1.

CONCEITOS GERAIS

OS CIDOS NUCLEICOS

O DNA uma macromolcula filamentar muito longa formada por duas cadeias polinucleotdicas compostas por quatro tipos de subunidades de nucletidos. Cada uma dessas cadeias conhecida como uma cadeia de DNA e as duas cadeias so mantidas juntas por pontes de hidrognio entre as bases dos nucletidos. O RNA um polmero longo no ramificado constitudo por nucletidos unidos por ligaes fosfodister. -Oligonucletido = c nucleico curto sendo o tamanho arbitrrio, mas pelo menos at 50 ou menos nucletidos. -10 Nucletidos de comprimento => 410= 10485776 sequncias diferentes A estrutura dos nucletidos A unidade bsica da molcula de DNA e de RNA so os nucletidos. Os nucletidos so steres fosfricos: so compostos por um acar de cinco carbonos (pentose) ao qual esto ligados um ou mais grupos fosfatos e uma base nitrogenada purina ou pirimdica. Quando no existe grupo fosfato o composto adquire o nome de nuclesido (base e pentose).

Nos nucletidos o carbono 1 da pentose est ligado ao azoto 1 da base pirimdica ou ao azoto 9 da base purina por uma ligao N-glicosdica e . A esterificao ocorre por adio de grupos fosfatos extremidade 5 da pentose. Os nucletidos ligam-se uns aos outros por ligaes covalentes. As desoxirriboses unem-se por grupos fosfatos em que o fosfato 5 da nova ose se liga ao grupo hidrxido do carbono 3 da ose adjacente por uma ligao fosfodister. A enzima DNA-polimerase cliva dois fosfatos de um nucletido e a energia obtida usada para tirar um grupo OH do nucletido anterior e formar a ligao fosfodister.

Os nucletidos desempenham diversas funes participando num grande nmero de processo metablicos. so compostos ricos em energia (ATP, GTP); so sinais qumicos (AMP); so componentes estruturais de um numero de co-factores enzimticos; so intermedirios metablicos.

O DNA (c. desoxirribonucleico) um polmero linear de nucletidos, ou seja, uma cadeia de vrios nucletidos lado a lado sem ramificaes. Neste cido nucleico a pentose, a 2-desoxi-D-ribose estaligada a um nico grupo fosfato e a uma de quatro bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. - Os nucletidos do DNA so designados de desoxirribonucletidos ou 5-monofosfatos de desoxirribonuclesidos. O RNA (c. ribonucleico) uma cadeia simples, cuja sua estrutura covalente difere da do DNA em dois aspectos: A nvel do acar: o acar do DNA uma desoxirribose e o do RNA a Dribose (tem um grupo OH no C2, ausente na desoxirribose); A nvel da base: uma das quatro bases do RNA o Uracilo (no tem o radical metil presente na Timina) em vez da Timina. - Os nucletidos de RNA so designados de ribonucletidos ou 5-monofosfatos de ribonuclesidos.

As Bases so de dois tipos: - As purinas (anel duplo): Adenina e Guanina; - As pirimidinas (anel nico): Timina, Citosina e Uracilo, este no RNA.

As ligaes fosfodister e a formao de cadeias polinucleotdicas dos cidos nucleicos

Os nucletidos so covalentemente ligados numa cadeia por meio dos grupos fosfato e dos resduos de pentoses, os quais formam um esqueleto de fosfato-acar-fosfato-acar alternados. A parte varivel do DNA a sequncia dos quatro tipos de bases, as quais esto ligadas lateralmente ao esqueleto.

O modo como as subunidades de nucletidos so ligados d cadeia de DNA uma polaridade qumica os esqueletos de DNA e RNA sero hidroflicos. As duas extremidades da cadeia linear so facilmente distinguveis, uma tem uma salincia, isto , tem trs grupos fosfatos (extremidade 5) e a outra tem uma reentrncia, isto , tem um grupo OH do acar (extremidade 3). No esquecer que todas as ligaes fosfodister nas cadeias de DNA e RNA tm a mesma orientao ao longo da cadeia. Assim convencionou-se escrever sempre um cido nucleico de 5 3: -pA-G-G-T-AOH ou pApGpGpTpA ou pAGGTA. Ligao fosfodister (entre nucleotidos) = 1 fsforo+ 4 O2

Entre um grupo N e um grupo H, formam-se ligaes covalentes polares por partilha de electres (entre bases).

A distribuio das partculas faz com que haja maior probabilidade de encontrar o electro junto ao azoto (o N, F e O so electronegativos, isto , tm grande afinidade para os electres). Deste modo, o H do grupo Amino (N) tende a estabelecer uma ligao electrosttica com o O do grupo cido que tem uma carga parcial negativa.

As duas cadeias polinucleotdicas na dupla hlice do DNA so mantidas juntas/interagem por pontes de Hidrognio (ligaes electrostticas) entre as bases das diferentes cadeias, as quais crescem em sentidos opostos. Assim, todas as bases azotadas esto empilhadas no lado interno da hlice, enquanto os esqueletos de fosfato-acar esto no lado externo. Por cada volta da hlice ocorrem dez pares de bases. A dupla hlice possui uma volta maior e uma volta menor, as quais so importantes no modo como as protenas interagem com o DNA durante a replicao e a transcrio. A hlice enrolada para a direita.

A estrutura da molcula de DNA faz dela uma molcula extremamente flexvel, por exemplo podem ocorrer rotaes em torno de um n de ligaes no esqueleto fosfato-acar; foram encontrados desvios significativos estrutura de Watson e Crick, porm nenhum destes desvios afecta as propriedaddes chave da dupla hlice -Complementaridade das cadeias -As cadeias serem antiparalelas -A complementaridade G-C e A-T

As bases purinas e pirimidinas de ambas as cadeias polinucleotdicas encontramse para o interior com as suas estruturas anelares planares e hidrofbicas muito perto umas das outras e perpendiculares ao eixo da hlice; os fosfatos e as desoxirriboses (esqueleto hidroflico) esto orientados para o lado de fora da hlice em contacto com a gua do meio.

As bases no pareiam ao acaso: A emparelha sempre com T, e a G com C. Em cada caso, a base maior, com dois anis pareia com uma base de anel nico. Este emparelhamento de bases complementares faz com que os pares de bases sejam empacotados num arranjo mais favorvel energeticamente no interior da dupla hlice. Nesse arranjo, cada par de bases tem uma largura semelhante mantendo, assim os esqueletos fosfato-acar com uma distncia igual ao longo da molcula de DNA. Alm disso, os dois esqueletos fosfato-acar enrolam-se ao redor um do outro formando uma dupla hlice. Os membros de cada par de bases s podem permanecer juntos na dupla hlice se as duas cadeias da hlice forem antiparalelas, isto , a polaridade de uma cadeia est orientada de forma oposta da outra cadeia. Assim, cada cadeia de uma molcula de DNA contm uma sequncias de nucletidos que exactamente complementar sequncia de nucletidos da outra cadeia. Entre uma Guanina (G) e uma Citosina (C), estabelecem-se 3 ligaes de H. Entre uma Adenina (A) e uma Timina (T) ou Uracilo (U), estabelecem-se 2 ligaes de H. As trocas (ex: A com G ou C com T) provocam alteraes na estabilidade da molcula, uma vez que o espao entre as cadeias aumenta ou diminui, distorcendo-as.

EFEITO HIPOCRMICO: uma soluo de cidos nucleicos absorve menos na luz ultravioleta do que uma soluo com a mesma concentrao de nucletidos livres. PORQU? - As bases purinas e pirimidinas so hidrofbicas e relativamente insolveis na gua; a pH cido ou neutro tornam-se carregadas e a sua insolubilidade na gua aumenta. - As bases podem emparelhar quando posicionadas segundo o plano dos anis paralelos e estabelecem entre si interaces hidrofbicas (Van der Waals e diplo-diplo) e estabilizam a estrutura dos cidos nucleicos. (ligaes entre as bases da cadeia superior e inferior da dupla hlice).

NOTA: os grupos fosfato tm um pKa perto de zero e esto completamente ionizados e carregados negativamente a pH 7.0. As cargas negativas so estabilizadas por interaces inicas com cargas positivas nas protenas, ies metlicos e poliaminas.

Pergunta: Os nucletidos que constituem o DNA, s tm essa funo? Resposta: No, porque h muitas protenas que integram na sua estrutura nucletidos para poderem funcionar.

A ESTRUTURA DOS CIDOS NUCLEICOS

Evidncias experimentais de como o DNA o material gentico

Em 1944 Avery, MacLeod e McCarty realizaram experincias relacionadas com a virulncia da cpsula bacteriana que foi realizada com ratos e que vieram provar os princpios descritos em 1928 por Griffith.

Live nonencapsulated nonvirulent

Em 1928 base das tcnicas de DNA recombinante conhecimento do processo de recombinao bacteriana.

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1928

1. Quando se injecta uma estirpe virulenta de estreptococos com cpsula o ratinho morre ao fim de algum tempo; 2. Quando se injecta mutantes da estirpe virulenta de estreptococos com cpsula (estes perdem a virulncia, isto , a cpsula) o ratinho permanece vivo; 3. Quando se injecta uma cultura de bactrias virulentas de estreptococos com cpsula que foi previamente fervida (ou sejas as bactrias morreram) o ratinho permanece vivo; 4. Quando se injecta uma mistura de bactrias virulentas de estreptococos com cpsula mortas (previamente fervidas) e de mutantes virulentos de estreptococos com cpsula (bactrias vivas no virulentas) o ratinho morre ao fim de algum tempo e nos seus tecidos eram encontradas bactrias virulentas de estreptococos com cpsula. CONCLUSO: As bactrias no derivam de uma bactria isolada, mas sim de um componente do extracto. Para transmitir a informao no necessrio que as bactrias estejam todas vivas. Ao adicionar bactrias virulentas mortas pela fervura (que sozinhas so inofensivas) a bactrias vivas no virulentas, as primeiras transformam estas ultimas em bactrias letais, virulentas e encapsuladas. Ele concluiu que havia um factor de transformao nas bactrias mortas pelo calor capaz de alterar as bactrias no virulentas tornando-as virulentas e encapsuladas. Falava saber qual era o componente do extracto responsvel pela transformao das bactrias no capsuladas em bactrias virulentas capsuladas. Em 1944, as experincias desenvolvidas por Avery, MacLeod e McCarty identificaram o DNA como sendo o factor de transformao.

Este grupo de cientistas tratou uma mistura, de todos os componentes celulares, de bactrias vivas no virulentas e de bactrias virulentas mortas com vrios enzimas). Depois de dividir os extractos em alquotas tratou cada uma delas com um enzima especifico e injectou o filtrado em bactrias vivas no virulentas. No final verificaram que s as alquotas tratadas com DNase que no transformavam as bactrias vivas no virulentas em bactrias virulentas. Eles extraram o DNA dos pneumococos virulentos mortos pelo calor, removendo as protenas o mais completo possvel, e adicionaram-no a bactrias vivas no virulentas, tendo verificado que o gene que codifica para a virulncia e para a formao da cpsula incorporou-se no cromossoma das bactrias no virulentas. Todas as geraes subsequentes destas bactrias eram virulentas e encapsuladas. Esta foi a primeira experincia que demonstrou claramente que a molcula de DNA que tem, neste caso, a informao gentica para a transformao de uma estirpe no virulenta em virulenta (que neste caso consiste na existncia de cpsula).

Nos anos 50 do sculo XX, a estrutura do DNA ainda no era conhecida, ou ainda no havia sido publicada. Nesta altura percebe-se a utilidade de usar istopos radioactivos, sendo que alguns deles so, inclusive, muito teis para marcar biomolculas: Fsforo, que est presente nos grupos fosfato do DNA mas ausente nas protenas; Enxofre, que est presente na composio de quase todas as protenas mas ausente no DNA. NA sequncia deste acontecimentos, em 1952 realizou-se uma experincia chave para o DNA com Alfred D. Hershey e Martha Chase. Estes marcaram fagos (vrus que infectam bactrias e que encerram no seu interior o seu genoma) com: enxofre (S) como marcador de protenas, mais concretamente o S marcado reactivamente (35S), de forma a conseguirem assim marcar as cpsides, as quais contm as protenas fsforo (S) como marcador do DNA, mais propriamente o fsforo 32P.

Ao misturar os fagos marcados radioactivamente com bactrias, os primeiros ao entrarem em contacto com a superfcie das bactrias injectam o seu material gentico para dentro das clulas, deixando a restante estrutura 10

na parte exterior. O DNA fgico replica-se levando ao surgimento de novas protenas fgicas. Estas protenas originam partculas semelhantes a fagos que so expulsas quando a clula bacteriana rebenta.

Nesta experincia, os cientistas cultivaram os fagos num meio com os respectivos istopos; depois adicionaram-nos a suspenses distintas de bactrias e; deixaram que eles infectassem as bactrias. Seguidamente agitaram para puderem separar as cpsides que ficaram no exterior das bactrias, das clulas bacterianas e seu contedo. As bactrias e as cpsides virais vazias (ghosts) formam depois separadas por centrifugao: 35S: o sobrenadante resultante (onde esto as cpsides) estava radioactivo e o sedimento (onde esto as bactrias propriamente ditas) estava limpo, OU SEJA, as clulas infectadas por fagos marcados com 35S no tinham radioactividade mas os fantasmas virais tinham;
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P: o sobrenadante resultante (onde esto as cpsides) estava limpo e o sedimento (onde esto as

bactrias propriamente ditas) estava radioactivo, OU SEJA, as clulas infectadas por fagos marcados 11

com

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P tinham o seu DNA marcado radioactivamente e os fantasmas virais no tinham

radioactividade.

CONCLUSAO: Como as partculas virais se formavam em ambos os casos, algum tempo depois das cpsides serem removidas eles concluram que a mensagem gentica para a replicao (para codificar novos bacterifagos) havia sido introduzida pelo DNA viral e no por protenas virais.

Imagem de difraco de RX da molcula de DNA. Associando as leis de Chargaff e as leis da qumica possvel associar os nucletidos e construir uma estrutura tridimensional da molcula ( uma dupla hlice com um padro que se repete).

Erwin Chargaff e colegas nos finais dos anos 40 fizeram descobertas no mbito da anlise da composio qumica do DNA que levaram a algumas concluses: FINAL DOS ANOS 40 ERWIN CHARGAFF E COLEGAS Analise da composio qumica do DNA As suas concluses levaram ao estabelecimento das LEIS DE CHARGAFF 1 Lei: A composio em bases de DNA geralmente varia de espcie para espcie; 2 Lei: O DNA isolado de diferentes tecidos da mesma espcie tem a mesma composio em bases (as clulas somticas so todas iguais do ponto de vista gentico); 3 Lei: A composio do DNA de uma dada espcie no se modifica com a idade, o estado nutricional ou as alteraes do ambiente (hoje sabe-se que no verdade, devido s mutaes);

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4 Lei: Em todos os DNAs, independentemente das espcies o n de resduos de Adenina igual ao n de resduos de Timina (A=T) e o n de resduos de Guanina igual ao n de resduos de Citosina (G=C), logo; 5Lei: o n da soma de resduos de purina igual ao n da soma de resduos de pirimidinas: A+G= C+T.

Em 1953,Watson e Crick propem um modelo em dupla hlice para o DNA baseados nas observaes de Chargaff e nos padres de difraco de raios X obtidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins:

Variao da composio de bases do DNA em diferentes organismos

A estrutura da molcula de DNA condiciona os mecanismos envolvidos na replicao e transcrio. Nas ligaes de H que se estabelecem entre as bases o nmero de ligaes que existe muito importante, uma vez que embora estas sejam ligaes fracas, quanto maior for o seu nmero maior a quantidade de energia necessria para quebr-las. Assim, as regies ricas em G e C tm as ligaes mais fortes do que as regies ricas em A e T, isto , o DNA mais difcil de separar. possvel separar as duas cadeias (por exemplo por aumento temperatura) permitindo a transcrio de genes, uma vez que apesar do seu esqueleto estvel a molcula dinmica (ligaes de H, interaces hidrofbicas, ligaes de Van der Waals).

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A dupla hlice

As cadeias

duas

polinucleotidica s esto enroladas em torno de um eixo comum e crescem em sentidos opostos. Os planos das bases so perpendiculares ao eixo da hlice, e os planos das oses esto mais ou menos perpendiculares aos das bases. A estrutura helicoidal repete-se aps dez aminocidos em cada cadeia.

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As duas cadeias so mantidas juntas por pontes de hidrognio entre os pares de bases. Sendo que a sequncia de bases ao longo da cadeia polinucleotdica no de nenhum modo restrita. A sequncia exacta de bases a portadora da informao gentica.

- Factores que determinam a estrutura da molcula de DNA

A estrutura do DNA faz dele uma molcula extremamente flexvel. podem ocorre , por exemplo, roraoes em torno de um nmero de ligaes no esqueleto fosfato-acar. J foram encontrados desvios significativos estrutura de Watson e Crick, porm nenhum destes desvios afecta as propriedades chave da dupla hlice: a complementaridade das cadeias; as cadeias so anti-paralelas; a complementaridade entre G e C, e A e T. 15

- As diferentes formas estruturais da dupla hlice A dupla hlice proposta por Watson e Crick referida como a forma B do DNA, sendo esta a forma mais estvel sob condies fisiolgicas. As variantes estruturais desta so a forma A e a Z.

Forma A:
Dupla hlice enrolada para a direita; Distncia entre pares de bases de 0.23 mm ou 23 ; N de pares de bases por volta de hlice 11; Hlice mais compactada;

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 Aparece em certas bactrias que esporulam.

Hlice mais curta e com maior dimetro que uma molcula de B-DNA (dimetro de 20 ).

Forma B:
a mais comum; Dupla hlice enrolada para a direita; Distncia entre pares de bases de 0.34 mm ou 34 ; N de pares de bases por volta de hlice 10,5.

Forma Z:
Mais estreita; Dupla hlice enrolada para a esquerda; Distncia entre pares de bases de 0.38 mm ou 38 ; N de pares de bases por volta de hlice 12; Tem tendncia para aparecer em sequncias G-C, G-C (zonas de regulao); O esqueleto tem um aspecto em zigue-zague; Pensa-se que aparecer em locais de regulao, relacionados com recombinao gentica.

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Helix type A Shape Rise per base pair Helix diameter Screw sense Glycosidic bond Base pairs per turn of helix Pitch per turn of helix Tilt of base pairs from normal to helix axis Major groove (volta >) Minor groove (volta <) Narrow and very deep Very broad and shallow Wide and quite deep Narrow and quite deep Flat Very narrow and deep 25.3 19 35.4 1 45.6 9 Broadest 2.3 25.5 Right-handed anti 11 B Intermediate 3.4 23.7 Right-handed anti 10.4 Z Narrowest 3.8 18.4 Left-handed alternating anti and syn 12

As alteraes da forma da hlice de DNA podem ter capacidade informativa no s a sequncia de nucletidos que tem informao; a sua forma (A, B, Z) pode ser chamativa (atractiva) para certos componentes dos mecanismos celulares. In vivo a forma A e Z parecem ocorrer. Em laboratrio foram produzidas outras estruturas da hlice: as formas C, D e E DNA, porm estas parecem no ocorrer in vivo. As formas A-, B- e C-DNA so formadas por fibras de DNA sujeitas a diferentes graus de humidade: A 75%; B 92% e C 66%

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A forma Z-DNA forma-se frequentemente em sequncias de purinas e pirimidinas alternantes. Especialmente alternncia G e C ou 5-metil-C e G.

A-DNA
Bactrias Gram+

Contexto Biolgico
Esporulao (esporo uma estrutura resistente)

Protenas do esporo solveis em cidos SASPS Algumas destas protenas induzem o B-DNA a assumir a forma A-DNA, pelo menos in vitro

-O DNA dos esporos mais resistente aos danos causados por UV; esta abolidada em mutantes que no possuem SASPS; -UV induz o cross-linking entre bases pirimidinas -Na forma A a distncia entre as pirimidinas sucessivas est aumentada

SASPS: tem propriedades de transformar o DNA na forma A. Qual a vantagem para o esporo estar na forma ADNA? Tendo em conta que as bases do DNA absorvem no espectro UV, o que pode provocar a destruio dos anis das bases, provocando uma mutao e; que a forma A a mais empacotada (ou seja, as bases esto mais escondidas na estrutura) a sua capacidade de absoro de UV est diminuda. esta forma tambm protege o DNA de outras substncias que o afectem.

Z-DNA

Contexto Biolgico

A converso reversvel entre B e Z-DNA em pequenos segmentos de DNA sob dadas circunstncias poder funcionar como uma forma de regular a expresso gentica; recombinao gentica.

Recombinao gentica

Em E. Coli existe uma enzima que metila uma sequncia de bases especfica in vitro quando o DNA se encontra na forma B mas no na forma Z

Forma H:
Estrutura pouco usual; Sequncias de polipirimidinas e polipurinas (ex: resduos T e C alternantes); Trata-se de uma hlice tripla que se forma espontaneamente apenas em longas sequncias. Contudo apenas

pirimidinas ou apenas purinas, numa das cadeias;

Tem 3 cadeias: 2 das 3 cadeias da dupla hlice contm pirimidinas e a 3 apenas contm purinas; Estas variaes estruturais tendem a ocorrer em locais importantes: para a replicao, recombinao e transcrio (ex:

protenas de ligao ao DNA reconhecem sequncias que muitas vezes so palindromas).

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O DNA nativo ao ser aquecido (70-80C) desnaturado, isto , as duas cadeias afastam-se sucessivamente ate ficarem completamente desemparelhadas. Depois de separadas podem acontecer dois fenmenos: se se diminuir progressivamente a temperatura at temperatura ambiente a molcula inicial regenerada; se se diminui a temperatura bruscamente (congelar) a molcula permanece desnaturada para sempre. Esta capacidade de desnaturar e renaturar no implica que as cadeias sejam provenientes do mesmo local, mas sim que o nmero de bases seja suficiente para emparelhar as duas cadeias polinucleotdicas. De notar que quanto mais desnaturada est a molcula, mais expostas esto as suas bases e, consequentemente, mais luz UV ela absorve Quando se pretendem separa as molculas de DNA existe uma temperatura de desnaturao ideal para cada cadeia porque o nmero de ligaes de hidrognio diferente, ou melhor, o contedo das cadeias em bases C e G (estabelecem trs pontes de H necessrio uma maior quantidade de energia para quebrar as ligaes) diferente.

Tm = Melting Temperature Foram testados trs tipos de DNA: um contendo apenas AT; outro com AT e GC; e um outro apensa com GC. Da observao do grfico podemos verificar que a Tm tanto maior quanto maior for o teor em GC. No esquecer nunca que a temperatura de desnaturao no depende apenas do contedo em GC, tambm depende do tamanho da molcula. NOTA: O genoma das bactrias termfilas tem um contedo de GC superior ao das mesfilas. Sabendo o contedo de GC podemos saber a composio da molcula de DNA que se est a estudar (ex: GC=70% AT=30%).

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