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Resumo: O experimento consiste em duas etapas de anlise, sendo que uma etapa a determinao de uma aminocido desconhecido, atravs

s da titulao da soluo com KOH 0,05N, encontrando-se assim seus Pks e a outra parte de anlise a obteno dos valores de absorbncia de 3 aminocidos conhecidos, sendo estes a fenilalanina, o triptofano e a leucina, com o auxilio do espectrofotmetro em diferentes comprimentos de onda. Introduo: Aminocidos: As protenas so constitudas de 20 aminocidos-padro, nem todas constituindo todos os aminocidos de uma s vez, sendo que a maioria dos aminocidos possuem um grupo amino primeiro, com exceo somente da prolina, que secundrio. O que difere os aminocidos uns dos outros a estrutura de suas cadeias laterais. Apresentando diferenas na estrutura da cadeia lateral, os aminocidos-padro so divididos em 3 grupos de acordo com a polaridade de suas cadeias laterais, sendo os aminocidos com cadeias laterais apolares, neutras e os de cadeia lateral carregadas, podendo ser positivas ou negativas, implicando em diferentes Pks, sendo os do grupo carboxlico (COOH) em torno dos 2,2 e dos grupos amino (NH3) em torno de 9,4. Com a presena das cadeias laterais h diferenas nos valores dos denominados pontos isoeltricos (PI), sendo um ponto de carga liquida nula. Espectroscopia de absorbncia: Atravs da utilizao de um espectrofotmetro de absorbncia, d-se para determinar uma concentrao, por exemplo de um aminocido, desde que a soluo contenha um soluto que absorva luz, isso se aplica com a lei de Beer-Lambert: A = &.c.l Em que A a absorbncia do soluto, & grau de absoro molar, c a concentrao molar, e l o comprimento do

caminho da luz representado em cm. Se quando analisado, um soluto apresentar alta concentrao e cor, no ser possvel determinar a absorbncia do aminocido de maneira a obter valores desejados dentro da literatura, tendo assim muitas vezes a necessidade de diluio do soluto.

Materiais e Mtodos: O experimento divide-se em duas partes, uma em obteno de dados de absorbncia de 3 diferentes aminocidos conhecidos em diferentes comprimentos de onda com o auxilio de um espectrofotmetro, e a outra parte do experimento a determinao de um aminocido analisando o Ph com titulao utilizando KOH 0,05N, obtendo dados suficientes para a determinao da principal absorbncia de cada aminocido. Experimento para obteno da absorbncia de aminocidos : O experimento consiste na utilizao de um espectrofotmetro da marca Analytic Jena modelo SPEKOL 1300, da utilizao de 3 amostras de aminocidos conhecidos com concentraes iniciais de 0,1M , sendo estes a fenilalanina, triptofano e a leucina, de um pissete com gua destilada, alm de bqueres e papel toalha para o auxlio ao manuseio com o espectrofotmetro. A utilizao do papel toalha ou papel higinico voltada para deixar a cubeta sempre limpa contra sujeira para no interferir na anlise, por exemplo quando a cubeta manuseada pode haver contato com os dedos do experimentador nas faces de anlise, que so as faces transparentes voltadas para a fonte de luz UV/vis, podendo causar distores na obteno dos dados. A cubeta utilizada foi uma cubeta de quartzo, que no interfere quando analisado comprimentos de onda do UV, sendo que no vivel a utilizao da cubeta de vidro nessa faixa de comprimentos de ondas, pois o vidro absorve o comprimento de onda UV, interferindo nos dados do experimento.

Para analisar a absorbncia, deve-se primeiramente ligar o espectrofotmetro, regular o comprimento de onda desejado, por exemplo 220nm no aparelho, abrir a tampa do espectrofotmetro onde se localiza a cubeta, adicionando assim gua destilada cubeta, sendo que com o auxilio do papel toalha esta ultima deva sempre apresentar-se limpa para a anlise da absorbncia. Aps colocar a cubeta com a gua destilada no espectrofotmetro SPEKOL 1300 e no comprimento de onda desejado, deve-se apertar o boto 100%T, e aparecer no aparelho a palavra BLANC, isso quer dizer que o aparelho tem o branco, um padro para a anlise da absorbncia da substancia deseja, nesse caso o padro obtido a partir da gua destilada, podendo haver outro tipos de padres de analise . Retira-se o branco do aparelho, joga-se a gua destilada em um bquer para descarte, e coloca-se o aminocido desejado na cubeta, sendo esta colocada no aparelho, fecha-se a tampa, e observa-se o valor da absorbncia que aparece. Coloca-se o aminocido no bquer em que se apresentava inicialmente, a cubeta deve ser rinsada com gua destilada algumas vezes, no caso foi rinsado para iniciar o processo novamente com outro comprimento de onda, deve-se obter outro branco, colocar o aminocido novamente, e observar a absorbncia, esse processo feito at o comprimento de onda desejado. A cada aminocido foi feita uma anlise de absorbncia em variados comprimentos de onda. Determinao de um aminocido desconhecido: A segunda parte do experimento deve-se utilizar uma proveta, um suporte universal, Phmetro ou condutivmetro da marca Digimed modelo DM-32, soluo do aminocido a ser analisado, sendo no caso o aminocido A, que deve ser titulado com uma soluo de 0,05N de KOH, a titulao deve ser feita com adio ao aminocido de 0,5ml de cada vez. Primeiramente deve-se calibrar o Phmetro, esse processo feito com soluo tampo pr determinada de Ph iguais a 6,89 e 4,01, deve-se entrar no menu do Phmetro, e colocar na opo de calibrao, o Phmetro pede para adicionar a soluo desejada, por

exemplo 6,89, ele l a soluo, pedindo em seguida a soluo 4,01, o Phmetro l novamente a soluo, e est pronta a calibrao. Em seguida deve-se colocar em um bquer 10 ml de soluo contendo o aminocido A, e analisar no Phmetro o valor do Ph presente na soluo, e anota-se o valor inicial sem a adio do KOH. Com o auxilio da proveta, que deve estar instalada no suporte universal, adicione um volume na proveta de KOH 0,05N considervel, por exemplo 40 ml, e transfira soluo do aminocido 0,5ml da base, agite bem, e coloque no Phmetro, e anote o valor dado. Esse processo deve ser repetido at o momento em que o Ph estiver passado o valor de aproximadamente 12. Isso dar dados suficientes para analisar os Pks do aminocido A, e determinar o PI, ponto isoeltrico, juntamente com a determinao de qual aminocido foi analisado. Aps esse processo experimental, deve-se analisar os Phs com a adio da mesma soluo da base KOH 0,05N, mas nessa anlise, adicione 2ml de formaldedo uma nova soluo de 10ml do aminocido A, e repita o mesmo processo anterior, anotando-se o valor do Ph inicial sem adio da base, e aps a adio de KOH, o mesmo deve ser feito, analisar at as proximidades aps o valor de Ph 12. No esquecer de agitar bem antes de medir os valores de PH. Resultados e Discusso: A partir da analise das absorbncias dos 3 aminocidos com um espectrofotmetro, atravs dos procedimentos e metodologia apresentados anteriormente nesse relatrio, obteveram-se os resultados que se seguem. O primeiro aminocido analisado foi a leucina, analisou-se os comprimentos de ondas de 220nm a 340nm, analisado de 20 em 20nm,obteveram-se os seguintes dados (tabela1):
Comprimento de onda(nm) 220 240 260 Absorbncia 3 0,264 0,051

280 300 320 340

0,044 0,016 0,01 0,018

Tabela1: anlise da leucina no espectrofotmetro, determinando-se a absorbncia em diferentes comprimentos de ondas.

O segundo aminocido analisado foi o triptofano, analisou-se os comprimentos de ondas de 220nm a 340nm, analisado tambm de 20 em 20nm de comprimento de onda. Obteve-se os seguintes dados (tabela2):
Comprimento de onda (nm) 220 240 260 280 300 320 340 Absorbancia 3 3 3 2,699 2,699 0,179 0,113

Tabela2: anlise da triptofano no espectrofotmetro, determinando-se a absorbncia em diferentes comprimentos de ondas.

Os resultados obtidos de absorbncia foram muito altos, sendo assim a transmitncia muito baixa, isso indica que o material observado estava bem concentrado, necessitando de uma diluio com gua destilada, para determinar o melhor comprimento de onda de absorbncia que cada aminocido detm, no caso do triptofano fez-se uma diluio de 100 vezes da soluo que havia,

e analisou-se de 220nm a 360nm, obtendo-se os seguintes dados (tabela3):


Comprimento de onda (nm) 220 240 260 280 300 320 340 360 Absorbancia 3 0,602 1,721 2,301 0,197 0,004 0,011 0,006

Tabela3: anlise da triptofano no espectrofotmetro diluda 100 vezes, determinando-se a absorbncia em diferentes comprimentos de ondas.

Observa-se na tabela 3 que houve uma maior transmitncia em alguns comprimentos de onda, sendo mais vivel em anlise dos dados, do que sem a diluio. O terceiro aminocido observado foi a fenilalanina, este aminocido foi diludo 10 vezes j inicialmente e analisou-se os comprimentos de ondas de 220nm a 360nm, observando-se tambm de 20 em 20nm de comprimento de onda. Obteve-se os seguintes dados (tabela4):
Comprimento de onda (nm) 220 240 260 280 300 320 340 360 Absorbncia 2 0,548 1,229 0,011 0,004 0,005 0,002 0,57

Tabela4: anlise da fenilalanina diluda 10 vezes no espectrofotmetro, determinando-se a absorbncia em diferentes comprimentos de ondas.

Com a diluio inicial obteve-se uma menor absorbncia, aumentando-se assim a transmitncia do feixe de UV/vis.

A partir dos dados obtidos, pode-se plotar um grfico com os 3 aminocidos (grafico1):
Absor bnci a
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 220 240 260 280 300 320 340 Comprimento de onda (nm) 360 Triptofano 1:100 Fenilalanina 1:10 Leucina
V KOH 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 C/ Formaldeido 2,39 2,52 2,63 2,67 2,71 2,78 2,82 2,90 2,95 3,04 3,10 3,18 3,32 3,42 3,55

Curva de Absorbncia

Grafico1: grfico analisando a absorbncia com os diferentes comprimentos de onda.

Com a realizao do experimento para determinao de um aminocido desconhecido, obtiveram-se os seguintes resultados de Phs com e sem adio de formaldedo (tabela 5):
Puro 2,48 2,54 2,60 2,62 2,69 2,75 2,81 2,86 2,95 3,05 3,18 3,33 3,56 3,99 6,10 V KOH 25,50 26,00 26,50 27,00 27,50 28,00 28,50 29,00 29,50 30,00 30,50 31,00 31,50 32,00 32,50 C/ Formaldeido 7,28 7,55 7,83 8,64 9,20 9,44 9,65 9,76 9,92 9,99 10,01 10,08 10,12 10,12 10,21 Puro 10,06 10,13 10,21 10,30 10,40 10,50 10,62 10,74 10,87 10,99 11,12 11,25 11,36 11,45 11,53

7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 13,50 14,00 14,50 15,00 15,50 16,00 16,50 17,00 17,50 18,00 18,50 19,00 19,50 20,00 20,50 21,00 21,50 22,00 22,50 23,00 23,50 24,00 24,50 25,00

3,70 4,00 4,33 4,44 4,97 5,42 5,80 5,98 6,11 6,16 6,21 6,27 6,34 6,38 6,17 6,37 6,50 6,53 6,55 6,69 6,69 6,59 6,51 6,53 6,54 6,56 6,65 6,86 6,95 6,81 7,09 7,11 7,14 7,29 7,13 7,14

7,48 7,93 8,11 8,26 8,37 8,44 8,51 8,57 8,63 8,69 8,74 8,80 8,85 8,90 8,95 9,00 9,05 9,09 9,13 9,17 9,22 9,26 9,31 9,35 9,40 9,44 9,49 9,54 9,58 9,64 9,69 9,75 9,80 9,86 9,93 9,99

33,00 33,50 34,00 34,50 35,00 35,50 36,00 36,50 37,00 37,50 38,00 38,50 39,00 39,50 40,00 40,50 41,00 41,50 42,00 42,50 43,00 43,50 44,00 44,50 45,00 45,50 46,00 46,50 47,00 47,50 48,00 48,50 49,00 49,50 50,00 50,50 51,00 51,50 52,00

10,18 10,27 10,31 10,35 10,38 10,39 10,43 10,48 10,50 10,51 10,55 10,56 10,58 10,57 10,65 10,66 10,69 10,70 10,73 10,73 10,74 10,78 10,78 10,81 10,80 10,81 10,84 10,85 10,89 10,93 10,93 10,96 11,00 11,03 11,05 11,08 11,12 11,13 11,17

11,60 11,66 11,70 11,75 11,79 11,83 11,87 11,91 11,99 12,02 12,04

Tabela5: Tabela da determinao de Phs, com diferentes volumes de KOH 0,05, na soluo de aminocido desconhecido sem e com formaldedo. V no titulo da tabela representa o volume, c/formaldedo a coluna de Phs do aminocido em que se adicionou 2ml de formaldedo, e puro a coluna com Phs do aminocido em questo.

Atravs dessa tabela, foi possvel plotar-se um grfico, sendo este (grafico2):

Com Formaldeido 14 12 10 Ph 8 6 4 2 0
0, 00 3, 50 7, 00 10 ,5 0 14 ,0 0 17 ,5 0 21 ,0 0 24 ,5 0 28 ,0 0 31 ,5 0 35 ,0 0 38 ,5 0 42 ,0 0 45 ,5 0 49 ,0 0

Pura

Volum e KOH (m l)

Grafico2: grfico dos diferentes Phs, em funo do aumento do volume de KOH, em uma soluo de aminocido, com e sem adio de formaldedo

A partir da anlise do grfico 2, fica ntido que o comprimento de onda com maior absorbncia para o triptofano, diludo 100 vezes, o comprimento de onda de 280nm, para a fenilalanina, diluda 10 vezes, o comprimento de onda de 260nm, e para a leucina que no apresenta um pico de absorbncia considervel e ntido como os outros aminocidos de 240nm. De acordo com a literatura o comprimento de onda com maior absorbncia do triptofano e da leucina de 275nm, sendo que o triptofano se encaixa dentro do esperado a ser obtido, j a leucina foge do valor esperado. J a fenilalanina est dentro do esperado tambm, apresentando um valor prximo aos 260 na literatura. J no experimento para a determinao do Aminocido, no caso utilizado foi para determinar o aminocido A, obtiveram-se os seguintes dados (tabela6):

puro pkCOOH pkNH3 pkNH3 cadeia PI 2,81 9,05 10,76 9,91

c/ formaldeido 2,80 6,40 10,55 8,48

Tabela6: tabela de Pks da soluo do aminocido puro e com formaldedo, e determinao de seus pontos isoeltricos(PI).

Os valores determinados, presentes na tabela6, em relao ao aminocido puro, leva a determinar que o aminocido analisado a lisina, pelas proximidades dos valores obtidos, com alcance de 3 patamares, determinando assim que esse aminocido um aminocido de cadeia lateral carregada. J com a presena do formaldedo, h a combinao do formaldedo com os aminogrupos livres, que no esto protonados, sendo que h liberao de H+ titulvel quando o formaldedo se combina com o aminogrupo livre, gerando assim um aumento da concentrao de H+, diminuindo assim o valor do Ph, reduzindo assim o valor do Pk do grupo amino do aminocido. Concluso: Com a utilizao da literatura, pode-se concluir que no experimento para determinar a absorbncia dos 3 aminocidos conhecidos, o nico que foge dos valores literais a leucina, apresentando um valor de comprimento de onda de 240nm, sendo que o ideal de absorbncia para a leucina de 275nm, essa diferena deve ser referida um erro do experimentador no manuseio do material de analise e na utilizao do espectrofotmetro, por falta de experincia. J no experimento para a determinao do aminocido A, concluise que o aminocido pesquisado deva ser a lisina, sendo que na literatura, o Pk do COOH apresenta um valor de 2,18, o Pk do NH3 de 8,95, e do radical de 10,53, analisando com os valores obtidos esse o aminocido que se aproxima, no apresentando valores exatos, mas em comparao aos outros aminocidos e

tambm a grficos predeterminadas da literatura, o que se pode concluir.

Bibliografia: Lehninger, Albert Lester. Bioqumica;traduo da 2 edio americana, superviso: Jos Reinaldo Magalhes. Fundamentos moleculares da clula, volume 1. So Paulo: Edgar Blcher, 1976.262p; Voet, Donald. Fundamentos de bioqumica: a vida em nvel molecular / Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt; traduo Jaqueline Josi Sam Rodrigues 2.ed.- Porto Alegre: Artmed, 2008. 1264p.