TESTE DE ELISA O teste de ELISA (do ingls Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) se baseia reaes antgeno-anticorpo detectveis atravs

de reaes enzimticas. A enzima mais comumente utilizada nestas provas a peroxidase, que catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida quando H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato). Outro mtodo o chamado ELISA de bloqueio ou competio, em que a presena de anticorpos em determinado soro revelada pela competio com um anticorpo especfico (mono ou policlonal) dirigido contra o antgeno. Igualmente, o resultado dado pela adio de um conjugado, porm a colorao aparecer nos orifcios onde no havia anticorpos. A seguir, temos um modelo de teste de ELISA de bloqueio, desenvolvido por ns e utilizado amplamente em nosso laboratrio para o diagnstico de anticorpos contra herpesvrus bovinos. Mtodo: 1 Sensibilizar as placas de ELISA com o antgeno, previamente diludo (no nosso exemplo, diludo a 1/200, correspondente diluio considerada tima em titulaes anteriores), em tampo carbonato (vide frmulas no final), 100 ul por orifcio, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitir a ligao do antgeno placa. 2- No dia seguinte, remover a soluo de antgeno e lavar a placa 3 vezes com lquido de lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifcio. 3- A placa pode ento ser armazenada para uso posterior (em sacos plsticos fechados a 20 oC, ou utilizada imediatamente. 4- Acrescentar os soros a testar em uma diluio previamente determinada ( em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem, em volumes de 100 ul/orifcio. Incubar por uma hora a 37 oC.

5- Remover a diluio dos soros e lavar trs vezes com lquido de lavagem. 6- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do anticorpo monoclonal (1:1000 em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC. 7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar trs vezes com lquido de lavagem. 8- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do conjugado (anti- IgG de camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC. 9- Remover a diluio de conjugado e lavar trs vezes com lquido de lavagem. 10- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma soluo de OPD (ortofenilenodiamina) preparada em tampo citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37 oC. 11- A reao interrompida pela adio de 50 ml por orifcio de uma soluo de H2SO4 2M. 12- Os resultados so obtidos com base na leitura da densidade tica (D.O.) em espectrofotmetro com filtro de 492 nm.