Mtodos Analticos de

Separao
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia - HPLC

Carla Pereira de Morais

Deborah Vilhagra Faria
Mariana Barbosa da Silva
Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro

Rafael Carbone Cintra

Rafael Rovatti Pupin
Renan Pedroso

Disponvel Online em 30/04/2013

Introduo
leos essenciais: substncias lipossolveis, porm volteis,
que podem ser extradas das plantas.
Folhas e frutos
Podem ser extrados:

Madeira, cascas e razes

Sementes

Estrutura-base dos leos essenciais

Formados basicamente por:
i.

Monoterpenos: 10 tomos de C na estrutura

ii. Sesquiterpenos: 15 tomos de C na estrutura

iii. Fenlicos, alifticos, hetocclicos

Timol Monoterpeno

Bisabolol Sesquiterpeno

Aplicaes:
i.

Cosmticos

ii.

Medicina Natural

iii. Produtos de cuidados pessoais

Anlise:
Comumente feita por GC MS (Cromatografia
Gasosa acoplada ao espectrmetro de massas).
Dificuldades encontradas:
- Terpenos possuem espectro de massas
idnticos.
- So termicamente lbeis: alta temperatura
do injetor modifica estruturas.

Devido volatilidade e baixa capacidade de absoro UV

da maioria dos seus componentes, os leos essenciais tm
sido pouco analisados por HPLC.
Assim, proposto um novo mtodo por anlise em HPLC:
lcoois e outras funes contendo grupo
constituem maior parte dos leos essenciais.

hidroxila

Uma forma de aumentar a capacidade de absoro UV

derivatizar os lcoois para funes que sejam sensveis
tcnica.

Objetivo e importncia da
anlise
Identificar lcoois em amostras de leos essenciais
disponveis comercialmente, a fim de garantir a
qualidade dos produtos.

Tcnica de anlise por HPLC UV apresenta diversas

vantagens e aplicabilidades:
i.

Alternativa para mtodo usual de GC MS.

ii.

Melhor limite de deteco.

iii. Mtodo de anlise rpido.

Substncias analisadas
1) lcoois alifticos presentes no hortel.
M. arvensis
Amostras:
M. pipericis

Principal componente do
leo essencial de hortel
o mentol.
Indstria farmacutica,
alimentcia e de cosmticos

2) leos essenciais de rosa

Principais
componentes do
leo de rosas so
citronelol e geraniol.

Aplicaes
Calmante

Hidratante para pele

Caracterizao da Coluna
Cromatogrfica

Coluna termosttica

Fase estcionria Ascentis-Express C8

fused-core particle (ncleo macio)

Partculas de 2,7 m

Dimenses da Coluna:

Fase mvel:

Coluna Supelco (150 mm x 4,6mm).

Acetonitrila/gua, contendo 0,1% de cido Actico.

Modo de eluio em gradiente:

30/70% de Acetonitrila/gua at 80/20%.

Tempo de Eluio:

40 minutos

Vazo:

1ml/min

Preparao da Amostra
GC-FID (flame ionization detector)

Dissoluo em hexano;
10 L da amostra foram aplicados;
Gs de arraste: N2 (1 mL/min);
50C - 250C: 20C/min;
FID: 280C.

GC-MS (detector de massas)

Dissoluo em hexano;
Injetados 4 L de amostra;
Gs de arraste: He (1 mL/min).

 HPLC-UV

Esterificao:

 HPLC-UV
0,2g do leo essencial ou uma alquota de
um soluo de 5000 g/mL de um lcool;
0,75g de anidrido ftlico, 0,25g de uria
finamente moda e 2 mL de 1,4-dioxano;
A mistura foi agitada em um vortex e
aquecida a 105C em um banho de leo
siliconado termosttico por 90 minutos;

 HPLC-UV

Volume foi completado para 12 mL com 2:1

MeOH/gua contendo 0,1 M NH3;
Diluio em acetonitrila/gua e injetadas
(20C);
Eluio: ACN/H2O (0,1% cido actico);
Gradiente: 30 - 80% de ACN (1 mL/min);
Foram injetados 20 L de amostra;
O gradiente era linear, com tempo de 20 e
40 minutos e colunas a 10 e 25C.

Princpio do funcionamento do
detector por ionizao em
chama

Formao de ons quando

um composto queimado
em
uma
chama
de
hidrognio e oxignio.

Espectrmetro de Massas
Princpio:
Deteco
dos
analitos com base em seu
pico
molecular
(PM),
informando a massa atmica
com grande preciso.

Detector UV
Princpio:
fundamenta-se
na capacidade do analito
em absorver uma certa
quantidade de luz sob uma
faixa de comprimento de
onda (180-350 nm).

leos de Hortel

leos de Rosa

Nome

Nome IUPAC

leo

pKa mais
cido

Terpinene-4-ol

Terpinen-4-ol

Hortel e Rosa

14,94

Thymol

5-metil-2-(1-metiletil)fenol

Hortel

10,59

Isopulegol

(1R,2S,5R)-5-metil-2-(pro-1en-2-il)ciclohexan-1-ol

Hortel

15,11

-citronellol

3,7-dimetil-6-octen-1-ol

Hortel e Rosa

15,13

Menthol

5-metil-2-(propan-2il)ciclohexan-1-ol

Hortel

15,3

Carveol

2-metil-5-(1-metiletenil)-2ciclohexen-1-ol

Rosa

14,6

Phenylethyl
alcohol

feniletanol

Rosa

15,17

Linalool

3,7-dimetilocta-1,6-dien-3ol

Rosa

14,51

Geraniol

(2E)-3,7-dimetilocta-2,6dien-1-ol

Rosa

14,45

Resultado e discusso
Otimizao da separao HPLC de lcoois derivados
de menta e rosa leos essenciais

Cromatogramas do
leo essencial

derivado da hortel
da marca comercial
Al Fayed.

 A figura 2A mostra um cromatograma do leo

essencial derivado da hortel da marca comercial
Al Fayed.
Somente 12 picos com uma proporo de sinal para-rudo

significativos

foram

includos

na

otimizao das condies de separao utilizando

DryLab.
Foram excludos os picos do branco do reagente,
que

foram

cromatograma.

localizados

na

cabea

do

Fatores levados em considerao para projetar o

conjunto inicial de experimentos

Concentraes de ACN inicial e final, 30% e 80%

respectivamente

Selecionadas de acordo com a literatura de HPLC

Separao de ftalatos com 8 < n < 18 tomos de

carbono

Tempo mnimo e mximo de gradiente

Entre 20 e 40 min por convenincia

Variao da temperatura

Entre 5 e 25C

 reas vermelhas do mapa correspondem maior

resoluo do par pico mais crtico (RC).
A resoluo foi prevista para um tempo de gradiente
39 min a uma temperatura de coluna de 8C.

Os tempos de reteno para os picos e as resolues

para os cromatogramas previstos e experimentais, obtidos nas
condies otimizadas, so apresentados e comparados na
Tabela 1.

 Os erros mdios:
Tempo de reteno = 1,2%
Resoluo = 19,1%

Os erros de previso foram muito maiores para as

resolues que para tempos de reteno;

Fatores que influenciam nos erros de resoluo:

Erros de tempo de resoluo
Incertezas de pico
Largura de simetria

Cromatogramas do leo essencial derivado de rosas da

marca comercial Al Fayed.

 Reaes das amostras de de M.arvensis e M. Piperita e leo

de rosas da Al Fayed (indicado na Parte Experimental)
Produtos obtidos: derivados de lcoois
Somente 8 picos foram includos na otimizao das
condies de separao utilizando DryLab.
Condies da melhor resoluo do par pico mais crtico
Tempo gradiente de 37 min
Temperatura de 6C
Condies ideais obtidas para leos essenciais de hortel e
rosa
Tempo gradiente de 39 min

Temperatura de 8C
Condies escolhidas por simplicidade

 A resoluo do par de pico mais crtico (RC = 1,34 )

foi apenas ligeiramente menor do que o obtido nas

condies timas ( CV = 1,51 ).

Os erros mdios:
Tempo de reteno = 1,3%
Resoluo = 29,1%

Identificao de lcoois no derivados e

derivados de leos essenciais utilizando HPLC-MS
Identificao dos picos cromatogrficos (figura 2 e 4)
Acoplamento em srie da deteco MS com deteco
no UV-Vis

Cromatogramas dos padres de lcool de leo

essencial de hortel e de rosa, sem e com derivao

do anidrido ftlico, foram obtidos nas condies

ideais para o leo essencial de hortel derivados.

 Dos sinais mais intensos [M-H ]- foram obtidos ons

dos

steres

de

ftalato

dos

mesmos

lcoois

observados com os leos no derivados, como

mostra a tabela 2.

Cromatograma UV de uma amostra no

derivada de leo essencial de hortel.

 Componente que absorve a 230 nm

Timol

O pico predominante de mentol

pico n12;
picos das outras quatro compostos (Tabela 2).

Com base nos dados de MS apresentados na tabela 2

( colunas 4 e 7), at seis picos correspondentes a vrios

lcoois foram identificadas.

Estudos de Quantificao

Parmetros avaliados na HPLC UV

Preciso
Linearidade

Sensibilidade (limite de deteco)

Quantidade de anlises
3 vezes ao dia durante 3 dias
Mistura padro injetada 1 g/mL de cada analito

 Curvas de calibrao
Lineares
Srie de 200 g/mL
Coeficientes de correlao melhores que 0,998

Curvas de calibrao por adio de padro

3 solues de leos essenciais
Concentrao crescente de 100 g/mL
Coeficientes de correlao maiores que 0,999

 Cromatografia Gasosa com FID e MS

Presena de lcoois confirmada por:
ndice de reteno
Dados da Espectrometria de Massas
Injeo de padro de lcoois

 Curvas de calibrao GC FID e GC MS

Intervalo 1 200 g/mL

Curvas lineares

Coeficientes de correlao melhores que 0,999

Limites de deteco (Tabela 3)

HPLC UV

Quantificao de componentes alcolicos do leo

essencial de hortel e rosa

GC FID e GC MS

Resultados obtidos (Tabela 4 e Tabela 5)

 HPLC UV e GC
Valores similares

Intervalo de confiana: 95%

Menthol: principal constituinte do leo essencial de
Hortel (Tabela 4)
Feniletil lcool: principal constituinte do leo essencial
de Rosa (Tabela 5)
Resultados correspondem aos da literatura

HPLC UV versus Cromatografia Gasosa

Performance cromatogrfica

Preparao da amostra

GC: preparao confivel

HPLC: a derivao da amostra necessria

para anlise

Descries na literatura

GC: muitas descries da separao de

componentes de leos essenciais

HPLC: literatura escassa

 Desenvolvimento do mtodo

Mais complexo para HPLC UV do que para GC;

Software utilizado: DryLab reduz o esforo e
tempo

necessrios

separao.

para

otimizao

da

 Sensibilidade
HPLC UV e GC MS: limites de deteco
similares para o lcool ftaltico;
Resultados obtidos pela HPLC UV e GC MS
foram melhores que os obtidos pela GC FID;
Derivao de lcool seguida por HPLC UV
mais seletiva que GC.

 Tempo de anlise
Desvantagem HPLC:
Derivao: demanda um tempo maior
Soluo: derivao simultnea de vrios

analitos;
Mtodos de derivao mais rpida:

micro-ondas, off-line e online;

Tempo de separao para HPLC e GC

similar.

 Mtodo de HPLC proposto e GC

Desvantagem GC:
Necessidade da volatilidade dos analito
(limitao do grupo de compostos)
Possibilidade de alterao estrutural pela
instabilidade trmica dos compostos

 Mtodo de HPLC proposto

Possvel

alternativa

til

para

confirmar

ou

estender os estudos realizados na GC.

Complementa

anlise

direta

de

leos

essenciais no derivados por HPLC UV para os

que possuem absortividade molar baixa;
HPLC ESI UV: usada para lcoois alifticos de
baixa sensibilidade;

Uso do anidrido ftlico: melhorias nos limites de

deteco;

Melhores resultados podem ser obtidos com uso

de anidrido difenlico ou outro reagente que
proporcione

maior

determinao fluorimtrica.

absortividade

ou

Concluses
HPLC-UV: determinao da frao alcolica de leos
essenciais (produtos das esterificaes do lcool com
anidrido aromtico);

DryLab software: otimizao das condies de

separao cromatogrfica;

Identificao dos compostos:

HPLC-MS de amostras derivadas e no derivada;
Comparao com o GC-FID e vestgios de GC-MS
das amostras no derivadas.

Concluses
Os analitos derivados proporcionou um aumento
drstico na absoro de UV.
Assim, os limites de determinao obtidos com o
mtodo proposto foram semelhantes aos obtidos por
GC-MS, e claramente melhor do que os obtidos por
GC-FID.
Em seguida, o mtodo proposto constitui uma boa
alternativa
para
caracterizar
e
quantificar
componentes possuindo um grupo lcool em leos
essenciais.