Capitulo GERACAO DE VARIABILIDADE GENETICA EM BACTERIAS FITOPATOGENICAS” Dane as formas de vida conhecidas pela humanidade, os organismos procariotas, fitobactérias inclusas, exibem, coletivamente, © maior grau de adaptabilidade e de diversidade de expresso génica encontrado na natureza (CALDWELL, 2000). No especifico caso das bactérias fitopatogénicas, essa adaptabilidade reflete-se na habilidade em sobreviverem sob diferentes condigdes ambientes, sejam estas climaticas, estédios fenolégicos do hospedeiro e, ou, desenvolvendo tesisténcia a defensivos usados em seu controle. Essa capacidade de adaptagdo deve-se a existéncia de diversas rotas metabélicas, as quais podem ter sua expressio diferentemente regulada, dependendo das condiges sob as quais a bactéria se encontra. No decorrer do processo evolutivo, grupos de seres vivos desenvolveram mecanismos de recombinagio génica, os quais sio os Tesponsfiveis pela gerago de variabilidade. A titulo de exemplo, cita-se © caso dos mamiferos, que apresentam um complexo sistema ——— * Este capitulo foi escrito em colaboracdo com Ditceu Macagnan, D. §. em Fitopatologia pela UFV.Bactériasflopatogenicay Oe reprodutiv, em que a prole gers, desde que sela por métados naturais, é sempre fruto da recombinagao génica de dois individuos, por meio de reprodugio sexuada, ' Bactérias fitopatogénicas e todas as outras reproduzem-se por fissio bindria — uma célula divide-se, gerando duas células idénticas = € nao apresentam, aparentemente io entre os individuos macho e fémea. Todavia, mesmo diferentes dos eucariotas também rnesse aspecto e sendo mais primitivas, bactérias apresentam ficientes mecanismos de geragio de variabilidade. Esses mecanismos dio origem, aleatoriamente, a alteragSes no material genético, as quais, por forga da selegao natural, resultam em populagdes de organismas mais adaptadas a flutuaveis condig&es do ambiente. Como no hi formagio de gametas, nem plasmogamia nem meiose, no caso especifico de bactérias, evita-se & expresstio “teprodugo sexuada”, preferindo-se falar em “recombinagdo genética” (ROMEIRO, 1995). Se a reprodugdo sexuada, para os seres eucaridticos, é importante tanto para getar variabilidade como para aumento da populagio, a recombinagio genética em bactérias é importante apenas para geragio de variabilidade, uma vez que aio ocorre necessariamente um concomitante aumento do ngimera de individuos em decorréncia do proceso (ROMEIRO, 1995). Segundo Arber (2000), bactérias apresentam trés_mecanismos principais de geragiio de variabilidade: a) pequenas mudangas Pontuais na seqliéncia de nucleotideos do genoma, b) rearranjamento intragendmico de regides do genoma e c) aquisigio de sequéncias de DNA de outro organismo. MutagGes como Mecanismos de Geragao de Variabilidade Mutagio é uma variagao permanente e herdavel na sequéncia de bases do DNA do individuo, Praticamente qualquer tipo de mudanga nna seqiéncia do DNA € possivel € todas essas trocas na seqléncia podem ser chamadas de mutagio. Contudo, quando esses danos ou trocas sao reparados © a seqiiéncia original € restabelecida, cles deixam de ser herdaveis. Portanto, somente permanentes e herdaveis Geracao de variabita rem bactérias topatog. cas 101 mudangas ‘na seqiiéncia de nucleotideos constitwem uma _mutagiio (SNYDER ¢ CHAMPNESS, 2003). Agentes indutores de mutagoes podem ser composios quimicos, naturais e sintéticos, ou fisicos aradiagio ultravioleta, por exemplo (GOTO, 1990; MADIGAN 2003). Mesmo em condigdes normais de cultivo de uma bactéria, sem @ presenga de agentes mutagénicos, podem ocorrer mutagdes espontineas em uma freqiiéncia muito baixa, geralmente um em cada 10° eventos, Esses mutantes, normalmente, no se tomnam dominantes sobre a populagio por estarem em menor freqiiéncia e por apresentarem uma taxa de moltiplicagdo igual ou menor que a Populagio niio-mutacla (GOTO, 1990), Todavia, caso as condigies do ambiente se tomnem favordveis & populagao mutante, esta pode vir a predominar. Caldwell (2000) classifica 0 nivel de mutagao do genoma — em termos de quantidade de bases da seqiléncia do DNA que sofreram alteragdes — em micro e macrolesdes. Microlesdes, tipicamente, envolvem alteragées em um ou, no maximo, em dois pares de bases. A conseqiiéncia desse tipo de mutagio dependerd da regido onde ela ocorre. Pode variar desde a nio-alteragio do fendtipo do individuo, Por ndo alterar a seqliéncia de aminodcidos da proteina sintetizada a Partir do gene mutado, passando pela troea de um Gnico aminosicido nna seqiiéncia da proteina, ow até mesmo interromper a tradugaio da protefna, resultando em uma proteina defectiva ou truncada (Figura 5.1). E preciso lembrar que, em genes importantes na patogenicidade, a substituiggio de um Gnico aminodcido na cadeia protéica pode alterar a resposta da planta de resistente para suscetivel, ‘como ja demonstrado para 0 caso de fungos fitopatogénicos (BRYAN et al., 2000). Macrolesdes sio mutagdes em que muitos pares de bases so afetados. Podem set do tipo delecdes, duplicagdes, inversdes, transposigdes ou insergdes. Delegdes implicam a perda irreversivel de segmentos de DNA (Figura 5.2). Acontecem em taxa significante durante 0 crescimento ¢ atingem proporgdes de até 12% das mutages espontineas que ocorrem na natureza, Pode-se assumit que mutagies apresentam um importante papel na geragio de diversidade genética em populagdes bacterianas (NEIDHARDT et al, 1990). Duplicagaes consistem na geragio de cépias adicionais de segmentos do102 Bactérias fropatos. cromossomo (Figura 5.2). Este tipo de mutagao tipicamente dé-se sob condigées de ripido crescimento bacteriano, quando um grande niimero de ribossomos e de rRNA € necessirio, a0 mesmo tempo, Como resultado, duplicagées de genes que codificam para a sintese de FRNA podem ocorrer, Quando as condigdes do ambiente deixam de suportar ripido crescimento, grandes quantidade de ribossomos no so mais necessdrias e as duplicagdes ¢ amplificagdes cessam (CALDWELL, 2000). DNA ~TGA— —TGG— —T6T— A y u u RNA ~ ACU —acc—, — aca — Titsina Tidsina Tiosina DNA — TAC — PAG B u u RNA — AUG — —auc— Mellonina __aaetcina DNA — AAT — —act- ec u u RNA — UUA— — UGA — u 4 Leucina ‘Término da tradugio Figura 5.1 - Microlesdes em DNA de bactérias e suas possiveis conseqiiéncias na sintese de proteinas: (A) a troca de diferentes nucleotideos pode ndo causar a troca do aminodicido a ser inserido na seqiiéncia da proteina; (B) 1 troca de um nucleotideo implicando a adigéio de um aminodcido diferente 4 seqiéncia da proteina; e (C) a substituigdo de um nucleotideo implicando o término da tradugao do gene. Gerogio de variabilidade genética em bactérias ftepatogénicas i Reet Ae varicblidade genética em bactérias ftopatogénicas 103 1 LL} ABCDEFGHIJ @) ABCDIJKL we] ABCDEFGHIJ @ABCDEFGHBCDEFIS [3] ABCDEFGHIS mm) APEDCEGHIT opors eee Figura 5.2 - Macrolesdes em seqiiéncias de DNA bacteriano: (1) seqiiéncias de DNA sio removidas do genoma por delegio; (2) seqiéncias de DNA genémico sio duplicadas; (3) seqiiéncias de DNA so invertidas na seqiléncia do genoma; e (4) novo fragmento de DNA é inserido na sequigneia do gene através de um elemento transpontvel. Inversoes S80 as insergées das bases da seqiiéncia de um gene na ordem inversa ~ Figura 5.23). Caldwell (2000), assim como Neidhardt et al. (1990), acreditam que este tipo de mutagio acontega espontaneamente na natureza. Transposigdes ou insergdes so © movimento de fragmentos inteiros de DNA de uma regiao para outra do cromossomo, dentro de uma mesma célula (NEIDHARDT et al., 1990) ~ Figura 5.2(4) Este tipo de mutagio € decorrente da agio de elementos de transposigio génica, os quais sio divididos em quatro tipos diferem, entre si, tanto em tamanho como em fungi,Bactérias fuopatogénicas SS aaaae Seqliéncias de insergdo tipicamente apresentam de 800 a 2.000 pares de bases. Este tipo de elemento transponivel dispoe de informagio génica suficiente e unicamente para a sua transposi .gmento de DNA que apresenta um némero superior a 2.000 pares de bases. Este tipo de elemento transponivel, além de informagao génica para a transposigao, pode codificar para a sintese de uma variedade de enzimas, assim como para resisténcia a antibiéticos (CALDWELL, 2000; NEIDHARDT et al., 1990). Por ‘aleatoriamente no cromossomo bacteriano e alterar a jo do gene onde se inseriu, assim como codificar para a resistencia a determinado antibistico, em fitobacteriologia os transposons so uma ferramenta extremamente itil na geragio de utantes para estudos de genes envolvidos no processo de patogénese. Em sintese, a técnica consiste em inserit transposons em células do isolado em estudo, os quais, aleatoriamente, inserem-se em uma regifio do cromossomo e alteram a expressio do gene no qual foi jinserido, As bactérias que tiveram transposons inseridos so selecionadas semeando-as em meio contendo 0 fator de selegio codificado pelo transposon — normalmente a resisténcia a um antibistico. Os mutantes, assim como 0 isolado original, sio entio inoculados em plantas, as quais so avaliadas quanto presenga severidade dos sintomas. Na literatura ha diferentes exemplos de uso de transposons para estudos de genes de patogenicidade, A titulo de ‘exemplo, citam-se os estudos sobre a importincia do EPS capsular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae na patogenicidade em arroz (DHARMAPURI e SONTI, 1999); genes importantes na patogenicidade de Leifsonia xyli subsp. xyti, agente causal do Faquitismo das soqueiras em cana-de-agiicar (BRUMBLEY et al., 2002); gerag3o de mutantes ndo-patogénicos de Xanthomonas campestris pv. glycines, objetivando seu uso como agentes de controle bioldgico de isolados patogénicos dessa mesma _bactéria (RUKAYADI et al., 2000); e geragao de mutantes nio-produtores de xantomonadinas, visando o estudo da importncia deste pigmento ma sobrevivéncia de Xanthomonas campestris pv. campestris (POPLAWSKY et al., 2000). No Brasil, trabalhos dessa natureza estio em andamento, a fim de identificar genes importantes envolvidos na patogenicidade de Xanthomonas campestris pv. citri 3 Citrus sp. (LAIA et al., 2003). Transposon é um fra Geragao de varabitidade genética em bactériasftopatos 105 2 ftopatogénicas Elementos de inversio so u c io so um tipo de elemento transponivel au coca para a sintese de uma envima ~ DNA invertase nama esta que pode inverter uma grande seqiiéncia de DNA sem a necessidade de movimentagio do elemento transponivel para um: regido diferente do genoma, ae Um quart ea fel de vs do tio a (o gles Muarrs murat) 0 ines Ree oee bactrsfago do tipo tempera, que & agulecapar de extabeecer uma associgio de tisogeia com a célla baterana hospi multiplicando-se indefinidamente no interior da bactéria ae si sun more Otago, estando na fase de pofago (omens Seo genom € erode no neror da cll). nsrid no genome do at, al a expresso de algum gene desta (MADIGAN et al., _Normalmente bactérias apresentam mecanismos de re possveis mitagoes que venham a ocomer em sel" genome eobors existam populagdes deficientes nesses mecanismos. Segundo Chopra etal. 2003), assim como Martinez e Baquero (2000), essa € uma das principais fontes de surgimento de populagdes de bactérias resistentes 8 antibidicos. Trata-se de uma evidéncia comprovada para patsgenos hhumanos, mas ndo se pode descartar a possibilidade de que, em bactérias fitopatogénicas, este mesmo evento possa também acontecer e explicar a resisténcia constitutiva a diferentes antibisticos, resistencia esta relatada por Romeiro etal, (1998) : Transferéncia de Genes como Mecanismos de Geracao de Variabilidade Até agora foram mencionados mecanismos pelos qu bactéras adguirem varailidade gentica por mutayces fos sents yt existentes em seu genoma, por meio do rearranjo de seqiénci de bases jd existentes. Contudo, hi mecanismos pelos quais genes inleiros, de origem exdgena, podem ser incorporados a0. genoma bacteriano. Estes mecanismos sao conhecidos como transformagao, transclugao e conjugagio (ROMEIRO, 1995; DAVISON, 1999).Be 106 lactérus fuopatogenieas Wag tras fpnagénicas 5 ope Transformacao ‘A transformagao bacterana te fragmento de DNA livremente presente no ambiente (NEIDHARDT de transferéncia wenica descobert, eexce fener forma et al., 1990; ROMEIRO, 1995; CALDWELL, 2000), conforme londtino Frederic Grifith, em experimentos wale 1928. Griffith observou (Figura $.4) Streptocaceus pneumoniae procedent esquematizado na Figura 5.3. 2 GO He CORE) 4 ue. quando inoculava células de tes de col6nias lisas, sabidamente im; dos ratos mortos, a @ —Moouiagdo Se ‘ sen Ge tse. GD vivo Incculagao & —tneubagao SS —moculao > —— as _ MORE | tnocutagdo, Dee (Le Wesege0 & cS _ calor) MORTE Figura 5.3 - Transformagio natural em bactérias Gram-negativas (1) € ~ Isolamento «<—— ser Gram-positivas (2). (A) um fragmento de DNA livre no ambiente liga-se a proteinas presentes externamente & Figura 5.4-Esquematizagio dos achados de Griffith — talver a Gram-negatives ligam-se apenas a primeira constatagdo de ocorréncia de transformacito, em bactérias, ocorrendo espontaneamente Viruienta | @ Wivas) célula_ bacteriana, DNA de bactérias filogeneticamente relacionadas (1A), enquanto Gram-positivas no apresentam — esta especificidade (2A). O DNA é transportado para o interior Quando inoculava células de colénias rugosas, sabidamente no da célula intacto no caso de Gram-negativas (1B), Patogénicas, estas nfo causavam a morte dos ratos, O mesmo enquanto em Gram-positives uma fita é degradada € acontecia quando inoculava células patogénicas inativadas pelo calor, apenas DNA de fita simples carreado para o interior da Contudo, a0 inocular cobaias com células vivas ndo-patogénicas célula (2B). O DNA € incorporado ao genoma da bactéria juntamente com células patogénicas mortas, 0 autor verificou a morte €, para isso, uma das fitas € degradada em Gram- negativas (IC), estando esta fase jé conclufda nas Gram- positivas (2C). Expressiio do novo gene (ID, 2D). das cobaias de cujo sangue era possivel recuperar bactérias do tipo Patogénicas. Na época ainda nio se sabia que 0 DNA era a molécula Fee eee eee eaine Bactérias flopatogeni responsivel pela transferéneia da informagao génica. Griffith concluiu que algum fator das eélulas patogénicas mortas teria transformado em patogénicas as células de colénias tipo mugosas vivas € nio- patogénicas (MADIGAN et al., 2003). Foi somente em 1944, com 0 sico trabalho de Avery et al. (1944), que se compreendeu que a substincia que transformava as células de S. prewmoniae era o DNA. Assim, comprovava-se que era o DNA a substincia responsive pela transmissio da informag3o genética e, adicionalmente, fazia-se a primeira transformagio artificial em laboratério. Segundo Neidhardi et al. (1990), microrganismes distintos apresentam capacidade natural de transformagio. Algumas etapas da transformagio so comuns a todos, como a captagio do DNA pela célula receptora, © processamento do dcido nucléico incorporado, a jo do DNA incorporado com 0 genoma da célula e finalmente, @ expressio da nova caracteristica decorrente do novo fragmento de DNA incorporado. No entanto, os detalhes moleculares dos eventos que envolvem a transformagio diferem de espécie para bacteriana e, principalmente, entre bactérias Gram-positivas € bactérias Gram-negativas. Diferentemente das _caracterfsticas, particulares de cada microrganismo, células potencialmente receptoras, de fragmentos de DNA devem estar, impreterivelmente, naquilo que se convenciona chamar de estado competente ou estado de competéncia (STANIER et al.. 1986), ou seja, capazes de capturar 0 fragmento de DNA do ambiente © incorpori-lo ao seu genoma. A ‘a comum em todos os processos de competéncia é uma caracter transformagdo, sendo conseguida, em geral, através de mudangas do estado fisiolégico do organismo, da natureza das camadas externas da célula ou ambas (CALDWELL, 2000), Em geral, bi maior proporgio de células competentes no inicio da fase estacionsria, Células mente 8 a 10 competentes sintetizam um grupo de aproxima diferentes proteinas de baixo peso. molecular. Algumas dessas proteinas © slo responsiveis pela ligagio com 6 DNA a ser capturado, O DNA presente no ambiente, passtvel de ser capturado, deve estar nit forma de dupla fita, Bactérias Gram-positivas, assim como Gram-negativas, ocalizam-se em camadas externas da célula Gerosdo de variabilidade genética em becréros fis 21 ftopurordnicas 109 somente serio transformadas se 9 DNA. alee wa forma de dinls fa Eaqesten Comes ee Bae Enquanto Gram-positivas nao are ae Ficidade aparente de ligasdo a0 DNA a ser captado, gativas ligam-se apenas a DNA de 0. Apds a liga ; lado com alto gra de la dupla fita de pro bresetes extmamente 3 edu. este € napornds nace ae interior de células Gram-ne . atvas. Jem Gram posta dela 4 presenga de nucleases, uma fila ¢ deqrdals enone BAN simples & careato ao inter da ecu c meosprals eo Gram-ceatas adpl fis pean tits mo tt célula até encontrar uma regiio de homologia. el una fa depadada somente uma ¢ mena av renin ta ella receptora (NEIDHARDT etal, 1990: CALDWELL. > de fita senoma. Ki wa da célula De onde vem o DNA a ser apd eincorporao sua ell receptora? Segundo Neidhart et al. (1990), ete ¢ um procenes nts Pouco estudado, A putstiva origem desse materal sercing pale ne frao da ise de uma clus por diferentes process oe anda ie po ser seoretado por clus inacas em resposta 2 atm sina! yale células competentes. . Transformagao artificial de bactérias © processo de transformagio natural discutid anteniormente engloba uma eluborada série de eventos envolvendo proveinas especificas €, no caso de bacténias Gram-negativas, © reconhecimenta de uma seqiéneia de bases especiticas no DNA a ser ineorporada Dessa forma, a transformagio natural oooere em apenas alguns tmicrorganismos, sendo pouco freente ou mesmo ausente em outros Embora o escopo deste capitulo mio comports sbordar, € detalhes, Ktica, € imprescindivel que a0 my menclone o uso da trans formaso bactenana em pesusa te universo da biologia molecular, e Inicilmente, in vitro, € “consuls” uma sequania de DNA que possa, de alguma forma, scr reconhecida pel” diferentes componentes responsive pela espreso genica da clu hospi © ser replica, juntamente com o reste Jo genoma bicterano,110 Bactérias fuopatogénicas ainda, além de ser rept passo seguinte deseja in de lo, sintetizar uma proteina de interesse. O tomar competente a célula bacteriana na qual se erir a seqiléncia de DNA. Indimeros procedimentos tém sido envolvidos. visando permitir a entrada do DNA nas células, incluindo sucessivas lavagens ¢ ressuspensdes em gua, tratamento com Ca** em baixa temperatura, congelamento e descongelamento, formagiio de protoplasto seguida de tratamento com etileno glicol e a eletroporagio, que consiste em aumentar a permeabilidade fisica do envelope celular através de pulsos elétricos em magnitude suficiente para permitir a entrada do DNA, mas sem infligit significantes injdrias Acélula receplora (CALDWELL, 2000). dominio das diferentes etapas que envolvem a transformagio genética de bactérias tem proporcionado inéimeros avangos para a humanidade nao somente na Grea de cigncia e tecnologia, mas também no diaca-dia das pessoas. A titulo de exemplo cita-se a clonagem e expresso, em Escherichia coli, do gene que codifica a produgaio da DNA polimerase termoestivel de Thermus aguaticus (taq DNA polimerase). Esta bactéria cresce em altas temperaturas € seu cultivo em laboratério € dificil e dispendioso. Com a producio em larga escala dessa enzima, a partir de E. coli, foi possivel automatizar e popularizar a técnica de PCR, € os avangos possibilitados pela automagio dessa téenica dispensam maiores comentarios. Um segundo exemplo € a clonagem e expresso, também em bactérias, do gene que codifica para a sintese da insulina humana. Pessoas deficientes na produgio de insulina desenvolvem a doenga chamada diabetes e tornam-se dependentes da administrago exégena desse horménio para sobreviver. Antes da produgio desse horménio em laborat6rio, ele era obtido de pancreas de suinos. Com a produgio artificial do horménio, por procedimentos biotecnol6gicos, esse medicamento tornou-se mais barato, mais eficiente € biologicamente seguro. Transdugao Entende-se por transdugio a transferéncia de fragmentos de DNA de uma bactéria a outra por intermédio de bacteriGfagos. Bacteri6fagos, ou mais simplesmente fagos, so virus que infectam Gevagao de varabilidade genética em bacténas fi tras ftopatoxénicas 1 bactérias (DARNELL et a, 1990), Em conformidade com ki al, (1970), foram os tabalhos de Twort em 1915 oe an A et ‘anos apés, que deram inicio fae coun ta descobers dese ec # Yrs pesquisa gus culmiaran na Do ponto de vista estrutural, os constitwidos de uma capa protéica, material genstico, s (Figura 5.5, Ae B) si Ro interior da qual se situa 0 [al Figura 5.5 - Bacteri6fagos e sua anatomia: (A) esquema de um bacterisfago tipico, conforme Romeiro (2001). (B) bacterisfago especifico isolado de folhas de batata. baroa, com especificidade para X. campestris pw arracaciae (BRITO et al, 1985). Diferentes fagos apresentam diferentes ciclos de vida Conseqiiemtemente, mantém diferentes relagies com a célula hospedeira (MADIGAN et al., 2003). Os dois tipos mais frequentes de bacteri6fagos sio os conhecidos como litico e lisogénico. A replicagio de tipicos fagos litcos leva sempre i destruigao célula bacteriana hospedeira. De maneira geral, os fagos liticos aderem A superficie da célula hospedeira & injetam seu material Benético no interior desta. Uma vez exposto, 0 genoma do fase € Feplicado, gerando novas e6pias do virus. A replicagio do fago. assim como a io de alguns de seus genes, levam ao lise da cclula hospedeira, liberando no ilustrado na Figura 5.6. iene imtimeras cSpias do virus, conforme12 Bactérias ftopatogénicas Figura 5.6 - Esquematizagao do ciclo de vida pico de um bacteriéfago do tipo litico. Um fago (A), a0 encontrar uma célula bactetiana (B), adsorve-se a ela (C), penetra a célula ou simplesmente injeta seu material genético no interior desta (D). O material genético do fago € multiplicado no interior da célula bacteriana (E) e novas edpias do fago sto produzidas, as quais causam a lise da célula hospedeira, ovas particulas virais sao liberadas no ambiente (F).. Enquanto bacteri6fagos do tipo Iitico so também chamados de fagos virulentos, pois normalmente eles ocasionam a lise da célula infectada, outros grupos de bacteriGfagos, embora também sejam capazes de causar a lise de seu hospedeiro, frequentemente ocasionam efeitos ais sutis. Esses fagos so chamados temperados e podem entrar em um estado chamado de lisogenia. Nessa condigo, seus genes ndo sto expressos € 0 genoma do fago € multiplicado em sineronia com 0 cromossoma do hospedeiro. Portanto, se 0 genomra do fago € multiplicado Jjuntamente com 0 genoma do hospedeiro, que acontece no momento da divisiio celular, o fago passa de uma geragéio a outra da bactéria Durante a fase lisogénica, apenas 0 genoma do fago encontra-se presente na célula, mais propriamente numa forma latente chamada de provirus ou profago. O genoma do fago pode se integrar ao genoma Gero de verablidade gendca em bctérias frou 113 do hospedeiro ou perman: s jecer circular plasmideo. Este tipo de fago ¢ serra hospedeiro, pois os genes expressos. Normalmei emle esse controle mantido por uma protet . €reressor é inativado a sites ds pee oe endo Feat Sy eerie de fagos-filhos (MADIGAN et al, 2003 ‘gura 5.7 mostra um tipico fago em estado lisogénico. oe W, OK Figura 5.7 - Esquematizaglo do ciclo de vida de um bacteréfago do temperado ou lisogénico. © fago adsorve-se 1 uma eélula hospedeira (A), este penetra no interior da cella hospedeira ou simplesmente injeta seu material genctico (B). O material genético circulariza-se, a exemplo de um plasmideo (Cl), ou insere-se no cromossomo da bactéria (C2), onde permanece por sucessivas geragdes da bactéria hospedcira. Em fungao de algum estimulo, a fase litica & induzida © © fago multiptica-se no interior da célula hospedeira, causando sua lise e liberando no ambiente novas particulas virais (D1 e D2) ee |in Buctérias ftopaogenicas No caso de Bactetiologia de Plantas, 0 maior interesse no estudo de fagos reside em sua potenciatidade para engenharia genética, uso em diagnose de enfermidades bacterianas, na detecgiig de fitobactérias em sementes e como agentes de bioconitole (DARNELL et al., 1990; DUERING, 1994; JAHINKE et al., 1998; KIRALY et al,, 1970; GOTO, 1990; GROSS et al., 1991; KAHVECI © MADEN, 1994; KURTBOKE, 1994; SACCARDI et al,, 1993; VERMA et al, 1994). A transdugio foi descoberta no infeio da década de 1950 por Norton Zinder ¢ Joshua Lederberg, trabalhando com bactér Guero Salmonella (ZINDER © LEDERBERG, 1952). A aacontece em conseqiléncia de erros que ocorrem no desenvolvimento de certos tipos de bacteriéfagos (NEIDHARDT et al., 1990). Fagos, a exemplo dos demais tipos de virus, utilizam-se do aparato fisiolgico de seus hospedeitos para replicar seu genoma, assim como para sintetizar as enzimas € protefnas necessirias a “montagem" de mais particulas virais. Geralmente, apés a replicagio do material genético do hacteristago, este causa a lise da eélula do hospedeiro, liberando centenas de novas particulas vitais (MADIGAN et al., 2003). conhecidlos dois tipos de transclugdio: a generalizada ¢ a especiatizada, A wansdugio generalizada (Figura 5.8) & assim chamada porque, Imente, qualquer fragmento de DNA gendmico do hospedeito pode Fagos mo vintw ser transferido a uma e¢tuila bucteriana recipiente. Re infectam a célula hospedeira © multiplicam-se em seu interior. C decorrer da fase litica, as enzimas responsaveis pela montagem do vition (genoma do fago envolvido pelo capsideo), por um acidente biolégico, acabam organizando uma particula viral, consistindo de um capsideo envolvendo um fragmento de genoma do hospedeiro. Assim & gerada lum partfcuta transduetvel, Essa particula niio causa uma infeegao viral, rnormalmente pelo simples fato de ndo conter seqiléncias de genoma viral No cntanto, células bacterianas, ao setem infectadas por particulas ransduciveis, recebem material genétic freqiiéncia desse tipo de evento & exiremamente baixa devido a dificuldade pars infeego encontrada pelas particulas transducfveis, A {ransdgo generalizaca somente ocome com bacteriéfagos dotados do mecanismo de montagem de virions, que permite o empacotamento acidental de genoma do hospedeiro antes de este ser completamente degradado (MADIGAN et al., 2003). ‘Gerapie de variabiidede genica em bactéiasfrparogéncas Ls Sea om bactéras ftopatog Figura 5.8 - Transdugio do tipo generalizada, (A) Um bacterisfago infecta uma eélula bacteriana. (B) © fago insere seu ‘material gendmico no interior da cétula, (C) O material Benémico do virus € replicado pela bactéria ¢ hia induglo da fase litica do fago. (D) Ha o empacotamento do material genémico do virus_no capsideo ¢ acidentalmente fragmentos de DNA da bactétia posem ser também encapsulados, — gerandoparticulas transduciveis. (E) A fase litica completase e haa liberagao das particulas virais jumtamente com. as Particulas transduciveis no ambiente, (F) A. particula transduefvel infecta uma célula bacteriana e nela insere 0 fragmento de DNA de outta bactétia (G); este se insere ho genoma da bactéria que passa a expressi-lo (H). Enquanto a transdugio generalizada & um fendmeno que ocorre em baixa fregiiéncia, © mesmo nio se pode dizer da transdugio Especializada (Figura 5.9). Este & um fendmeno extremamente cficiente © claborado que ocorre principalmente com virus que apresentam fase lisogénica ow virus do tipo temperado. Contudo, sob Certas condigdes, a seqiléncia de bases do genoma viral & excisada doBactéviasftopatogénicas 116 genoma bacteriano, © fago, entio, multiplica-se ¢ causa a lise da célula hospedeira, A transdugio especializada ocorre quando 9 genoma do virus € excisado incorretamente e, além da seqiiéncia de bases do genoma do virus, sio também excisados fragmentos do cromossomo bacteriano. Um virion assim gerado contém, envolto pelo capsidio, genoma viral ¢ fragmento ou fragmentos do genoma bactriano, Ao infetar una nova ells bacteria, este fog inset genoma, além de seu material genético, também um fragme: de genoa de Sou hoped (SNYDER e CHAMPNESS, 2003). ‘Gene Bastian, “Sequinesa do basen 5 | Figura 5.9 - Transdugdo especializada em bactérias. (A) DNA viral inserido no genoma bacteriano. Apés sofrer um estimulo, 0 DNA viral € circularizado corretamente (B1) ou contendo fragmentos de DNA da bactéria (B2). 0 DNA circularizado é excisado (C1, C2). O DNA viral excisado correta. (D1) ou incorretamente (D2) é replicado. A lise da célula bacteriana libera particulas de fagos normais (El) ou particulas de fagos carregando fragmentos de DNA da bactéria - e capazes de transduzir genes de seu antigo hospedeiro. Geragto de variabildtade genética em bactérasftopatogénicas Conjuga¢gao E a transferéncia direta de genes de uma bacteriana a outra, mediada por um tipo especial de plasmideos, os chamados plasmfdeos de conjugacao (Figura 5.10) Figura 5.10 - Conjugago em bactérias Gram-negativas. (A) Troca de sinais entre a célula doadora e receptora e formagio do pilus. (B) Retragio do pilus sexual. (C) Fusio das membranas externas de ambas as células e transferéncia do material genético. (D) Separagio das células e expressao do gene pela célula receptora. No entender de Madigan et al. (2003), se o conhecimento que se tem sobre _recombinacio por transformagio resultou de um descobrimento “acidental”, a descoberta da recombinas30 por Conjugagdo foi fruto de experimentos metodicamente delineados & Planejados. A conjugagio foi comprovada por Lederberg e Tatum (1946) em um conjunto de experimentos que envolveu o uso de Mutantes nutricionais de Escherichia coli demonstraram que a conj IM proceso com caracterist que lembram a reprodugao sexuada e que pode ocorrer entre b: actérias, A analogia com reprodugio sexuada deve-se ao fito de haver Estes brilhantes cientistasia Bactérias ftoparogtnicas necessidade de contato entre duas eélulas bacterianas € de uma dispor de material génico a ser transferido, enguanto a outra célula encontra- se receptiva a receber e incorporar esse material. Por seus trabalhos com genética de bactérias, Joshua Lederberg e Edward Tatum dividiram, juntamente com George Wells Beadle, em 1958 0 prémio Nobel de Fisiologia e Medicina, Tipicamente, plasmideos possuem sequiéncias € produtos que governam sua propria replicagao (STANIER et al., 1986). Plasmfdeos de conjugayio adicionalmente detém a habilidade de direcionar sua transferéncia de uma eélula a outra (DARNELL et al., 1990). Essa habilidade € conferida por um conjunto de genes chamados genes Tra, {que codificam produtos que promovem o contato entre duas células e transferem o plasmideo da célula doadora & célula receptora através de uma estrutura oca e tubular chamada pilus (plural: pili) sexual ou pilus de conjugagao. A sfntese do pilus é mediada por genes presentes no plasmideo de conjugagdo; logo, & a célula doadora que o sintetiza. Toda conjugagio em bactérias Gram-negativas € dependente do pareamento de células realizado pelo pilus. Este promove 0 contato especifico com o receptor e retrai-se, deixando as células lado a lado. A estabilizago do contato entre ambas ocomre possivelmente pela fusio da membrana externa, quando entio 0 material genético é transferido (MADIGAN et al., 2003). Normalmente ocorre a transferéneia apenas do material genético contido no plasmideo de conjugagao, porém, embora em menor freqiiéncia, plasmideos de conjugagio podem facilitar a transferéncia de material cromossémico € de plasmideos do tipo nao-conjugative (NEIDHARDT et al., 1990; ROMEIRO, 1995; MADIGAN et al., 2003). Apés a transferéncia, os plasmideos podem manter-se indefinidamente na condigio de plasmideo ou integrar-se ao cromossomo bacteriano (SNYDER ¢ CHAMPNESS, 2003). Basim et al. (1999) comprovaram ser possivel, na natureza, a transferéncia de DNA cromossomal por conjugagao entre populagdes de Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria e, especulativamente, atribuem a esse evento o grande polimorfismo de DNA entre diferentes isolados desse pat6geno. A conjugagao em bactérias Gram-positivas difere da observada em Gram-negativas, inicialmente pela auséncia de pilus sexual. S30 poucos os trabalhos envolvendo conjugagio em _ bactérias Gerago de variabitdade genética em b 4 em bactévies topatosénicas 19 fitopatogénicas Gram-positivas, Os exemplos mais ilustrativ fetos em Enterococens faeais, um patgeno do wane sina entre etllas doadoras © recep ey eg to: OS substancia de agregagio em sua superficie externa. Células com 7 Substincia de agregagio formam “pontos de passage” com a élula material génico é transferido (NEIDHARDT et al, 1990) : géneros diferentes de bactérias AVISON, 1999, Cai rias (ROMEIRO, 1995; DAVISON, 1999; Referéncias ARBER, W. 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