Enzimas Imobilizacao

Imobilizao de Enzimas
JANAINA DUARTE BAUMER

SIANNAH MARIA MAS DIEGO
Prof. Agenor Furigo Jr.
Setembro/2008
O principal interesse em imobilizar

uma enzima obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que no sejam
afetadas durante o processo.
Os processos de bioconverso enzimtica tm sido
bastante utilizados na produo, transformao e
valorizao de matrias-primas.
Reaes
Enzimticas
Desvantagens
Reatores
Batelada
Custos operacionais
Baixa Produtividade
Problemas de Remoo da E
Variao na Qualidade dos Produtos
Visando a obteno de reaes com:
> uniformidade tecnolgica
viabilidade econmica,
Utilizao de Enzimas na
Forma Imobilizadas
Enzimas Livres x
Imobilizadas
Livres
Instabilidade
Rpida perda da
atividade cataltica
No regenerao
Imobilizadas
Reutilizao
Maior estabilidade
(Faixas mais amplas
de pH e Temp.)
Menor interferncia
de inibidores e/ou
ativadores
Mtodos de Imobilizao
Existem duas principais tcnicas:
Modificao qumica da molcula:
+ Substrato no sofre impedimento estrico pela
matriz
- Pode ocorrer ligao atravs do stio ativo
tornando-se inativa
Ligao fsica da enzima em uma matriz inerte:

+ Maior velocidade de reao e facilidade no
preparo
- Impedimento estrico da molcula de substrato
Mtodos para Imobilizao de Enzimas
Ligao em Suportes Slidos
Confinamento
Matriz
- Adsoro (carvo ativo)
- Ligao Covalente (celulose, slica)
- Ligao Inica (celulose)
Cpsula
Microcpsula
1. Imobilizao por incluso (Confinamento):
Retidas na rede tridimensional de um polmero
insolvel na gua;
Aprisionadas no interior de cpsulas ou
microcpsulas delimitadas por uma membrana
semipermevel;
No estabelecida ligao qumica ao suporte e
conserva a sua integridade molecular.
1.1 Incluso em uma matriz;
1.2 Encapsulao;
1.3 Microencapsulao.
1.1 Incluso em uma matriz;
Em linhas gerais consiste no aprisionamento
das molculas de enzimas entre as malhas de
um polmero geliforme.
1. 1.1 Incluso em uma matriz;
Simples ligao fsica entre enzima e suporte;
Nesse caso no h risco de desnaturao, pois
no so empregados reagentes qumicos,
As limitaes difusionais so intensas.
1. 1.1 Incluso em uma matriz;
Matriz
Polmeros sintticos
Silicone, Poliuretano, Nylon,
Polissacardeos
Alginato, Quitosana, Pectina,
Protenas
Colgeno, Gelatina Albumina,
1.2 Encapsulamento:
A enzima imobilizada no interior de esferas,
cujo envoltrio constitudo por um polmero
geliforme e semipermevel.
E
E
E
E
E
E
1.2 Encapsulamento:
Enzima em uma
soluo aq.de Na
E
Gotejada
Forma-se uma esfera,

dentro da qual as E
ficam retidas
(membrana = polmero
de alginato de Ca)
Soluo aq.
contendo on
bivalentes (Ca2+)
Quando a gota de
alginato de Na entra
em contato com a sol.
salina
E
1.3 Microencapsulamento
Consiste na preparao de um sist. emulsionado,
onde a enz. est confinada no interior das micelas.
No se pode encapsular enz. que destruam a
matriz polimrica.
Enz. hidrolticas no so adequadas para o
encapsulamento, pois seu substrato de interesse
geralmente de alto peso molecular.
Polimerizao provoca desativao da enzima
Soluo aq.
de enzima
Hexametilenodiamina
Resultante da
polimerizao da
diamina com cl.
de sebacila
Fase orgnica
Cl. de sebacila
Emulsificante
Obtm-se as gotculas da
soluo enzimtica
envolvidas por uma
pelcula semi-permevel
Vantagens e incovenientes dos mtodos de
incluso:
Convm a quase todos os tipos de enzimas;
Restrio pelos fenmenos de impedimento
estrico e de difuso atravs do gel ou da
membrana.
2. Fixao das enzimas sobre suporte slido:
A enzima deve ser fixar to solidamente quanto
possvel;
Bentonita: Insolvel em gua, mas uma vez
hidratada intumesce e abre-se como uma espoja
altamente porosa e carregada magnticamente.
2.1 Fixao por adsoro

2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes
2.1. Adsoro
Consiste da unio entre a enz. e um suporte
inerte atravs de interaes inicas, adsoro
fsica, ligaes hidrofbicas e foras atrativas
de Van der Waals.
Suportes:
Orgnicos
Inorgnicos
Derivados da DEAEcelulose, Dowex

Celite, bentonita e
alumina
Trata-se de um mtodo simples, de aplicabilidade
generalizada.
Efetua-se por simples mistura da enz. com o

suporte, mas condies de pH e fora inica
adequados, em seguida lava-se a enz. que no
ficou ligada.
Suportes: Carvo ativado, xidos metlicos, vidros,
resinas polimricas.
Diferentes parmetros vo influenciar na
quantidade de enz. fixada e solidaridade das
ligaes:
Do pH do meio dependem o nmero e a
natureza das cargas sustentadas pelo suporte.
Sais em
[ ] aumentam a solubilidade das
enz.
Com da T existe a probabilidade de se
aumentar a criao de ligaes
Vantagens:
Procedimento extremamente simples custos
Ligao ocorre por simples exposio e as
condies so brandas
Os efeitos difusionais so despresveis
Desvantagens:
Enz. so altamente dependentes de pH,
solventes, substrato e Temp.
Podem ser facilmente dessorvidas com a
alterao destes parmetros
* uma das tcnicas mais usadas.
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes
A enz. ligada ao suporte inerte mediante
ligaes qumicas covalentes, que so,
normalmente,
estabelecidas
entre
os
aminogrupos primrios e o anel fenlico dos
aa constituintes da enz. com os grupos
reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre
outros).
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes
Em geral, as reaes so feitas em meio
aquoso, Temp. entre 0C e 25C e o pH
prximo neutralidade
A escolha das condies ir depender da
estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de
formao das ligaes covalentes, assim como a
estabilidade das ligaes suporte-enzima frente
ao pH de utilizao do sistema imobilizado.
Vantagens:
Maior eficincia e estabilidade.
No so to suscetveis a pH, fora inica,
solventes e Temp.
Os suportes so escolhidos por suas propriedades
de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade
mecnica, rea superficial, intumescimento e
natureza hidroflica ou hidrofbica.
Suportes: inorgnicos, polmeros naturais e
sintticos.
Suportes:
Vidro;
Slica;
Sephadex;
Celulose;
Nylon;
Poliestireno.
Efeitos causados pela imobilizao
Ao se agregar uma E a um material inerte, por
mais suave que seja o procedimento, razovel
esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade
cataltica.
Efeitos causados pela imobilizao
Interferncia da imobilizao sobre a atividade
cataltica da E.
Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a

invertase nas formas solvel e insolvel
cataltica da E.

cataltica da E.

Dentre os vrios efeitos que a imobilizao pode
causar salienta-se:
Modificao da estrutura tridimensional
Efeitos estricos e de conformao
Efeitos de Microambiente
Efeitos difusionais
Resistncia difusionais externas
Efeitos difusionais internos
Efeitos estricos e de conformao

Quando a enz. ligada ao suporte, pode sofrer
alguma mudana na conformao, o que
poder abalar sua eficincia cataltica.
O processo de interao enz. suporte quase
sempre aleatrio, poder suceder que a regio
do sitio ativo se torne menos acessvel ao
substrato (impedimento estrico).
Efeitos de microambiente
Quando a E ligada a um suporte inerte, ela
vai ficar sujeita a uma circunvizinhana algo
do que quando esta livre. Esse fato poder se
refletir sobre os valores dos parmetros
cinticos.
Os efeitos da circunvizinhana, que dependem
da natureza fsica e qumica do suporte, podem
acarretar uma distribuio desigual do
substrato, produto e cofatores entre a regio
vizinha do sist. imobilizado e o resto da
soluo.
Efeitos de microambiente
O comportamento cintico de uma enzima
presa a um suporte carregado pode diferir
daquela apresentado pela enzima livre.
Efeitos Difusionais
Quando a E imobilizada sobre ou dentro de
um suporte slido, o substrato deve se difundir
do seio da soluo at o sitio ativo da E.
Se a velocidade de difuso do substrato <
que a veloc. de transformao pela E = a veloc.
observada mais baixa do que a esperada,
visto que nem todas as molculas de E estaro
em contato com o substrato, (atingem a
saturao).
Efeitos Difusionais
Resistncia difusionais externas
Surgem devido ao fato de que o substrato
deve ser transportado do seio da soluo at
a superfcie de catlise
Efeitos difusionais internos
Surgem devido movimentao do substrato
no interior do meio cataltico poroso
Propriedades de Enzimas
Imobilizadas
Medida da atividade:
Atividade residual de E imobilizada mais fraca
que a das E nativa, mas a estabilidade maior
Influencia das condies operacionais:
pH e T desnaturao parcial ou total da
protena;
Imobilizada resistem melhor a variaes de
pH e tratamentos trmicos;
Vantagens
As enzimas podem ser reutilizadas
Os
processos
qumicos
podem
ser
continuamente
operados
e
prontamente
controlados
Os produtos podem ser facilmente separados
Os problemas de efluentes so minimizados
A repetibilidade do processo pode ser
aumentada
estabilidade
custos
Desvantagens
Aleatoridade da interao enzima-substrato;
Inexistncia de um mtodo geral
imobilizacao;
Atividade cataltica devido a efeitos:
de
Microambiente
Difusionais
Estricos /
Conformacionais
Tipos de Suporte
Existem inmeros materiais inertes que podem
ser usados.
A natureza fsica desses suportes pode variar,
desde materiais geliformes at superfcies
slidas (prolas de vidros) recobertas com
alguma substncia capaz de interagir com a E.
A escolha do mtodo de imobilizao e do tipo
de suporte depender, essencialmente, de dois
fatores:
- das caractersticas peculiares da E
- das condies de uso da E imobilizada
Tipos de Suporte
No existe um mtodo geral de imobilizao e
nem um suporte universal. Geralmente as
condies de imobilizao para uma E s
poderam ser estabelecidas empiricamente.
Enzima
Imobilizar
Escolher o suporte e o
mtodo que apresentam
> atividade
Vrios Suportes e
Diferentes Mtodos
Avaliar a Atividade
do Sistema
Tipos de Suporte
Tabela 1. Classificao de suportes inertes.
Tipos de Suporte
Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus
subtilis imobilizada em vrios suportes e por
diferentes mtodos.
Tipos de Suporte
Exemplo 1:
AVALIAO DA ATIVIDADE DE LIPASES
IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA
(Santos et al.,1997).
Foi realizado um estudo sobre a atividade de

diferentes lipases (lipases de Candida rugosa,
Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e
Lipolase) imobilizadas em gel de pectina,
avaliando sua atividade cataltica em meio
orgnico.
A pectina heteropolissacarideo que formar gis
em presena de ctions
Preparo do gel de pectina:
9 mL de uma soluo
tampo fosfato, pH 7,2
Sol. Aq.
de E
esfriada a 40C
0,8 g de pectina ctrica
aquecida at a
completa dissoluo
agitada vigorosa e deixada

esfriar a T ambiente.
Gel de pectina
Sol. Cl. Clcio
Removidos para um
erlenmeyer contendo
25 mL de hexano.
formar um sist.
rgido e estvel
Cortados em
peq. cubos
de 125 mm3
Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste

gel atravs da reao de esterifcao do c. lurico
com o n-pentanol.
Foram utilizados quantidades equimolares dos
substratos (0,01 mol). As reaes foram realizadas
em uma incubadora sob agitao a 25C.
Tabela 1 Rendimentos para a reao de
esterificao do c. lurico com o n-pentanol
catalisada por diferentes lipases imobilizadas em
gel de pectina.
Tabela 1Rendimentos para a reao de
esterificao do cido lurico com o n-pentanol
catalisada por diferentes lipases imobilizadas em
gel de pectina.
Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e
procedncias (Amano e Sigma), foram imobilizadas
no gel de pectina, nas mesmas condies descritas
anteriormente variando-se a [ ] de enzima.
Quanto > a [Enz.] > o rendimento
Estes resultados demonstram:
Que quando E so imobilizadas por mtodos de
envolvimento, a quantidade de biocatalisador e
AE so fatores importante para uma catlise +
eficiente, uma vez que as reaes ocorrem por
difuso dos substratos no gel.
Viabilidade do uso do gel de pectina como
suporte para a imobilizao de enzimas e sua
aplicao em meio orgnico.
Exemplo 2:
Determinao das propriedades catalticas
em meio aquoso e orgnico da lipase de
Candida rugosa imobilizada em celulignina
quimicamente modificada por
carbonildiimidazol
(Fabrcio M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle
dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)
Imobilizao da lipase em celulignina
O suporte foi inicialmente neutralizado pela
adio de uma sol. de hidrxido de sdio (0,1 M)
e, em seguida, tratado com carbonildiimidazol
diludo em dimetilsulfxido (5 mg/mL).
A imobilizao consistiu do contato da sol.
enzimtica (250 U) com o suporte previamente
umedecido com hexano na presena de
polietilenoglicol por 21 h.
A enzima imobilizada foi recuperada por filtrao
a vcuo e o sistema lavado com hexano gelado
para reduo do teor de gua.
Propriedades catalticas da
imobilizada em meio aquoso
lipase
livre
A atividade enzimtica da lipase nas formas livre

e imobilizada foi determinada pelo mtodo de
hidrlise do azeite de oliva.
Para verificar as alteraes causadas nas
propriedades originais da lipase livre, foi
determinada a influncia do pH e da T na AE das
lipases livre e imobilizada, bem como estimados os
parmetros cinticos.
Influncia do pH
imobilizao deslocou
o pH timo da enz.
livre, para um valor de
pH + bsico.
Influncia do pH
Mudanas conformacionais
da enz. ou alteraes de [ ]
entre
as
espcies
carregadas,
substrato,
produto, ons H, ons OH,
tanto no microambiente da
enz. imobilizada quanto no
meio
reacional
(macroambiente).
Influncia da Temperatura
A
imobilizao
parece conferir
alguma proteo
enzima
Influncia da Temperatura
Imobilizao: Ttima,
o
que
permite
operaes em uma
faixa > de T.
O da Ttima deve-se
ligao da E ao
suporte, impedindo o
desdobramento
da
estrutura terciria.
Parmetros cinticos
Nas Figuras 3 e 4 so apresentadas as
atividades da lipase livre e imobilizada,
respectivamente, em funo da [ ] de cidos
graxos presentes na emulso leo e gua
contendo diferentes propores de azeite de
oliva (10-50% m/v).
Parmetros cinticos
Parmetros cinticos
Sem inibio por P ou

reduo do teor de
gua no meio reacional
Cintica do tipo
Michaelis-Menten
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a
Vmax de reao foram calculadas com auxlio do
programa Enzyme Fitter.
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a
Vmax de reao foram calculadas com auxlio do
programa Enzyme Fitter.
Mediante imobilizao, a afinidade da lipase pelo
substrato foi . Esse comportamento se deve <
transferncia de massa do meio reacional para o sist.
imobilizado, pois o processo de imobilizao reduz a
difuso do substrato nos interstcios do suporte
Este um perfil tpico dos sistemas imobilizados,
tendo em vista que a E livre exerce sua atividade
cataltica em um meio homogneo, enquanto a E
imobilizada em um suporte slido deve agir em um
meio heterogneo.
O da atividade das enzimas imobilizadas
s mudanas conformacionais na sua estrutura
terciria
impedimentos estricos.
Testes de estabilidade
Estabilidade estocagem
A lipase imobilizada foi estocada a uma
temperatura de 4 C por 90 dias.
Testes de estabilidade
Estabilidade estocagem
A lipase imobilizada foi estocada a uma
temperatura de 4 C por 90 dias.
Estvel por
30 dias
Estabilidade trmica
Estabilidade trmica
97%
60%
Estabilidade trmica
37%
9%
Exemplo 3:
Imobilizao de Lipase de Candida
antarctica B em Esferas de Quitosana para
Obteno de BiodieseI por
Transesterificao de leo de Mamona
(Cruz Jr., Amrico; Pacheco, Sabrina Moro
Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)
Produo de biodiesel transesterificao (reao
qumica dos c. graxos contidos nos leos vegetais

ou gorduras animais com o etanol ou o metanol
estimulado por um catalisador - cidos, bsicos ou
enzimticos).
Indstrias qumicas utilizam a catlise bsica.
Esse processo possui vrios inconvenientes
como a baixa seletividade do catalisador, levando
a indesejveis reaes paralelas.
Considerados como not ecologically friendly
Suas desvantagens impulsionaram a pesquisa
por novos catalisadores lipases.
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a
sntese de steres formados a partir do glicerol e c.
graxos de cadeias longas.
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a
sntese de steres formados a partir do glicerol e c.
graxos de cadeias longas.
Lipase Livre
Invivel
Biopolmero
imobilizadas em suportes
Quitosana
slidos, que lhes
conferem > resistncia e
facilitam sua recuperao
perdem atividade em
condies e meios
desnaturantes
a vida til
Otimizao do processo de ativao:
O processo de ativao das esferas de
quitosana consistiu em adicionar 2mL de
solues de glutaraldedo 0, 1, 3, 5, 7 e 9% (v/v)
em 30 esferas de quitosana (perodo de
incubao de 24 h 25oC).
Atravs dos resultados obtidos, foi possvel
observar que ocorreu uma significativa queda na
AE do sobrenadante, quando a sol. enzimtica foi
incubada com esferas ativadas com soluo de
glutaraldedo 3%.
Quando a molcula da E est ligada a um suporte,
ela
precisa
conservar
suas
distncias
intermoleculares o que torna sua conformao +
rgida = + resistente a mudanas conformacionais
induzidas por ag. desnaturantes.
No entanto, quando a [ ] de glutaraldedo usada
muito alta, uma quantia > de grupos aldedos reage
com um nmero > de resduos da E tornando sua
estrutura muito rgida, com conseqente distoro
de sua conformao = a perda de atividade.
Necessidade da otimizao do processo
imobilizao da E nas esferas de quitosana
de
Caracterizao das E imobilizada comercialmente:
Anlise de AE em pHs (3,0 - 10,0 a 25oC) e
temp. (25 - 100oC em pH 9,0).
Os estudos relacionados ao perfil de atividade x
pH e atividade x temp., revelaram que:
CALB L pH 5,0 e 100C,
NOVOZYM 435 pH 9,0 e 100C
A reao de transesterificao para a produo do
biodiesel foi realizada atravs da incubao do leo
de mamona e etanol na razo 3:1 juntamente com
3% m/m de E em um reator tipo batelada, de 0,5 L.
Na reao de transesterificao com o leo de

mamona e o etanol, foi possvel observar uma
eficiente taxa de converso de triglicerdeos para
seus respectivos steres etlicos.

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JANAINA DUARTE BAUMER

O principal interesse em imobilizar

Ligao fsica da enzima em uma matriz inerte:

Ligao em Suportes Slidos

Forma-se uma esfera,

2.1 Fixao por adsoro

Derivados da DEAEcelulose, Dowex

Efetua-se por simples mistura da enz. com o

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a

Efeitos estricos e de conformao

Foi realizado um estudo sobre a atividade de

0,8 g de pectina ctrica

agitada vigorosa e deixada

Sol. Cl. Clcio

Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste

Quanto > a [Enz.] > o rendimento

A atividade enzimtica da lipase nas formas livre

Sem inibio por P ou

qumica dos c. graxos contidos nos leos vegetais

Na reao de transesterificao com o leo de

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