UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS

DIGESTIBILIDADE E PARMETROS RUMINAIS EM BOVINOS ALIMENTADOS COM SILAGEM DE MILHO E DOSES CRESCENTES DO PRODUTO BASE DE PRPOLIS LLOSC1

Autor: Flvia Weiller Daniel Orientadora: Prof. Dr. Lcia Maria Zeoula Coorientadora: Prof. Dr. Lucimar Pontara Peres de Moura

MARING Estado do Paran Junho 2011

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS

DIGESTIBILIDADE E PARMETROS RUMINAIS EM BOVINOS ALIMENTADOS COM SILAGEM DE MILHO E DOSES CRESCENTES DO PRODUTO BASE DE PRPOLIS LLOSC1

Autor: Flvia Weiller Daniel Orientadora: Prof. Dr. Lcia Maria Zeoula Coorientadora: Prof. Dr. Lucimar Pontara Peres de Moura

Dissertao apresentada, como parte das exigncias para obteno do ttulo de MESTRE EM ZOOTECNIA, no Programa de Ps-graduao em Zootecnia da Universidade Estadual de Maring rea de concentrao Produo Animal.

MARING Estado do Paran Junho 2011

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A Deus, por me guiar nessa caminhada difcil, Sempre sendo paciente com seu filho;

av Luiza Zanin, Pelo colo e carinho e conversas que me ajudaram A seguir em frente.

Aos meus pais: Ivaldo Daniele Luzia Daniel, Pelo incentivo, fora, confiana, E pelos bons conselhos nas horas decisivas.

Ao meu amigo e namorado Hlio Garcia, Por sempre me incentivar e ajudar nessa caminhada.

DEDICO

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por me ajudar e cuidar em terras desconhecidas; Universidade Estadual de Maring e ao Programa de Ps-graduao em Zootecnia, pela oportunidade e confiana para realizar este trabalho; Prof. Dr. Lucia Maria Zeoula, pelo ensinamento, orientao, profissionalismo, pacincia, compreenso e por confiar este valoroso trabalho; Prof. Dr. Lucimar Pontara Peres de Moura, por me coorientar e a Profa. Dra Selma Franco pela preparao dos produtos base de prpolis; Ao Profo. Dr. Luiz Juliano Valrio Geron (UEMAT), pela tabulao dos dados e auxlio nas anlises estatsticas. Ao Joo Batista Gonalves Costa Junior, pela amizade, carinho, incentivo, bons papos, brincadeiras e pelos esclarecimentos das tcnicas experimentais e laboratoriais e pelo auxlio e socorro nas horas de dvida; Ao Denis Calvis, pela amizade, pelo companheirismo nos estudos e principalmente no experimento na fazendinha da UEM (FEI); Aos meus companheiros de trabalho, Eduardo Narostegam da Paula, Rafael Barreiros Samensari, rica Machado, Bruno Montero, Karla Bioni, Marival Gustavo de Oliveira, Nathlia Nissimura, Fabiano Simioni, Gabriel Barreiros Samensari, Vinicius Okamura (Paj), Marcel de Brito, pela grande ajuda e amizade criada durante o experimento. Sem vocs no teria conseguido fazer nada. Jos Carlos da Silva (Z) e Ezuprio Salim da Silva (Zupa), pela enorme colaborao na execuo deste trabalho, pelo caf e pelas boas risadas no dia a dia da fazendinha da UEM ;

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s tcnicas de laboratrio, Creuza Azevedo e Cleuza Volpato, pela ajuda nas anlises laboratoriais; Aos meus pais, Ivaldo Daniel e Luzia Daniel, por sempre acreditarem em mim, me incentivar, por todo carinho, pacincia e principalmente por terem dado todos os valores e ensinamentos que trago comigo; s minhas irms, Laisa e Letcia Daniel; Ao meu Amor Helio Garcia, pela amizade, companheirismo, amor, e principalmente pelo apoio e pacincia em me aturar nos momentos difceis.

BIOGRAFIA

Flvia Weiller Daniel, filha de Ivaldo Daniel e Luzia Weiller Daniel, nasceu em Maring- Paran, no dia 20 de dezembro de 1985. Em dezembro de 2007, concluiu o Curso de Zootecnia, pela Universidade Estadual de Maring UEM. Em maro de 2009, iniciou no Programa de Ps-graduao em Zootecnia, em nvel de Mestrado, rea de concentrao Produo Animal, na Universidade Estadual de Maring, com estudos na rea de Nutrio de Ruminantes. No ms de junho de 2011, submeteu-se banca examinadora para defesa da Dissertao de Mestrado.

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NDICE

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LISTA DE TABELAS................................................................................ LISTA DE FIGURAS................................................................................. INTRODUO.......................................................................................... REFERNCIAS......................................................................................... OBJETIVOS GERAIS ............................................................................... Digestibilidade e parmetros ruminais em bovinos alimentados com silagem de milho e doses crescentes do produto base de prpolis LLOSC1 ................................................................................................... Resumo ....................................................................................................... Abstract ...................................................................................................... Introduo .................................................................................................. Material e Mtodos .................................................................................... Resultados e Discusso .............................................................................. Concluses ................................................................................................. Referncias ................................................................................................. vii Viii 1 7 11

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LISTA DE TABELAS

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Tabela 1. Tabela 2. Composio qumica dos ingredientes e da dieta............. Consumo de nutrientes das dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOSC1............................... Tabela 3. Coeficiente de digestibilidade (CD) das dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOSC1............. Tabela 4. Volume ruminal, teor de matria seca da digesta ruminal e cintica de slidos no rmen de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis Tabela 5. LLOSC1...................................................................... Cintica das fraes slidas no trato gastrintestinal de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOSC1................................................. Tabela 6. Cintica da frao lquida do rmen de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de Tabela 7. prpolis LLOSC1.............................................................. Volume urinrio, excrees urinrias dos derivados de purinas, sntese de protena microbiana e eficincia de sntese microbiana (g PBmic1/ 100 g de NDT) de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOSC1................................................. ................................................................................. 30 29 28 26 22 21 16

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LISTA DE FIGURAS

CAPITULO II Figura 1. Valores de pH do lquido ruminal dos bovinos em funo do tempo aps a alimentao para as diferentes doses de flavonoides medidos em apigenina

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(mg/animal/dia).............................................................. Figura 2. Valores da concentrao do nitrognio amoniacal (NNH3) mg/100 mL do lquido ruminal de bovinos em funo do tempo aps a alimentao para as diferentes doses de flavonoides medidos em apigenina

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(mg/animal/dia)..............................................................

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INTRODUO

Fermentao ruminal e aditivos dietticos

Em ruminantes, a fermentao de alimentos ingeridos produz cidos graxos de cadeia curta (AGCC), amnia, gases (dixido de carbono e metano) e clulas microbianas. A fermentao de carboidratos e protenas, que resulta em produo de AGCC no rmen, representa a maior fonte de energia (65 a 75% da energia metabolizvel ingerida), tambm acompanhada pela produo de hidrognio. Somente pequena parte deste hidrognio usada para crescimento microbiano e saturao de cidos graxos de cadeia longa, sendo a maior parte utilizada por bactrias metanognicas para produo de metano. A produo de dixido de carbono e metano representa grande perda de energia ingerida no alimento. Segundo Lana et al. (1998), a produo de gs metano pelas bactrias ruminais e intestinais (Methanobrevibacter spp. e Methanomicrobium mobile) corresponde a uma perda energtica de at 13% em relao energia do alimento ingerido. Como visto, o emprego de estratgias que melhorem os parmetros de digestibilidade e de fermentao ruminal, visando aumentar o aproveitamento dos alimentos e reduzir as perdas energticas por metano, representam benefcios nutricionais. Nesse contexto, a descoberta de compostos que controlam o metabolismo aumentando a eficincia de utilizao de alimentos e proporcionando uma maior produo animal, deu origem a uma classe de substncias denominadas de aditivos alimentares que em termos simplificados, objetivam: (1) melhorar os processos benficos, (2) minimizar, eliminar ou alterar os processos ineficientes, (3) minimizar, eliminar ou alterar os processos prejudiciais ao animal hospedeiro. Exemplos de

processos cuja maximizao seria vlida em todas as circunstncias so: a estabilizao do ambiente ruminal, a degradao da fibra, a fermentao do lactato, a formao de cido propinico e a converso de compostos nitrogenados no proteicos em protena microbiana, enquanto os processos que deveriam ser minimizados incluem a produo de metano, degradao da protena e absoro de amnia (Nagaraja et al., 1997; Nicodemo, 2001). De maneira geral, os aditivos, por diferentes mecanismos, alteram a fermentao ruminal (pela maior formao de cido propinico, diminuio da formao de metano, reduo da protelise e desaminao da protena diettica no rmen), estabilizam o ambiente ruminal e protegem o trato gastrintestinal de agentes patognicos (Nicodemo, 2001). Existe grande variedade de aditivos alimentares com potencial para influenciar os componentes do metabolismo do rmen, entre eles: antibiticos, agentes defaunantes, enzimas microbianas, suplementao com cidos graxos e lipdios, agentes tamponantes, ionforos e aditivos microbianos. Entretanto, alguns vm sofrendo restrio quanto ao seu uso. Podem-se citar como exemplos os ionforos (monensina, lasalocida e salinomicina) que, provavelmente, so os aditivos mais pesquisados em dietas para ruminantes, cujo uso est proibido na Unio Europeia (UE) desde 1 de janeiro de 2006. Diante desses fatos, a busca por compostos naturais capazes de melhorar o aproveitamento da dieta oferecida aos animais, alm de diminuir o risco de resduos nos produtos oriundos das criaes, a fim de garantir maior segurana e qualidade dos alimentos e favorecer o ganho em competitividade para esses produtos, tem aumentado acentuadamente nos ltimos anos. Assim, a prpolis tem sido estudada como alternativa natural na alimentao de ruminantes, porque possui inmeras propriedades teraputicas (como sua atividade antimicrobiana), efeitos sobre a permeabilidade da membrana citoplasmtica, capaz de alterar o fluxo de ons atravs dessa (Mirzoeva et al., 1997), o que a caracteriza como substncia ionfora. Entretanto, para a sua utilizao, a prpolis passa por diversos procedimentos desde sua coleta at a preparao dos extratos e, para que isso ocorra, pesquisadores tm buscado a padronizao da prpolis, a fim de desvendar, com mais clareza, suas propriedades biolgicas.

Prpolis
O uso da prpolis como tratamento teraputico natural remonta de 5.000 anos. Segundo Andra et al. (2005), sacerdotes do antigo Egito faziam uso deste composto natural para embalsamar os mortos. Posteriormente, os gregos utilizaram-na na forma de unguento e, por conseguinte, a eles se devem a etimologia da palavra: pro, significa em defesa de e polis, cidade, ou seja, em defesa da cidade (colmeia). A prpolis o produto oriundo de substncias resinosas, gomosas e balsmicas colhidas pelas abelhas, de brotos, flores e exsudados de plantas, nas quais as abelhas acrescentam secrees salivares, cera e plen para a elaborao final do produto. A prpolis atua na vedao e proteo da colmeia contra o ataque de insetos e microrganismos e auxilia na manuteno da umidade e temperatura da colmeia (Brasil, 2001). A composio qumica da prpolis bastante complexa e variada, estando intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada regio visitada pelas abelhas (Ghisalberti, 1979), a qual influencia sua atividade biolgica (Andra et al., 2005). De modo geral, contem de 50 a 60% de resina e blsamos, 30 a 40% de ceras, 5 a 10% de leos essenciais, 5% de gros de plen, alm de microelementos como alumnio, clcio, cromo, estrncio, ferro, cobre, mangans, nquel, silcio, vandio, zinco e pequenas quantidades de vitaminas A, B1, B2, B6, C e E (Ghisalberti,1979). At o momento j foram identificados mais de 300 compostos qumicos na prpolis, entre eles flavonoides, cidos graxos, cidos aromticos, terpenoides, aldedos, lcoois, cidos alifticos e steres, aminocidos, esteroides e acares (Pereira et al., 2002). O maior grupo dos flavonoides (flavonas, flavonis, flavononas, dihidroflavonis) (Greenawayet al., 1990; Bankova et al., 1992) so descritos como os principais responsveis pela atividade antimicrobiana. Segundo Mirzoeva et al. (1997), a prpolis exerce funo bacteriosttica sobre bactrias gram-positivas e algumas gram-negativas, aparentemente pela modificao do status bioenergtico da membrana bacteriana e inibio de sua motilidade, o que remete atividade dos ionforos (Ghisalberti (1979); Vargas et al., (1994); Goulart (1995); Park et al., (1998a); Park et al., (2000)). A prpolis tem demonstrado tambm importantes propriedades teraputicas, como atividades antimicrobiana (Gonsales et al., 2006), antiinflamatria (Montipied et al., 2003), antifngica (Longhini et al., 2007), cicatrizante (Ghisalberti, 1979), anestsica

(Burdock, 1998), anticarcinognica (Menezes, 2005), antioxidante (Park et al., 1998b), dentre outras. A presena de compostos fenlicos, principalmente os flavonoides, explica em parte a grande diversidade de propriedades biolgicas relatadas na literatura (Park et al., 1995; Banskota et al., 1998). Os flavonoides so compostos fenlicos de baixo peso molecular que tm como base um ncleo flavana, constitudo de 15 carbonos dispostos numa configurao C6-C3-C6. Segundo Cook & Samman (1996), a atividade bioqumica dos flavonoides e seus metablitos depende da estrutura qumica e orientao relativa das vrias partes da molcula. As propriedades biolgicas da prpolis obviamente esto diretamente ligadas sua composio qumica e este, possivelmente, o maior problema para o uso da prpolis em fitoterapia, tendo em vista que a sua composio qumica varia tambm com a poca da colheita, assim como com a espcie da abelha (no caso brasileiro tambm a variabilidade gentica da Apis mellifera) (Pereira et al., 2002). Portanto, fica evidente a necessidade de mais pesquisas com a prpolis, para que haja maior entendimento de suas atividades biolgicas, principalmente pela grande diversidade em sua composio.

Efeito da prpolis em dietas para ruminantes

A avaliao da atividade antimicrobiana da prpolis foi detectada por Pinto et al. (2001), os quais avaliaram a sensibilidade, in vitro, de amostras de bactrias grampositivas e gram-negativas isoladas do leite de vacas com mastite, h diferentes extratos de prpolis. Os pesquisadores constataram o que j foi observado em outros trabalhos, ou seja, a prpolis detm maior poder antibacteriano sobre as espcies gram-positivas, sendo pouco eficaz ou incapaz de inibir o crescimento de bactrias gram-negativas. A eficcia da prpolis sobre a manipulao da fermentao ruminal foi testada por diversos pesquisadores. Oliveira et al. (2004) avaliaram a fermentao da protena de trs fontes de nitrognio (tripticase, farelo de soja e farinha de peixe), com ou sem monensina ou extrato de prpolis e estes observaram que a prpolis reduziu a produo de amnia nos tratamentos contendo tripticase e farelo de soja, induzindo ao acmulo de protena solvel no meio de incubao. Ainda Oliveira et al. (2006) estudaram os efeitos in vitro da monensina e prpolis sobre a fermentao ruminal de aminocidos. O experimento foi realizado em duas fases: na 1a fase do experimento, foram feitas

transferncias dirias de inculos at o 10o dia e iniciou a 2a fase no 11o dia, efetuando as combinaes dos tratamentos da 1a fase.. Observou-se que na 1a fase, o ionforo e a prpolis no aumentaram significativamente a produo de amnia em comparao ao controle, porm a prpolis foi mais eficiente em diminuir a produo de amnia que a monensina e ainda reduziu a produo de amnia e a atividade especfica de produo de amnia (AEPA) na 2a fase, independentemente do tratamento aplicado. Ao estudar a prpolis in vivo e in vitro Stradiotti Jnior et al. (2004a), verificaram que o extrato de prpolis no afetou o consumo de matria seca, o pH ruminal, as concentraes de amnia e de protena microbiana nem as propores molares dos cidos graxos volteis (AGV), porm observaram aumento da concentrao de cidos graxos volteis e a diminuio da atividade especfica de produo de amnia. Os mesmos autores (Stradiotti Jr et al., 2004b), em um experimento in vitro, verificaram que o extrato de prpolis reduziu a produo final total e a produo final de gases para carboidratos fibrosos, e aumentou a taxa de digesto especfica para carboidratos fibrosos e no fibrosos. A reduo da produo total de gases pode ser atribuda ao efeito da prpolis em aumentar a concentrao molar de propionato, com consequente diminuio da relao acetato:propionato. No segundo experimento avaliaram diferentes diluies de extrato de prpolis (0; 13,7; 33,3; e 66,7%), em analogia monensina sdica, e verificaram que o maior nvel (66,7%) mostrou-se mais eficiente que a monensina em todos os tratamentos para a menor produo final de gases. Esta constatao pode ser atribuda ao da prpolis sobre bactrias produtoras de formato e H2 e a inibio de bactrias fermentadoras de celulose e produtoras de acetato. Ao avaliar a ao da prpolis quanto aos parmetros de fermentao ruminal, Lana et al. (2005) verificaram que no houve efeito de nveis de leo de soja, extrato etanlico de prpolis e prpolis bruta moda sobre o consumo de matria seca e de nutrientes e sobre os parmetros ruminais estudados em cabras leiteiras. Prado et al. (2010a) avaliou diferentes produtos base de prpolis denominados LLOS, que diferiram nas concentraes de prpolis (A, B, C, D) e nos teores alcolicos (1, 2 e 3) usados nas extraes dos compostos ativos. Verificou que entre os produtos LLOSA1, LLOSB2, LLOSC3 e LLOSD4 e o ionforo monensina. O LLOSC3 proporcionou o maior coeficiente de digestibilidade in vitro da matria seca (DIVMS) em relao a adio de monensina e a dieta controle (50:50 de volumoso:concentrado).

Segundo o autor, este fato pode ser resultado da melhor extrao de um grupo de flavonoides especficos que tenham ao mais eficaz contra as bactrias gram-positivas que as outras combinaes. No mesmo trabalho, foi avaliado o mesmo produto LLOS e o ionforo monensina sobre a DIVMS de raes com 100% de volumoso. Observou-se melhora na fermentao com a adio dos produtos LLOSB2e LLOSC3, que refletiram em maior valor de DIVMS. Prado et al. (2010c) avaliaram o efeito da administrao de produtos base de monensina sdica ou prpolis LLOSB3 e LLOSC1 sobre o consumo, a digestibilidade total e parcial e as caractersticas ruminais em bubalinos alimentados com dieta base de forragem. Os consumos de matria seca (CMS) e nutrientes no diferiram entre os aditivos testados. A adio de LLOSC1 propiciou maiores coeficientes de digestibilidade total em relao ao controle para MS, FDN, carboidratos totais e NDT. A dieta com monensina no diferiu da controle e aquela com LLOSB3 foi semelhante as outras dietas. Aumento no fluxo e maior digestibilidade de PB nos intestinos foram verificados com o uso dos aditivos em relao dieta controle. Aps a alimentao no houve diferena na concentrao de nitrognio amoniacal no rmen entre dietas e o valor mximo foi de 21,26 mg/100 mL. Menor valor de pH ruminal e maiores concentraes de acetato e de butirato foram verificados para LLOSB3. A taxa de passagem de lquido no diferiu entre as dietas, porm, maior volume ruminal foi verificado com o uso dos aditivos. Os autores concluram que o aditivo LLOSC1 superior monensina em aumentar a energia digestvel para bubalinos alimentados com dietas base de forragem. Prado et al. (2010b) avaliaram os efeitos da utilizao de produtos contendo prpolis em duas concentraes (B e C) e duas extraes alcolicas (1 e 3) e de monensina sdica em dieta base de forragem sobre o consumo, a digestibilidade total e parcial e as caractersticas ruminais em bovinos. Os consumos mdios de matria seca e nutrientes, no foram afetados pelas dietas, exceto o de NDT, que foi maior nos animais alimentados com a dieta controle. O fornecimento dos aditivos, principalmente prpolis, reduziu a digestibilidade total de matria seca, protena bruta e NDT. A digestibilidade total da fibra em detergente neutro (FDN) foi semelhante entre aditivos e menor que nos animais controle. A incluso de prpolis refletiu em menor pH ruminal e maior produo de acetato e AGV totais e a monensina propiciou a menor razo acetato:propionato.

Zawadzki et al. (2011) testaram se o produto base de prpolis LLOS poderia substituir a monensina sdica no desempenho de tourinhos Nelore terminados em confinamento, e verificaram que a converso alimentar da matria seca para a dieta com adio do produto LLOSC1++ (duas vezes a dosagem de LLOSC1) melhorou em 20,14% quando comparada ao tratamento controle e 20,5% em comparao ao tratamento com monensina. O ganho mdio dirio (GMD), em kg/dia, tambm foi superior para a prpolis, assim como o peso vivo final (PVF), em relao aos outros tratamentos mostrando melhora no desempenho com o uso da prpolis, em comparao com a monensina. Tendo como base os resultados mostrados acima se observa a necessidade de mais pesquisas para comprovar a eficcia da prpolis, visto que esta se mostra muito eficiente em sua utilizao como um aditivo com efeito ionforo em dietas de ruminantes. Mas, tambm h muitas dvidas em relao ao seu modo de ao, e tantos outros pontos que ainda no foram respondidos, porque o seu mecanismo de ao sofre influencia no s de sua composio qumica e tambm de seu modo de extrao, processo de secagem, o teor alcolico e o modo como fornecido ao animal.

REFERNCIAS
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OBJETIVOS GERAIS

Objetivou-se avaliar a incluso do produto base de prpolis LLOS C1, como aditivo, em quatro doses, LLOS C1, LLOS C1+, LLOS C1++ e LLOS C1+++, em dieta contendo 60% de silagem de milho e 40% de concentrado, fornecida a bovinos mestios castrados, confinados, sobre as seguintes variveis: Digestibilidade total da matria seca e dos demais nutrientes da rao; pH ruminal; nitrognio amoniacal do lquido ruminal; cintica de trnsito de slidos e lquido; volume ruminal e eficincia de sntese microbiana.

Digestibilidade e parmetros ruminais em bovinos alimentados com silagem de milho e doses crescentes do produto base de prpolis LLOSC1 Resumo:O experimento foi conduzido para avaliar a adio do produto base de prpolis (LLOSC1) em concentrados para bovinos, atravs do ensaio de digestibilidade total da MS e dos nutrientes, da determinao do pH ruminal, nitrognio amoniacal, cintica de trnsito de slidos e lquido, volume ruminal e eficincia de sntese microbiana. Foram utilizados 5 bovinos mestios (zebu x holands), machos,

castrados, com 437,04 17,61 kg de peso vivo, distribudos em cinco tratamentos: sendo um tratamento controle sem adio de prpolis, e quatro tratamentos com adio crescente de produto base de prpolis LLOSC1 que forneceram :15,09; 30,18; 45,27; 60,36 mg de flavonoides totais quantificados em mg de apigenina/animal/dia. A dieta utilizada constituiu de nveis de 70,76% de NDT e 13,19% de PB, adotando a ingesto de 2,00% do peso vivo com base na matria seca. Os animais foram alojados em baias individuais, sendo a dieta fracionada em duas refeies nos horrios 8h e 16h. Cada perodo experimental foi constitudo de 35 dias, sendo 14 dias para adaptao, 11 dias de coletas e os 10 dias restante em vazio (sem receber os aditivos). O delineamento utilizado foi Quadrado Latino 5x5. O aumento da dose do produto LLOSC1 no influenciou (P>0,05) a digestibilidade total da MS e nutrientes, a cintica de trnsito de slidos e lquidos, o pH ruminal e nitrognio amoniacal, como tambm a produo microbiana(P>0,05), porm influenciaram a excreo de cido rico e alantona (P<0,05). Conclui-se que as doses crescentes dos produtos LLOSC1 no alteram as variveis estudadas. Palavras-chave: aditivo, flavonoides, produo microbiana, prpolis

Digestibility and ruminal parameters of cattle fed with corn silage and increased doses of the product based on propolis LLOSC1

Abstract:The objective was to evaluate the total digestibility, rumen pH, ammonia, transit kinetics of solid and liquid, volume and ruminal microbial efficiency of feedlot cattle receiving 60% forage and 40% concentrate with the addition of a product based propolis (LLOS). Ther were used five crossbred, castrated male with 437.04 17.61 kg of body weight in a 5x5 Latin square, divided into five treatments: control treatment without the addition of propolis (0.0 mg apigenin / day) and four treatments with propolis-based products (LLOS) with different doses (15.09, 30.18, 45.27, 60.36 mg apigenin / day). The diet was formulated to contain 70.76% 13.19% TDN and CP. To determine the total digestibility it was made the total collection of feces for 72 hours, the microbial production was estimated from purine derivatives in urine, collected by the spot method, the transit kinetics of solid and liquid and ruminal volume were made by rumen evacuations. Variables were evaluated by analysis of variance with 5% probability. Increasing the dose of the product LLOS C1 did not affect the total digestibility of DM and nutrients, the transit kinetics of solids and liquids, the pH and ammonia nitrogen, and also the microbial growth, however influenced the excretion of uric acid and allantoin. Keywords: additive, digestibility, ruminal fermentation, microbial production, propolis,

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Introduo
Entre as exigncias impostas pelos mercados importadores dos produtos de origem bovina, a observncia de que os animais tenham sido alimentados com raes isentas de antibiticos aditivos e promotores de crescimento considerada de suma importncia. Este tipo de exigncia tambm observado no mercado interno por intermdio de movimentos de associaes de consumidores. Logo, a busca e utilizao de aditivos naturais que possam suprir, ao menos em equivalncia, o uso desses antibiticos no quesito produtividade constituem importante diferencial de qualidade, por isentarem os produtos de qualquer toxicidade, favorecendo o ganho em competitividade para esses produtos. A prpolis um produto natural proveniente de substncias (resinas) coletadas das plantas, pelas abelhas, e misturadas com suas secrees. As abelhas modificam a composio original da resina da planta misturando-as com secrees das glndulas hipofaringeais, especialmente -glicosidases. Dessa forma, os flavonides heterosdeos, principais compostos de ao antibacteriana da prpolis, so hidrolisados para a forma de agliconas livres, o que aumenta a ao farmacolgica destes compostos (Park & Ikegaki, 1998). Objeto de estudo em diversos pases, a prpolis tem demonstrado importantes propriedades teraputicas, como atividades antimicrobianas, antiinflamatrias e cicatrizantes (Ghisalberti, 1979). Segundo Mirzoeva et al. (1997), a prpolis e alguns de seus componentes possuem efeitos sobre a permeabilidade da membrana citoplasmtica bacteriana aos ons, causando a dissipao do potencial de membrana, o que a caracteriza como substncia ionfora. Logo, a atividade antimicrobiana da prpolis ocorre pela inibio de bactrias classificadas como gram-positivas (Ghisalberti, 1979; Vargas et al., 1994; Goulart, 1995;Park et al., 1998a; Park et al., 2000). Entretanto sua utilizao tem sido limitada pela grande variabilidade nas amostras, devido s fontes vegetais. Ento, com o intuito de eliminar essas variveis foi produzido um produto base de prpolis denominado LLOS*(PI 0605768-3), que consiste de um ncleo com extrato seco de prpolis (em p), o qual pode ser adicionado rao e fornecido aos animais. O controle de qualidade obtido com auxlio de tcnicas cromatogrficas de alta eficincia (HPLC), para quantificar os flavonoides presentes (Prado et al., 2010a).

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Dentre os produtos testados em bovinos confinados, foi registrado como um dos mais promissores, o produto LLOSC1 (concentrao de prpolis C e teor alcolico 1) que continha 0,018 mg/g de flavonoides totais em crisina (Prado et al., 2010c). Assim objetivou-se confirmar as aes dos produtos base de prpolis (LLOS) avaliando quatro concentraes do produto (LLOSC1, LLOSC1+, LLOSC1++, LLOSC1+++), em dieta a base de silagem de milho e concentrado, sobre digestibilidade total da matria seca e dos demais componentes da rao, parmetros ruminais, cintica de trnsito de slidos e lquidos, eficincia de sntese microbiana.

Materiais e Mtodos
O experimento foi realizado no setor de Bovinocultura de Corte da Fazenda Experimental de Iguatemi (FEI), no Laboratrio de Anlises de Alimentos e Nutrio Animal do Departamento de Zootecnia e no Laboratrio de Farmacotcnica pertencentes Universidade Estadual de Maring (UEM). Foram utilizados cinco bovinos mestios (zebu x holandes) castrados, com peso corporal (PC) mdio 437,04 17,61 kg, canulados no rmen, alojados em baias individuais de 10 m2 com piso de concreto, cobertas, providas de cocho e bebedouro. Foi fornecido uma dieta base (controle), que continha 60% de silagem de milho e 40% de concentrado (Tabela 1), e foram adicionados a dieta os produto base de prpolis LLOSC1, LLOSC1+, LLOSC1++ e LLOSC1+++. Estes produtos base de prpolis foram preparados de acordo com a metodologia desenvolvida por Franco & Bueno (1999) e possuem a mesma concentrao de prpolis (C) e diluio alcolica (1), mas diferem na dosagem (+ < ++ < +++) de flavonoides. Para os produtos LLOS foi solicitada a concesso de patente ao Instituto Nacional da Propriedade Industrial, cujo nmero de depsito PI0605768-3. Para padronizao do produto LLOSC1 foi determinado a concentrao total de flavonoides presente em cada dose do produto e quantificados em relao a um dos flavonoides presente na prpolis, que foi a apigenina. A determinao das concentraes de flavonoides quantificados em apigenina nos produtos base de prpolis e secos por liofilizao foram feitas em cromatografia de alta eficincia (HPLC - Shimadzu modelo SPD - 20AT Prominence com detector UV/VIS ). A quantidade diria de flavonoide fornecida por animal pelos produtos base de prpolis foram:

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LLOSC1 = 15,09 mg, LLOSC1+ = 30,18 mg, o LLOSC1++ = 45,27 mg e o LLOSC1+++ = 60,36 mg. Essas doses foram escolhidas para o estudo, conforme os resultados obtidos em experimentos anteriores envolvendo os produtos LLOS e para estabelecer uma curva resposta para o produto LLOSC1 (Rspoli et al., 2009; Aguiar, 2009; Valero, 2010; Zawadzki et al., 2011; Prado et al., 2010a,b,c). Os extratos de prpolis foram liofilizados, assim apresentavam-se na forma de p, e o fub de milho foi usado como excipiente, de forma que as doses dirias ficassem contidas em 10 g de produto final (extrato + excipiente). As doses dirias foram divididas pela metade, uma metade foi fornecida no mesmo horrio da alimentao da manh (8h) e a outra, no horrio da alimentao da tarde (16h). As doses foram pesadas em balana analtica e embrulhadas em papel higroscpico e colocadas diretamente no rmen, atravs da cnula ruminal.

Tabela 1. Composio qumica dos ingredientes e da dieta.

Composio qumica dos alimentos Itens MS SM 30,11 GM 90,75 FS 91,55 % na MS MO PB EE FDN FDA CHT CNF NDT 1 96,87 7,49 3,13 55,25 31,16 86,07 30,82 66,86 98,80 9,79 3,00 14,13 4,13 86,01 69,95 80,37 93,60 55,41 2,13 15,37 10,47 36,06 23,96 81,16 312,12 131,25 95,42 13,19 3,08 38,60 20,65 81,34 42,32 70,76 Ureia 100 S. am. 100 Sup. M. 100 Dieta 54,58

Composio percentual da dieta basal Dieta Total

1

60,00

31,98

6,09

0,63

0,16

1,14

100,00

Nutrientes digestveis totais: obtido pela equao de Kearl (1982). SM: silagem de milho; GM: gro de milho modo; FS: farelo de soja; S. am: sulfato de amnio; Sup. M: suplemento mineral; MS: matria seca; MO: matria orgnica; PB: protena bruta; EE: extrato etreo; FDN: fibra em detergente neutro; FDA: fibra em detergente cido; CHT: carboidratos totais; CNF: carboidrato no fibroso.

A rao foi fornecida aos animais duas vezes ao dia, em duas pores iguais, pela manh (8h) e a tarde (16h), o concentrado e o volumoso eram misturados nos cochos. Os animais foram pesados no incio do perodo de adaptao e calculado a ingesto da

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rao, sendo que esta foi restrita a 2,0 % do peso corporal, para evitar o efeito do nvel de ingesto sobre a digestibilidade. O experimento teve durao de 175 dias, composto de cinco perodos com durao de 35 dias, sendo 14 dias para adaptao dos animais a dieta e 11 dias de coletas e foi adotado um intervalo de 10 dias de vazio (sem receber aditivos) entre cada perodo experimental. Nos trs primeiros dias de coleta, de cada perodo experimental, foi realizada coleta total de fezes, obtida durante trs dias consecutivos totalizando 72 horas interruptas coletando as fezes dos animais. A coleta total de fezes consistiu em coletar todas as fezes, aps cada defecao espontnea, e armazen-las em sacos plsticos de 50 L, e a cada oito horas de coleta, as fezes foram pesadas e homogeneizadas para retirada de alquotas em torno de 10% do total excretado. Foram realizadas trs pesagens e amostragens ao dia, e a soma das trs pesagens representou assim a excreo diria. Para evitar a contaminao das fezes por urina, toda vez que os animais urinavam as baias foram lavadas. As amostras foram armazenadas em sacos plsticos, etiquetados, e congeladas a 20oC. Aps o perodo de coleta, as amostras de alimento, fezes eram secas em estufa de ventilao forada a 55oC por 72 horas, modas (2mm e 1mm) individualmente e misturadas em quantidades iguais, com base no peso seco, para formar amostras compostas de fezes por animal e para cada tratamento. Para avaliar a taxa de passagem de lquido, no oitavo dia de coleta foi administrado no rmen dos animais 32 g de Co-EDTA diludos em 500 ml de gua destilada, segundo Uden et al. (1980) antes da primeira alimentao. Foi coletado via cnula ruminal uma alquota de lquido ruminal (100 mL), nos tempos 0 (que antecede a primeira alimentao) 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 24 horas aps a alimentao da manh. O pH foi medido imediatamente aps a coleta do lquido ruminal, atravs de potencimetro digital porttil, nos tempos 0 (que antecede a alimentao), 2, 4, 6, 8 horas. Aproximadamente 50 mL de lquido ruminal foi armazenado a -200C para anlises de concentrao de Cobalto, 25 mL acidificados com 0,5 mL de cido sulfrico 1:1 para determinao da concentrao de nitrognio amoniacal (N-NH3). A dosagem de amnia nas amostras de lquido ruminal filtrado foi determinada conforme Preston (1995).

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A taxa de diluio ruminal foi estimada pela diminuio da concentrao de cobalto (Co) ruminal em funo do tempo. Para a determinao da concentrao de Co, as amostras de lquido de rmen, aps o descongelamento, foram centrifugadas a 3700 rpm por 30 minutos. As concentraes de cobalto nas amostras de lquido ruminal foram determinadas por espectrometria de absoro atmica (Uden et al., 1980). As taxas de passagem de lquido e as curvas de concentrao ruminal do Co foram ajustadas ao modelo exponencial unicompartimental de Hungate (1966), citado por Colucci (1984): YCo = A x e (-kl.t) em que YCo = concentrao do indicador no tempo t; A = concentrao de equilbrio do Co; kl = taxa de passagem ou de diluio do Co; e t = tempo de amostragem. Os parmetros da dinmica da fase lquida foram calculados de acordo com Colucci et al. (1990): Tempo de reteno no rmen (h) (TeR) = 1/ taxa de passagem de fluidos (%/h) (klCo ); Volume de lquido ruminal (L) (VLR) = quantidade de Co fornecida (mg) /A; Taxa de fluxo ruminal (L/h) (TxF) = klCo x VLR e a taxa de reciclagem (TRec) da fase lquida ruminal foi calculada conforme Maeng & Baldwin (1976): TRec (n de vezes/dia) = 24 h/TeR. No oitavo dia, foram coletadas, para a determinao da produo microbiana, amostras spot de urina aproximadamente quatro horas aps a alimentao, durante mico espontnea. As amostras foram filtradas em papel filtro para evitar possvel contaminao. Uma alquota de 15 mL de urina foi diluda em 135 mL de cido sulfrico (H2SO4) 0,036 N a fim de evitar destruio bacteriana dos derivados de purina e precipitao do cido rico. As amostras de urina foram armazenadas em geladeira (5C) e, posteriormente, submetidas s anlises das concentraes de creatinina, alantona e cido rico. As anlises de alantona foram realizadas segundo metodologia descrita por Chen & Gomes (1992). Para a determinao de creatinina e cido rico, amostras de urina foram enviadas ao Centro de Diagnstico Laboratorial (CEDLAB), localizado na cidade de Maring-PR. E, para a determinao da dosagem de ureia na urina, uma amostra de aproximadamente de 15 ml, foi enviada para o departamento de bioqumica da UEM (DBQ). No nono e dcimo dia, foi realizada a tcnica de evacuao ruminal, segundo o procedimento adaptado por Huhtanen et al. (2007), em que foram feitas duas evacuaes, a primeira feita 3 horas aps e a segunda 8 horas aps a alimentao matutina (intervalo de 28 horas entre as evacuaes). Todo o contedo ruminal foi evacuado via cnula ruminal, e depois prensado manualmente para separao da fase

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lquida da slida. Uma amostra proporcional de lquido e de slido (peso/peso) foi retirada para formar uma amostra composta (2,0 kg) para se conhecer a percentagem de matria seca (MS) no contedo ruminal. Aps secagem em estufa a 55C, s amostras do contedo ruminal dos dois dias foram misturadas para serem analisadas quanto composio qumica. Os procedimentos de evacuao, prensagem e retorno da digesta ao rmen ocorreram em aproximadamente 20 minutos. O volume ruminal obtido pelo esvaziamento do rmen foi estimado a partir do peso da gua que correspondeu ao volume total do contedo ruminal retirado e medido diretamente em tambores coletores. Os parmetros de cintica de slidos no trato gastrintestinal foram calculados segundo Robinson et al. (1987), como: taxa de ingesto [ki = ((ingesto do nutriente/24)/pool ruminal do nutriente)*100]; taxa de passagem [kp = ((excreo fecal do nutriente/24)/pool ruminal do nutriente)*100]; taxa de digesto [kd = ki kp]. Os parmetros de cintica de slidos no rmen foram calculados conforme Oba & Allen (2003), como segue: taxa de desaparecimento [kt (%/h) = (ingesto do nutriente/pool ruminal)/24*100)]; taxa de passagem [kp (%/h) = (fluxo omasal do nutriente/Pool ruminal do nutriente)/24*100], taxa de digesto [kd (%/h) = kt kp]. O tempo de reteno no rmen (TR) foi igual 100/(kp + kd). A partir da concentrao de creatinina na amostra spot de urina, foi estimado o volume urinrio (expresso em L), dividindo-se a excreo diria de creatinina (mg/kg de PC) pela concentrao de creatinina (mg/L). Para determinao da excreo diria de creatinina por kg de PC, foi adotado o valor mdio de 29,33 mg/kg de PC, obtido por Renn et al. (2000). A produo de nitrognio (N) microbiano foi calculada a partir da quantidade de purinas absorvidas (X, mM/dia), a qual foi estimada a partir da excreo urinria de derivados de purina (DP) (Y, mM/dia), por meio da seguinte equao descrita por Chen & Gomes (1992): Y = 0,85X + (0,385 PC0,75); em que o valor de 0,85 representa a recuperao de purinas absorvidas como DP na urina. O componente entre parnteses representa a contribuio endgena lquida de DP para a excreo total aps correo para a utilizao das purinas microbianas pelo animal. Em bovinos, a contribuio endgena tomada como uma constante de 0,385 mM/kg de PC0,75 por dia. A sntese de compostos nitrogenados microbianos no rmen (Y, gN/dia) foi calculada em funo das

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purinas absorvidas (X, mM/dia), por meio da equao tambm descrita por Chen & Gomes (1992): Y=
X (mM /dia) x 70 0,116 x 0,83 x 1000

em que 70 representa o contedo de N nas purinas (mgN/mM); 0,83 a digestibilidade das purinas microbianas e 0,116 representa a razo N-purina:N total dos microrganismos ruminais. A estimativa de sntese de PB microbiana (SPBmic) foi obtida ao se multiplicar a sntese de N microbiano por 6,25, enquanto a eficincia de sntese de protena microbiana (EPBmic) foi determinada como: EPBmic (g/100 g) = SPBmic (g)/CNDT (100 g), em que CNDT= consumo de nutrientes digestveis totais. Em todos os dias das coletas amostrou-se a silagem de milho. O concentrado e seus ingredientes foram amostrados em cada partida. No houve sobras de alimentos nos cochos. Os teores de matria seca (MS), protena bruta (PB), matria mineral (MM) e extrato etreo (EE) foram determinados segundo metodologia descrita por Silva & Queiroz (2002). A matria orgnica (MO) foi obtida como 100 MM. A fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente cido (FDA) foram determinadas em conformidade com Van Soest et al. (1991), adaptado por Souza et al. (1999). Para a anlise da FDN da digesta omasal e das fezes foi adicionado o sulfito de sdio para eliminar possvel contaminao da amostra com pelos. Os carboidratos totais (CHT) e no fibrosos (CNF) foram calculados de acordo com Sniffen et al., (1992): CHT = 100 (%PB + %EE + %MM) e CNF = 100 (%PB + %FDN + %EE + %MM). A densidade energtica das dietas experimentais, expressa em nutrientes digestveis totais (NDT) foi determinada segunda frmula recomendada pelo NRC (2001): NDT(%) = PBD + 2,25 x EED + CNFD + FDND, em que PBD, EED, CNFD e FDND significam: protena bruta digestvel, extrato etreo digestvel, carboidratos no fibrosos digestveis e fibra em detergente neutro digestvel, respectivamente, cujo os coeficientes de digestibilidade foram determinados neste experimento. Foi utilizado um delineamento experimental, em quadrado latino 5x5, com cinco animais, cinco perodos e cinco tratamentos. As anlises estatsticas das variveis estudadas foram interpretadas atravs do programa de Sistema de Anlises Estatsticas e

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Genticas (SAEG), desenvolvido pela Universidade Federal de Viosa (1997), por meio de anlise de varincia. A diferena entre os tratamentos foi determinada por equao de regresso considerando 5% o grau de significncia. Foi utilizado o seguinte modelo estatstico: Yijk = + Ai + Pj + Tk + eijk, onde: Yijk= observao do efeito do tratamento k, no perodo j, no animal; i= constante geral da varivel; Ai = efeito do animal i; i= 5 animais; Pj= efeito de perodo j; j= 5 perodos; Tk= efeito da quantidade diria de flavonoide em mg/dia k, k= 5 doses de flavonoides variando de 0,00; 15,09; 30,18; 45,27; 60,36; eijk= erro aleatrio associado a cada observao.

Resultados e Discusso
Na tabela 2 esto apresentados os consumos das dietas base de prpolis de acordo com as doses de flavonides quantificados em apigenina (mg)/ dia.
Tabela 2- Consumo de nutrientes das dietas com adio dos produtos base de prpolis

LLOSC11
Variveis Doses de flavonoides totais quantificados em apigenina (mg)/dia.1 0,0 MS Kg/dia MS %PC MS g/Kg
0,75

Regresso

CV(%)

15,09 8,79 2,02 92,13 8,39 87,90

30,18 8,85 2,02 92,22 8,44 88,00 g/Kg0,75

45,27 8,69 2,02 91,84 8,29 87,64

60,36 8,81 2,02 92,11 8,40 87,89 Y= 8,80 Y= 2,02 Y= 92,14 Y= 8,41 Y=87,92 3,54 0,0 0,71 2,89 3,10

8,91 2,02 92,40 8,50 88,17

MO Kg/dia MO g/Kg0,75

PB EE FDN FDA CHT CNF NDT2

1

12,19 2,84 35,67 19,09 75,17 39,11 63,34

12,15 2,83 35,57 19,03 74,94 38,99 63,85

12,16 2,84 35,60 19,05 75,02 39,03 63,49

12,11 2,82 35,46 18,97 74,71 38,87 63,38

12,15 2,83 35,56 19,03 74,93 38,98 63,89

Y=12,15 Y=2,83 Y=35,57 Y=19,03 Y= 74,95 Y= 38,99 Y= 63,59

0,71 3,10 3,10 3,10 0,71 0,71 2,22

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOSC1; 30,18 = produto LLOS C1+; 45,27 = produto LLOSC1++; 60,36 = produto LLOSC1+++; NDT2: Nutrientes digestveis totais calculado pela equao de Sniffen et al 1992 em que

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NDT= PBD+2,25xEED+CHTD; MS: Matria seca; MO: Matria orgnica; PB: Protena bruta ; EE: Extrato etreo; FDN: Fibra em detergente neutro; FDA: Fibra em detergente cido;CHT: Carboidratos 0,75 totais; CNF: Carboidratos no fibrosos; PC: Peso corporal; g/kg : gramas de nutrientes por

kilograma de peso metablico.

As ingestes de matria seca e de nutrientes no foram influenciadas (p>0,05) pelo aumento das doses do produto base de prpolis LLOSC1, visto que a oferta da alimentao foi restrita a 2% do PC (Tabela 2), cujo consumo mdio de matria seca foi de 8,8 kg/dia e 92,14 g/Kg0,75 e consumo mdio de FDN foi de 0,78% do PC. O aumento crescente das doses de flavonoides fornecidas oriundas do produto base de prpolis LLOSC1, 0,0; 15,09; 30,18; 45,27; 60,36 mg/dia/animal tambm no influenciou (P>0,05) o coeficiente de digestibilidade da matria seca (CDMS), matria orgnica (CDMO), extrato etreo (CDEE), Fibra em detergente neutro (CDFDN), fibra em detergente cido (CDFDA), carboidratos totais (CDCHO), carboidratos no fibrosos(CDCNF) e nutrientes digestveis totais (NDT) (Tabela 3).

Tabela 3- Coeficiente de digestibilidade (CD) das dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOS C11
Variveis 0 CDMS CDMO CDPB CDEE CDFDN CDFDA CDCHT CDCNF NDT
1

Doses de flavonoides totais quantificados em apigenina (mg)/dia. 15,09 65,56 67,09 61,19 79,83 49,18 35,42 68,49 85,80 69,31 30,18 65,16 66,62 62,56 80,79 46,75 40,46 67,64 86,38 68,86 45,27 65,35 66,83 61,39 79,70 45,96 38,94 68,12 88,02 69,02 60,36 65,67 67,33 58,66 76,88 49,45 37,98 69,25 87,01 69,39

Regresso

CV

64,76 66,42 61,35 78,38 45,17 34,58 67,70 87,93 68,58

Y= 65,30 Y= 66,86 Y= 61,02 Y= 79,12 Y= 47,30 Y= 37,47 Y= 68,24 Y= 87,03 Y= 69,03

2,22 2,24 4,44 6,44 13,92 8,21 2,59 2,69 2,08

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOSC1; 30,18 = produto LLOSC1+; 45,27 = produto LLOSC1++; 60,36 = produto LLOSC1+++; MS: Matria seca; MO: Matria orgnica; PB: Protena bruta; EE: Extrato etreo; FDN: Fibra em detergente neutro; FDA: Fibra em detergente cido; CHT: Carboidratos totais; CNF: Carboidratos no fibrosos; NDT: Nutrientes digestveis totais obtidos pela equao de Sniffen et al (1992) em que NDT= PBD+2,25xEED+CHTD; CV: coeficiente de Variao.

Os resultados observados para o CDMS diferiram dos registrados por Prado (2010d) para dietas com 50:50 de volumoso:concentrado, que observaram aumentos

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(P<0,05) de 8,3% na digestibilidade in vitro da MS com adio do produto base de prpolis de LLOSC1 em relao ao controle e de 6,2% em relao monensina. No entanto, no presente trabalho o aumento das doses do produto LLOSC1, em animais confinados com consumo restrito a 2,0% PC, os resultados para CDMS foram semelhante entre as doses. Da mesma forma, Aguiar (2009) adicionou em dietas com relao volumoso:concentrado de 50:50 para bovinos mestios confinados, o produto LLOSC1 em duas doses (LLOSC1 e LLOSC1+ = duas vezes a dose LLOSC1) e no observou efeito sobre o CDMS. Tambm Valero (2010) ao avaliar o desempenho de bovinos mestios confinados, no encontrou diferena entre o produto LLOSC1+, monensina e dieta controle para a CDMS. Entretanto, Prado et al. (2010b) verificaram menores valores para CDMS quando os produtos base de prpolis LLOS C1, LLOS B3 e a monensina foram adicionados em dietas base de forragem fornecidas para bovinos. Por outro

lado, para bubalinos aumentos (P<0,05) na CDMS foram registrados por Prado et al (2010c) para a dieta base de forragem com adio de LLOSC1 em relao a dieta controle. Os resultados obtidos at o momento para o produto LLOSC1 nas diferentes doses (da menor a maior dose avaliada) em dietas com propores semelhantes de volumoso:concentrado parece no interferir na digestibilidade da matria seca. Segundo Prado et al. (2010a) o referido produto seleciona bactrias ruminais mais generalistas, capazes de degradar um determinado nmero celobiose, arabinose, xilose, frutose e lactose. Embora, nas diferentes doses do produto base de prpolis (LLOSC1, LLOSC1+, LLOSC1++ e LLOSC1+++) avaliadas no ter sido observada diferenas para os CDMS, resultados conflitantes tm sido observados para a digestibilidade da protena, frao fibrosa e extrato etreo. Prado et al. (2010b) ao fornecerem dietas base de forragem a bovinos, constataram que a adio do produto base de prpolis LLOSC1 e monensina teve um efeito menor quando comparados com a dieta controle para as CDPB ,CDEE ,CDFDN,e CDFDA. Porm para bfalos verificaram aumentos (P<0,05) para a CDFDN, CDFDA e NDT em dietas base de forragem com adio de LLOSC1 (Prado et al., 2010c). Entretanto, Aguiar (2009) observou reduo (P = 0,08) para o r CDFDA para o tratamento LLOSC1 em relao ao LLOSC1+ e controle, em dietas com 50% de concentrado, fornecidas a bovinos mestios confinados. de substratos, entre eles celulose,

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Valero (2010) observou em dietas para bovinos confinados que a incluso do produto LLOSC1+ aumentou (P<0,01) a CDEE em relao adio de monensina e dieta controle, porm reduziu a digestibilidade da protena em relao monensina. Estas inconstncias de resultados com a incluso dos produtos base de prpolis parecem estar relacionadas dose fornecida dos produtos, a razo

volumoso:concentrado, e a espcie animal. Semelhana ocorre com os resultados observados para os ionforos e antibiticos que segundo Russell (2002), em dietas base de forragem as bactrias ruminais so mais susceptveis a ao dos aditivos. E, em relao espcie, tem sido observado que os bfalos so mais sensveis que bovinos quando monensina sdica fornecida (Rozza et al., 2007). Em relao aos parmetros ruminais, no houve (P>0,05) efeito do tempo de amostragem do lquido ruminal e efeito dos aditivos sobre o pH ruminal e nitrognio amoniacal no liquido ruminal (P>0,05). Resultado semelhante tambm foi obtido por Stradiotti Jr. et al (2004a) que avaliaram a ao da prpolis na fermentao ruminal em bovinos e no observaram diferena para os valores de pH e nitrognio amoniacal. Tambm em dietas base de forragem fornecidas a bovinos e bubalinos no foram observadas diferenas no pH ruminal e nitrognio amoniacal entre a adio do produto LLOSC1, monensina e dieta controle (Prado et al., 2010b; Prado et al.,2010c).

Figura 1.Valores de pH do lquido ruminal dos bovinos em funo do tempo aps a alimentao para as diferentes doses de flavonides medidos em apigenina (mg/dia/animal).

O pH do lquido ruminal diferiu (P<0,05) em relao ao tempo aps a alimentao de forma quadrtica para todas as raes experimentais (Figura 1), pH = 6,76606 0,259617X + 0,0261572X2, (r2 = 40%). Em todos as dietas, o pHse apresentou acima

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de 6,05 e, segundo Russell & Dombrowski (1980), valores de pH do lquido ruminal igual ou menor que 6,1 poderiam comprometer o crescimento de bactrias fibrolticas. O valor mnimo estimado para o pH ruminal foi de 6,05 as quatro horas aps a alimentao e o valor mdio observado foi de 6,36, estes valores esto prximos ao observados por Prado et al. (2010b) que utilizando produtos base de prpolis LLOS obteve valor mnimo de pH de 6,04 s 4h e 8 h. Em relao ao tempo de amostragem, tambm houve efeito (P<0,05) quadrtico para o N-NH3 do lquido ruminal em funo do tempo (Figura 2), onde N-NH3 = 9,78692 + 4,32454X 0,651616X2 (r2 = 52%). O maior valor observado para a concentrao de N-NH3 do lquido ruminal foi de 26,40 mg/100 mL de lquido ruminal que ocorreu no tempo de duas horas aps a alimentao, e a concentrao mnima foi de 4,20 mg/100 mL de lquido ruminal que ocorreu s oito horas aps a alimentao. Estes valores foram originados provavelmente pela restrio alimentar, uma vez que os animais ingeriam toda alimentao em aproximadamente uma hora aps o fornecimento. Este valor tambm est abaixo do obtido por Prado et al. (2010b) os quais utilizaram produtos base de prpolis LLOS observaram 6,15 mg N-NH3/100 mL do lquido ruminal como valor mnimo da concentrao N-NH3 do lquido ruminal4 e a concentrao mdia foi de 10,64 NH3/100 mL de lquido ruminal.

Figura 2. Valores da concentrao do nitrognio amoniacal (N-NH3) mg/100 mL do lquido ruminal de bovinos em funo do tempo aps a alimentao para as diferentes doses de flavonoides medidos em apigenina (mg/dia/animal).

O valor mdio observado para a concentrao de N-NH3 foi de 11,56 mg/100 mL de lquido ruminal, o qual se manteve abaixo da faixa proposta por Mehrez et al.

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(1977) para a mxima atividade fermentativa que obtida quando o N-NH3 alcana valores entre 19 e 23 mg/100 mL liquido ruminal. Entretanto, manteve-se acima da concentrao de 5,0 mg/100 mL de lquido ruminal considerada por Satter & Roffler (1975) como o mnimo necessrio para no limitar o crescimento microbiano.

Tabela 4. Volume ruminal, teor de matria seca da digesta ruminal e cintica de slidos no rmen de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOSC11 .
Parmetros Doses de flavonoides totais quantificados em apigenina (mg)/dia. 0 Volume Ruminal(L) Matria Seca (%) MS Ruminal (kg) 49,1 15,22 7,46 15,09 53,39 14,37 7,64 30,18 51,65 14,68 7,56 45,27 48,63 14,48 7,05 60,36 47,42 15,24 7,24 Y=50,04 Y= 14,80 Y= 7,39 6,20 7,82 10,37 Regresso CV %

Cintica de slidos no rmen Matria Seca Kp (%/h) Kd (%/h) Kt (%/h) Tempo reteno (h) 2,33 2,75 5,08 20,15 2,49 2,38 4,86 20,81 2,34 2,56 4,90 20,67 2,32 2,88 5,20 19,54 2,60 2,53 5,12 19,78 Y= 2,41 Y= 2,62 Y= 5,03 Y= 20,15 14,88 20,20 11,30 12,30

Fibra em Detergente Neutro Kp (%/h) Kd (%/h) Kt (%/h) Tempo reteno (h) 0,94 2,08 3,02 33,59 0,99 1,77 2,76 36,81 0,93 1,88 2,81 36,11 0,96 2,02 2,98 34,03 1,06 1,80 2,85 35,36 Y= 0,98 Y= 1,91 Y= 2,89 Y= 35,18 26,66 18,36 10,66 11,06

Fibra em Detergente cido Kp (%/h) Kd (%/h) Kt (%/h) Tempo reteno (h)

1

0,95 1,76 2,70 37,86

0,97 1,67 2,64 38,48

0,93 1,71 2,64 38,32

0,98 1,90 2,88 35,45

1,06 1,67 2,73 37,04

Y= 0,98 Y= 1,74 Y= 2,72 Y= 37,41

25,00 22,28 13,26 18,31

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOS C1; 30,18 = produto LLOS C1+; 45,27 = produto LLOS C1++; 60,36 = produto LLOS C1+++; CV: Coeficiente de Variao; MS: matria seca; Kp: taxa de passagem; Kd: taxa de digesto; Kt: taxa de desaparecimento

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O aumento das doses do produto LLOS C1 no influenciou (P>0,05) a cintica de slidos no rmen. No houve diferena (P>0,05) no volume ruminal e no peso do contedo ruminal (kg de MS) (Tabela 4). O valor mdio de 14,8% de MS presente no rmen est dentro da variao de 10 a 15% relatada por Silva & Leo (1979) e segundo os autores os valores podero variar em funo do tempo que ocorre a tomada da amostra, a ltima ingesto de gua pelo animal e especialmente pela natureza dos alimentos. Do mesmo modo no houve efeito (P>0,05) das doses do produto LLOS C1 para a taxa de passagem (kp), taxa de digesto (kd) e taxa de desaparecimento (kt) da MS, FDN e FDA. Estes resultados corroboram com a ausncia do efeito das doses sobre os coeficientes de digestibilidade da matria e nutrientes observados. A taxa de passagem (kp) da MS do rmen, na mdia foi de 2,41%/hora, inferior ao estimado pelo NRC (2001) de 3,48%/hora e por Henriques et.al. (2004) que encontrou valores de 2,81%/h para a taxa de passagem em bovinos mestios alimentados com dietas semelhantes. Os resultados observados para a taxa de passagem da MS provavelmente ocorreram pela restrio alimentar qual estes animais foram submetidos, e consequentemente maior o tempo de permanencia da digesta no rmen. Se considerar a taxa de passagem e a taxa de digesto, o tempo mdio de reteno no rmen observado para a matria seca foi de 20,15 h, para a fibra em detergente neutro foi de 35,18 h e para a fibra em detergente cido foi de 37,41h. As diferentes doses do produto LLOSC1 no alteraram (P>0,05) a taxa de passagem (Kp) e a taxa de digesto (Kd) da MS, FDN e FDA no trato gastrintestinal (Tabela 5). A taxa de passagem de slido e de lquido influenciada quando se altera a razo volumoso:concentrado (Poncet, 1991) e o consumo da dieta, aumentando-se positivamente com o aumento do consumo e a reduo da proporo de volumoso (Owens & Goetsch,1993; Valadares; Pina, 2006). Em relao a estes fatores a ausncia de diferena entre os tratamentos avaliados pode ter ocorrido pelo fato dos animais terem recebido dietas com a mesma proporo de volumoso e concentrado e o que diferenciava os tratamentos era a presena das diferentes doses de flavonoides e alm do que os animais estavam submetidos a restrio alimentar a 2% do PC. A Kp da matria seca teve mdia de 1,75%/h e tempo de reteno de 57,17 h superior ao obtido por Henriques et al. (2004) que observaram taxa de passagem de

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2,81%/h e tempo de reteno de 35,59 h para dietas base de silagem de milho fornecida a bovinos mestios consumindo 2,32% do PC. A taxa de passagem e digesto da FDN foi de 1,52 e 1,36 %/h respectivamente e da FDA foi de 1,70 e 1,02 %/h.

Tabela 5. Cintica das fraes slidas no trato gastrintestinal de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOS C11
Parmetros 0 Doses de flavonoides totais quantificados em apigenina (mg)/dia 15,09 30,18 45,27 60,36 Regresso CV

Matria seca Kp (%/h) Kd (%/h) 1,80 3,29 1,67 3,20 1,71 3,19 1,80 3,40 1,77 3,35 Y= 1,75 Y= 3,28 11,72 11,94

Fibra em Detergente Neutro Kp (%/h) Kd (%/h) 1,66 1,36 1,39 1,37 1,50 1,31 1,61 1,37 1,46 1,40 Y=1,52 Y=1,36 12,21 14,89

Fibra em Detergente cido Kp (%/h) Kd (%/h)

1

1,78 0,92

1,69 0,95

1,57 1,07

1,76 1,12

1,70 1,03

Y=1,70 Y=1,02

18,98 18,31

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOS C1; 30,18 = produto LLOS C1+; 45,27 = produto LLOS C1++; 60,36 = produto LLOS C1+++; CV: Coeficiente de Variao; Kp: taxa de passagem; Kd: taxa de digesto; Kt: taxa de desaparecimento

A utilizao das dosagens crescentes do LLOSC1 em bovinos no alteraram (P>0,05) a taxa de diluio, tempo de reteno, tempo de reciclagem, taxa de fluxo e volume ruminal (Tabela 6). O valor mdio para a taxa de diluio foi de 9,92 %/h. Esta mdia se manteve acima do sugerido por Owens & Goetsch (1993), de 8,2%/h quando a dieta contm de 0 a 50% de concentrado e de 6,7%/h entre 50 e 80% de concentrado, isto , a taxa de diluio ruminal varia conforme a percentagem de concentrado na dieta; e prximo ao valor observado por Prado et al. (2010b) para a taxa de diluio com o aditivo LLOSC1 de 9,4(%/h) e o tempo de reteno igual 11h. Segundo Hristov e Broderick (1996), as estimativas da taxa de passagem de lquido variam em funo da dieta fornecida, do sexo, do estado fisiolgico do animal e, inclusive, do tipo de indicador utilizado no processo de estimao.

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O volume ruminal em porcentagem do peso corporal (PC) teve como valor mdio 12,17% do PC. Esse volume em relao ao PC foi inferior ao observado por Owens & Goetsch (1993) de 15 a 21% do PC. Provavelmente, a restrio alimentar a qual esses animais foram submetidos, gerou pouco volume, inferior a capacidade volumtrica do rmen destes animais.
Tabela 6. Cintica da frao lquida do rmen de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOS C11 Doses de flavonoides totais quantificados em Parmetros Regresso CV apigenina (mg)/dia
0 Taxa de diluio (%/h) Tempo de reteno (h) Tempo reciclagem (vezes/dia) Taxa de fluxo (L/hora) Volume ruminal (L) Volume ruminal (%PC)
1

15,09 9,59 10,45 2,30 4,84 50,52 11,60

30,18 9,90 10,11 2,38 5,24 52,92 12,17

45,27 9,91 10,13 2,38 5,57 56,26 13,08

60,36 10,20 9,83 2,45 5,44 53,37 12,32 Y=9,92 Y=10,10 Y=2,38 Y=5,25 Y=52,94 Y=12,17 6,24 6,06 6.24 9,43 7,26 7,57

10,03 10,00 2,41 5,19 51,65 11,67

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOS C1; 30,18 = produto LLOS C1+; 45,27 = produto LLOS C1++; 60,36 = produto LLOS C1+++; CV: coeficiente de variao; PC: peso corporal.

Os produtos base de prpolis no influenciaram (P>0,05) a sntese de protena microbiana (g/dia) nem a eficincia de sntese microbiana (g/100g NDT) (Tabela 7). A sntese de protena microbiana teve valor mdio 577,13 g/dia e a eficincia de sntese de protena microbiana apresentou valor de 9,58g/100g de NDT, quae ficou abaixo do citado pelo NRC (2001) que de 13,0 g/100g de NDT. A sntese de protena microbiana depende, em grande parte, da disponibilidade de carboidratos e de N no rmen (Clark et al., 1992; NRC, 2001), de modo que o crescimento microbiano maximizado pela sincronizao entre a disponibilidade da energia fermentvel e o N degradvel no rmen (Russell et al., 1992; NRC, 1996). Ainda, segundo Dipu et al. (2006) a excreo de derivados de purinas tem uma correlao direta e positiva com os nveis de ingesto de alimentos, resultando em uma maior ou menor eficincia de sntese de protena microbiana. Estes fatos podem explicar os valores obtidos, porque os animais foram submetidos ao consumo restrito em 2% PC.

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A excreo de alantona (mM/dia) no diferiu, porm a de cido rico diferiu (P<0,05) entre as doses de flavonoides em mg/animal/dia e se obteve uma equao quadrtica (Y=11,5715+0,239086X-0,00296636X2) sendo o mximo de excreo do cido rico, de 16,39 mM/dia para a dose de 40,30 mg/dia de flavonoides totais quantificados em apigenina. A alantona apresentou mdia de 155,56 mM/dia, valor superior aos reportados por Renn (2003), que verificou que a mdia para alantona foi de 112,92 mM/dia. Tabela 7 - Volume urinrio, excrees urinrias dos derivados de purinas, sntese de protena microbiana e eficincia de sntese microbiana (g PBmic/ 100 g de NDT) de bovinos recebendo dietas com adio dos produtos base de prpolis LLOS C11 .
Parmetros Doses de flavonoides totais quantificados em apigenina (mg)/dia 0 Vol. Urinrio (L/d) Purinas Totais (mM/d) Alantona (mM/d) cido rico (mM/d) Alantona (% total) cido rico (% total) Purinas absorv. (mM) N-Mic. (g/dia) Pmic (g/dia) 9,62 169,32 158,16 11,16 91,97 6,59 125,67 91,37 571,03 15,09 9,30 168,21 152,88 15,33 88,25 9,60 124,98 90,86 567,87 30,18 9,91 169,89 153,81 16,08 90,89 7,94 126,47 91,95 574,67 45,27 9,72 169,81 154,32 15,49 91,32 9,00 126,96 92,30 576,89 60,36 9,27 174,24 158,63 15,61 91,00 8,96 130,99 95,23 595,17 Y= 9,57 Y=170,30 Y=155,56 Y1 Y Y
2 3

Regresso

CV

8,85 4,24 4,23 16,7 1,46 15,4 5,29 5,29

Y=127,25 Y=92,34 Y=577,13

Eficincia de Sntese Microbiana Ingesto NDT (Kg/dia) Pmic g/100g NDT

1

6,10 9,37

6,10 9,60

6,09 9,50

6,00 9,64

6,10 9,78

Y= 6,08 Y=9,58

3,60 4,37

quantidade diria de flavonoides fornecida nos tratamentos, respectivamente: 0,0 = dieta controle; 15,09 = produto LLOS C1; 30,18 = produto LLOS C1+; 45,27 = produto LLOS C1++; 60,36 = produto LLOS C1+++; Y1=11,5715+0,239086X-0,00296636X2 (R2=42,53); Y2=93,1546-0,1446X+0,00187008X2 (R2=43,32); Y3=6,845335+0,1446X-0,00187008X2 (R2=43,32)CV: coeficiente de variao; N-Mic: Nitrognio Microbiano; Pmic: protena microbiana.

Em relao s purinas totais, as doses crescentes do LLOSC1 proporcionaram efeito quadrtico (P<0,05) que Y=93,1546-0,1446X+0,00187008X2 sendo que o valor mnimo de alantona excretada foi de 90,36% na dosagem de 39,11mg/animal/dia de

flavonoides em apigenina. A excreo do cido rico em relao s purinas totais

31

tambm

se

comportou

de

forma

quadrtica

expressa

pela

equao

Y=6,845335+0,1446X-0,00187008X2 e o ponto mximo de excreo foi de 9,64% na dosagem de 39,14 mg/animal/dia de flavonoides em apigenina. A excreo mdia de alantona em relao as purina totais foi de 90,69%. Este valor se assemelha ao observado por Renn et al. (2008), os quais estimaram a produo de protena microbiana por meio dos derivados de purinas na urina em novilhos de quatro grupos genticos e verificaram que as propores de alantona em relao s purinas totais foram de 91,70 e 91,93%, respectivamente, para valores obtidos (coleta total) e estimado (coleta spot). Chen & Gomes (1992) afirmaram que a proporo desse componente (alantona) em relao s purinas totais de 80 a 85% para bovinos. Contudo, para um mesmo animal, esta proporo muito constante, mas parece haver variaes na excreo de alantona entre os animais, afirmam os autores. As mdias para as purinas microbianas absorvidas e o fluxo de N microbiano foram de 127,25 mM/dia e de 92,34 g/dia, respectivamente, superiores aos observados por Renn (2003), de 112,03 mM/dia e de 65,19 g/dia. Embora sem diferenas entre as doses de LLOS C1 fornecidas no presente trabalho, aumento significativo no fluxo de protena metabolizvel para intestino foi verificado por Prado et al. (2010b e 2010c) para bovinos e bubalinos respectivamente alimentados base de forragem com adio de LLOSC1 em relao ao controle. A sntese de protena microbiana pode ser influenciada pela taxa de passagem, em que altas taxas de passagem podem aumentar a eficincia de fermentao ao diminuir os gastos com manuteno das bactrias e a reciclagem microbiana no rmen, disponibilizando maior quantidade de nitrognio e energia para o crescimento microbiano (Waldo,1986). Assim o baixo valor encontrado para a sntese de protena microbiana se deve em parte pela ausncia de resposta e pelas baixas taxas de passagem encontradas nesse estudo.

Concluses
A adio das doses crescentes do produto base de prpolis LLOS C1, na dieta de bovinos mestios, no castrados, confinados e alimentados com 60% de silagem

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de milho e 40% de concentrado no alteraram os parmetros digestivos, cintica de trnsito de slidos e lquidos e eficincia de sntese microbiana.

Referncias
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