcri¢io em side alguns genes. Essa forma de replicacao resulta em varias formas de DNA intermediarios, tanto no nicled como no citoplasma. Sequéncias de varios virus de DNA de plantas, incluindo Geminiviridae, Caulimoviridae, Circoviridae e Cryptovirus, tem sido encontradas incorporadas (ou integradas) aos genomas da planta hospedeira, mesmo em plantas livres do virus, fenémeno este que no passado acreditava-se acontecer somente com virus de animais e humanos. E 0 caso de sequéncias completas do genoma do Banana streak virus em varias espécies de banana (Musa spp.). Tais sequéncias podem levar ao aparecimento de infécpaes epissomais, ou seja, aquelas oriundas de epissomas (sequéncias do virus integradas no genoma da planta). CAPITULO 8 | REPLICAGAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 247‘Também & 0 caso de sequéncias de Begomovirus em varias espécies 4. fumo (Nicotiana spp.), embora neste caso apenas sequéncias parciais q, genoma tenham sido encontradas e nio existam evidéncias claras de que possam causar infecgdes (HARPER ET AL,, 2009) essas sequénci 8.4 Caracteristicas gerais de polimerases virais termo replicase ou polimerase refere-se 4 enzima responsive] pela atividade de replicagio (sintese de nova fita de RNA ou DNA) 0 termo franscriptase refere-se & atividade de transcri¢do (sintese de mRNA). A polimerase viral, assim como as celulares, € composta de vitios polipeptideos com diferentes fungées,sendo portanto uma enzima multifuncional, O sequenciamento sistemético dessas enzimas levou a identificagdo de sequéncias tipicas (motives) e assim & identificacio de outras provaveis polimerases. As polimerases de virus de plantas ransferase, helicase e polimerae, possuem pelo menos trés fungdes: metil-z que podem estar presentes na mesma enzima ou separadas em duas enzimas diferentes, como no caso dos Bromoviridae (Figura 8.3). Sio em geral encontradas associadas 4 membranas celulares, e requerem um cofator iénico para atividade (Mg’?). Além disso, associam-se fatores da célula hospedeira com a finalidade de aumentar a eficiéncia da replicagao do virus. Iniciagéo e terminagio ocorrem em sitios de RNA ou DNA especificos e requerem fatores da hospedeira. Exemplo da eficiéncia: 1 cépia de RNA de Poliovirus gera 50.000 cépias em apenas 8 horas. ‘Taxas de mutagées causadas pela falta de capacidade de corregio das polimerases virais tem sido calculadas entre 10° a 10% (média: 10°) enquanto que na célula esta taxa é de 10 a 10° (média: 10°), com ilustrado na Figura 8.23, que acarreta em implicagdes evolutivas € limit 0 tamanho do genoma dos virus de RNA. O estudo molecular tridimensional das polimerases ¢ 4 SY correlagao com suas atividades cataliticas também tem sido important A primeira polimerase a ter sua estrutura tridimensional estudad# © 248 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificagéo e controledesvendada foi a 3D" de Poliovirus. Os dados estruturais, oriundos de cristalografia de raios Xe modelagem por computador, indicam que as polimerases de virus de RNA de senso Positivo tem o formato de uma méo direita, com regides (subdominios) em formato de dedos, palma ede um dedo polegar. Além disso, parecem utilizar um mecanismo comum de catalise, que envolve um motivo contendo residuos de aspartato, Figura 8.23 -Taxas de mutacio médias comparativas E importante salientar que o entendimento do processo replicativo © das caracteristicas especificas das polimerases virais pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias de controle, baseadas em técnicas moleculares. No caso dos virus humanos este tipo de estudo tem ajudado no desenvolvimento de intimeras drogas anti-virais,como no caso recente dos inibidores anti-HIV (AZT e outros), que niio tém a capacidade de curar os pacientes com AIDS, mas que bloqueiam completamente a teplicacdo do virus, e assim, interrompem a doenga e seus sintomas. No caso dos virus de plantas, a identificagao eo isolamento de fatores da hospedeira com afinidade a polimerases virais também pode permitir 8 inibigao da replicago e infecgio do virus in vive, caso tal fator seja expresso em quantidades adequadas na hospedeira, via transgenia. CAPITULO 8 | REPLICACAO, ORGANIZACAO E EXPRESSAO GENICA | 2498.5 Montagem da particula Virus de plantas, como qualquer outro virus, possuem uma capa proteica (capsideo,em que cada subunidade chama-se capsémer0) protegend, sea genoma. Para cerca da metade dos virus de plantas essa capa é sain (ver também capitulos 5 e 6). E além de sua fungio basica na montage, € desmontagem das particulas o capsideo também atua na traducio dy RNA viral ativagio de genes de resisténcia na planta (quando é 0 fator aviruléncia), supressio do silenciamento génico, e em alguns asos liga 9 virus a determinados sitios de reten¢ao nos insetos vetores (reconhecimento especifico do vetor) e, em muitos casos, associa-se com fatores da célula hospedeira para permitir o movimento do virus no tecido vegetal. Capsideos sio compostos por centenas_ou_milhares_de_cépias de uma ou mais proteinas da capa, que devem montar-se rapidamente € reproduzivelmente, numa escala biolégica. Essa montagem implica estabilidade da particula, mas para muitos virus, talvez a maioria, € necessirio que seja um processo facilmente reversivel, para que o genoma seja facilmente liberado na célula hospedeira. A interferéncia na montagem da particula é uma estratégia de controle de viroses largamente utilizada, via plantas transgénicas expressando a proteina da capa. Estudos in vitro da montagem de virus icosaédricos comegaram ainda nos anos 1960-70, com a montagem de capsideos vazios (sem RNA) ou mesmo de particulas completas de Cowpea chlorotic mottle virus - CCMV (ADOLPH; BUTLER, 1975). Foi demonstrado que a montagem pode ser induzida por mudangas de pH, 0 que presumivelmente traduz 0 efeito de reguladores in vivo. Os capsideos de Bromovirus, como CCMV e BMV, contém 90 cépias diméricas da proteina da capa (180 cépias no total), arranjadas numa simetria T = 3. Anilise por difragao de raios-x de capsideos cristalizados de CCMV, BMV e CMV mostraram muitas similaridades. Diversas técnicas experimentais, incluindo cromatagrafia po" tamanho-exclusdo, indicam que as unidades diméricas de muitos capsideos arranjam-se em pentimeros, ao invés de hexdmeros, com? Previsto por anélises computacionais das imagens oriundas dos 250 | VIROLOGIA VEGETAL: Conceitos, fundamentos, classificacéo e controle _experimentos cristalograficos (ver também capitulos 5 ¢ 6). O terminal amino do capsideo estabiliza o dimeroe resulta na formagao de estruturas tubulares, resultantes das estruturas tipo beta (B- sheets) na molécula. Alteragdes nessa estrutura simétrica levam inclusive 4 formagio de mutantes com maior patogenicidade, Referéncias Literatura adicional recomendada: Adolph; Butler (1975) Reassembly of a spherical virus in mild conditions. Nature 255, p.737-38. Ablquist (2006) Parallels among positive-strand RNA viruses, reverse~ transcribing viruses and double-stranded RNA viruses. Nature Reviews Microbiology 4, p. 371. Bol (2008) Role of capsid proteins. 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