Análises Forenses

Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço.
 Toxicologia Forense
• Definição: Ciência que detecta e identifica a
presença de drogas e venenos em fluídos
corpóreos, tecidos e órgãos.
 Toxicologia Forense
• Funções diversas;

• Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica;

• Várias matrizes para análises;

• Métodos químicos sofisticados (derivação

química, cromatografia, espectrometria de
massa);
 Compostos Voláteis
• Compostos da forma liquida que podem ser
detectadas por técnicas de cromatografia
liquida ou gasosa, quando as matrizes podem
sofrerem métodos de extração apropriados.

• Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro

extração em fase sólida e extração em fase
sólida.
 Substâncias Corrosivas
• Incluem ácidos minerais e bases;

• Vários agentes corrosivos são constituintes

normais dos tecidos;

• Modificações das concentrações químicas no

plasma podem determinar as lesões;
 Metais
• Clássicos procedimentos de separação de
matrizes orgânicas são utilizados para
determinação de metais ( Ex: agentes químicos e
oxidação térmica);

• Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e

ICP-MS);

• Diferentes formas de metais ( Mercúrio,

dimetilmercúrio);
 Componentes orgânicos não voláteis
• Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas,
produtos naturais, poluentes e compostos
industriais;

• Dificuldade de Separação....
A
N
Á
L
I
S
E
S
 Papel da Toxicologia analítica
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA

FÍGADO
CytP450 CytP450
Benzeno fenol hidroquinona
[O] [O]

MEDULA ÓSSEA
Prostaglandina sintetase
Hidroquinona radical fenoxil
(aplasia de medula )
Como determinar?
 O que procurar nestas amostras?
CH3 OH CH3
CH2 CH N
CH2 CH N
CH3 H
CH3 H

metanfetamina efedrina
anfetamina
H
CH2 CH N
CH3 H

CH2CH2CN OH H
CH2 CH N CH CH N
CH3 H CH3 H

femproporex fenilpropanolamina
 ESTERÓIDES ANABÓLICOS
OH OH
ANDROGÊNICOS
OH

HO
H O
O
1-Androstenodiol Boldenona Cl Clostebol
OH H5C2 OH
CH3 OH
C CH

H N
N
H O
O
Estanozolol Gestrinona Nandrolona
OH OH H5C2 OH
CH2CH3

THG
O O O
OH Oxabolona Trembolona
AGENTES ANABÓLICOS
1. Esteróides anabólicos androgênicos

Algumas dos esteróides mais utilizados:

- metandienona (Dianabol),
- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)
- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)
- oxandrolona (Anavar)
- enantato de metenolona (Primobolan)
- estanozolol ( Winstrol)
- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário
Agentes anabólicos
1. Esteróides anabólicos androgênicos

Efeitos tóxicos

-Coletases e tumores no fígado, mais

freqüentemente com o uso de
derivados C-17 alquilados. Carcinomas
hepáticos associados aos E.A. não
produzem metástase e regridem após
a descontinuação do uso.
 O ciclo letal de Andreas Munzer
0-10 semanas antes da competição:
-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol,
hormônio da tireóide.
6-10 semanas antes da competição:
-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)
-1 inj. Parabolan (Trembolona)
- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-30 comp. Metandienona
-20 doses GH
-20 doses insulina
3-5 semanas antes da competição:
-3 inj. Masteron (Drostanolona)
-2 inj. Parabolan(Trembolona)
-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-50 comp. Stromba (Estanozolol)
-2 inj. Stromba
-24 doses GH
-20 doses insulina
OUTROS: EPO, diuréticos
 ESTERÓIDES ANABÓLICOS
ANDROGÊNICOS

Baixas concentrações

DETECÇÃO
URINA
O desafio dos anabolizantes
Conteúdo da seringa

18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona

4,9,11- trieno-3-one
 Designer steroids

Esteróides de desenho
Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al.

i) Novo esteróide, nova “entidade química”.

ii) Sem registro de CAS.

iii) Nunca antes usado em humanos ou animais.

iv) Nunca testado em screening farmacológico.

v) Propósito único – burlar o exame de dopagem.

vi) “O” esteróide de desenho.

O desafio dos anabolizantes
Caracterização do THG
“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”.

• MDMA: Ecstasy, pílula do amor.

• GHB: “Ecstasy líquido”.
• Cetamina: Special K, Kit kat.
• Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB.
• LSD (Ácido, doce, ponto).
• Fenciclidina: PCP.
• Nitritos (Poppers).
 Utilizadas em assaltos e estupros.
Efeitos: Incapacidade de reação e
amnésia retrógrada.

R
Flunitrazepam (FNZ)
o FNZ ilícito GHB
h
y
p
n
o
l
WWW.DEA.GOV
 GHB
Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).
 GHB
Definição:

• Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL.

• Natural em SNC de mamíferos.
• Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.
• Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e
estupros).
• Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.
• Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol .
• Uso crescente por todo o país.
• Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento
para narcolepsia.
• Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol
(solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).
 GHB
Mecanismo de ação:

Receptores só no SNC, principalmente hipocampo.

• Liga-se fracamente em receptor GABA b.

• Depressor do SNC.

• Provoca liberação de opióides endógenos.

 GHB
• Farmacocinética:
• Início de ação: 15-30 min e pico plasmático
em 25-45 min.
• Metabolizado em CO2 .

• GBL é convertido à GHB por via não enzimática.

• 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool
desidrogenase.
• Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a
uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase,
retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim,
pode haver uma depressão inicial do nível de consciência
seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado
e logo em seguida evolução para coma com a
disponibilização da álcool desidrogenase.
 DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-
bromoamfetamina

www.baladacerta.com.br surforeggae.ig.com.br
 DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-
bromoamfetamina
Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo (
responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o
tempo de ação).
Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967.
Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca
de 1 a 1,5 mg da substância.
 CH3
N Éster metil ecgonina
O
C O CH (15-35%)
3

OH
CH3
N
N
H Norcocaína N
CH3
O
C O CH
3 O (2-6%) O
C O CH C
O 3 OH
O C
O
O C OH

Cocaína
Ecgonina
(3%) N
CH3
(1-8%)
O
C OH

O Benzoilecgonina
O C
(15-50%)
Amostras
 PRAGUICIDAS

• a) Derivados do ácido fosfórico.

• b) Derivados do ácido tiofosfórico.
• c) Derivados do ácido ditiofosfórico.
• d) Derivados do ácido fosfônico.
Derivados do ácido fosfórico.

Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.

 Derivados do ácido Tiofosfórico.

Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico

Derivados do ácido Ditiofosfórico.

Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon
Derivados do ácido Fosfônico.

Ex:Triclorfon
 Oral, respiratória e dérmica.

Biotransformação
Oxidação

Ligação ao sitio enzimático

x
Ácido Carbâmico

Aldicarb,Carbaril,Carbofuran
 INSETICIDAS ORGANOCLORADOS

São compostos de estruturas cíclicas, bastante

lipofílicos e altamente resistentes aos
mecanismos de decomposição do
ambiente.Os principais organoclorados com
atividade inseticida são:

• a) Hexaclodienos e análogos.
• b) DDT e análogos.
• c) Ciclodienos.
• d) Dodecacloro e clordecone.
 DDT

2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO

DDT
 CICLODIENOS

Aldrin Dieldrin
PIRETRÓIDES
 TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS EM ANÁLISES
TOXICOLÓGICAS

-A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de

operações unitárias necessárias para que determinada substância
(analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.
 Típicas operações em preparação de
amostras:

1) Liberação dos analitos da amostra

2) Remoção de interferentes endógenos
3) Técnicas de extração
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
1) Liberação dos analitos da matriz

-Como se encontra o analito na matriz?

-conjugado/livre
-matriz?
 BIOTRANSFORMAÇÃO
Maconha - 9THC
Ácido 11-nor-
CH3 O delta-9-THC-
C OH COOH
OH
OH

CH3
O C5H11 CH3
CH3 O C5H11
CH3
Delta-9-
Tetraidrocanabinol O
(THC) C O ácido glicurônico

OH

Ácido 11-nor- delta -9

CH3 -THC-COOH
O C5H11 conjugado
CH3
 SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS

-Hidrólise
-Alcalina
-Ácida
-Enzimática
 HIDRÓLISE ALCALINA
-Exemplo
O
O
C O ácido glicurônico
C OH
OH
60°C OH

NaOH
CH3
CH3
O C5H11
CH3 O C5H11
CH3

Ácido 11-nor- delta -9

Ácido 11-nor-
-THC-COOH
delta-9-THC-
conjugado
COOH
 HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
-Vantagens:
-processo mais rápido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradação de analitos não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
 HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
Benzodiazepínicos
CH3
CH3 O
N H
N
HCl
O
Cl N 100°C Cl
15 min.

Diazepam Benzofenona
 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

Beta glucuronidase
Esteróides 55°C Esteróides
Anabólicos Anabólicos
conjugados 1 hora
livres
 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
-Vantagens:
-não degrada os analitos
- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reação
-controle mais rigoroso das condições
-enzimas podem ser inibidas por substâncias
presentes nas amostras
-aconselhável o uso de controle
 OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo

-Matriz complexa
-como retirar os analitos do cabelo?
-digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C
durante 20 minutos)
substâncias estáveis (THC, anfetaminas)
 OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo

-E para substâncias não estáveis?

P.ex. cocaína

CH3
-Incubação em solução
N
ácida ou metanol durante
O 18 horas a 50°C
C O CH
3

O
O C
 2) Remoção de interferentes
endógenos

Uma matriz biológica consiste de

muitos componentes, como proteínas,
lipídios, carboidratos que podem interferir
na análise.
 2) Remoção de interferentes
endógenos

A) Precipitação de proteínas:
A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas
vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou
plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem
precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de
HPLC.
Métodos de precipitação:
a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido
perclórico)
-formam sais insolúveis com a forma catiônica
das proteínas em meio ácido

b) com solventes orgânicos

-solventes que são miscíveis em água como acetona,
metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a
solubilidade de proteínas.
Métodos de precipitação:
c) com sais metálicos: proteínas também podem ser
removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou
cobre em condições alcalinas.
-não : analitos que complexam com metais.

b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um

precipitante relativamente ineficiente: < 75% das
proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol.
Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser
possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.
Precipitação de pigmentos e sais biliares
Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos
“backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A
remoção desses compostos com extensos esquemas de extração
podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode
ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.
 3) Técnicas de extração

-Extração líquido-líquido (LLE)

-Extração em fase sólida (SPE)
-Extração por head space (HS)
-Micro extração em fase sólida (SPME)
 EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)

Solvente
orgânico
urina
Drogas/
urina
metabólitos

Agitação

Centrifugação Separação da fase

orgânica extrato
 EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-
COOH
O
C OH

OH Forma
O
C OH H+ não-
ionizada
CH3
O C5H11
OH CH3

O
CH3 C O
O C5H11
CH3 OH
Forma
ácido 11-nor-delta -
OH- CH3
ionizada
9-THC-COOH O C5H11
CH3
 EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas

H H
+
CH2 CH N
H+ CH3
H
H Forma ionizada
CH2 CH N
CH3 H
H
Anfetamina CH2 CH N
OH- H
CH3
Forma não-ionizada
 EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
= molécula de água
EFEITO “SALTING OUT”

H
CH2 CH N
CH3 H
+ NaCl (cloreto de sódio)

H
CH2 CH N
Na+ Cl- CH3 H
EXTRAÇÃO
(fase sólida)
2,5mL Amostra 3mL água +3mL 2mL
2mL Metanol +
+ 2,5mL água + HCl (0,1M), diclorometano/
2mL tampão PI + 2mL secagem (5min) isopropanol /
fosfato tampão fosfato + 9mL metanol NH3 (80:20:2)

BE
PI
Interf.
COC

1 2 3 4
 Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)

C8
Octil Si

PH
Fenil Si

CH Si
Ciclo
hexil
 Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)

CN Si C N
Cianopropil
H O

NH2 H
Si NH
Aminopropil
H O

2OH
Si O O H
Diol
OH H NH
 Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)

O
CBA C
Si O- +
Ácido NH3 R
carboxílico

SCX
Si
Ácido
benzenosulfônico SO3- +
NH3

SAX
Trimetil Si N+(CH3)3 -
SO3 R
aminopropil
 EXTRAÇÃO

H + CH3
N
Forma

CH3
H+ O
C OH
ionizada
N
O
O O C
C OH
O
O C

CH3
N
Benzoilecgonina
O
-
-metabólito da C O
cocaína OH- O C
O Forma
ionizada
EXTRAÇÃO
(fase sólida)

H + CH3
SO3- N

O
C OH
O
O C
 EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS

Amostra (urina, seringa

sangue ou saliva)
+ sulfato de sódio
ESTUFA 70°C
30 min GC
+ PI
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

1 2 3 4 5 6
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz
(amostra)
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Fibras comercialmente disponíveis:

Fase estacionária e Abreviação Aplicação geral

espessura do filme
Polidimetilsiloxano PDMS Compostos não-
(100um) polares, voláteis
Polidimetilsiloxano PDMS Não-polares,
(30um) voláteis e semi-
voláteis
Polidimetilsiloxano PDMS Não-polares, semi
(7um) e não voláteis
Polidimetilsiloxano- PDMS-DVB Polar
divinilbenzeno (65um)
Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral,
voláteis
Carboxeno- CAR-PDMS Voláteis
polidimetilsiloxano
(75um, 85um)
Carbowax- CW-DVB Polar, voláteis
divinilbenzeno (65um,
75um)
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:

-Dimensões da fibra (comprimento, espessura);

-Tipo de fibra;
-Temperatura de extração;
-Efeito da matriz (presença de sal, pH);
-Velocidade de agitação;
-Tempo de extração.
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do tempo de extração:
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da temperatura de extração:
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da concentração de sal:
 MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do pH:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Vantagens da SPME sobre a SPE e

extração líquido-líquido:

-simplicidade
-prático
-rápido
-extração sem utilização de solventes
-pode ser automatizado.
 4) Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
 -Derivação
Ex. opiáceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condições
cromatográficas (GC)
N.CH3
N.CH3
H BSTFA
H
H 70°C 20 H
min
CH3 CH3
CH3 Si O O O Si CH3
HO O OH
CH3 CH3
-Derivação
Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade
para detectores ECD

CH3 CH3
N PFP/PFPA N

O
O 70°C 20 C O CH2CF2CF3
C O H
min O
O O C
O C
 MATRIZES BIOLÓGICAS
• URINA
• SANGUE
• AR EXALADO

MATRIZES ALTERNATIVAS:
• SALIVA
• CABELO
• MECÔNIO
• UNHA
• SUOR
 URINA
Néfron
 URINA
CARACTERÍSTICAS:

• Coleta não invasiva

• Disponibilidade de grandes volumes de
amostra
• Concentração alta
• Facilidade da análise (baixo custo)
• Possibilidade de adulteração da amostra
• Período de detecção: alguns dias
• Detecção de uso eventual
 SANGUE
CARACTERÍSTICAS:

• Coleta invasiva
• Necessidade de profissional treinado
• Matriz relativamente complexa
• Período de detecção: algumas horas
• Correlação com estado clínico
• Maior dificuldade de adulteração
SALIVA
 SALIVA
CARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva
• Facilidade na coleta
• Coleta sob vigilância e em campo aberto
• Correlação com concentração sangüínea
• Período de detecção: algumas horas
• Pouco volume de amostra
• Concentração baixa
 CABELO
CARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva
• Período de detecção: meses
– Retrospectiva e cronológica
• Detecção: uso intenso
• Disponibilidade: ????
• Adulteração: difícil
• Possibilidade de contaminação
• Baixa concentração
• Matriz complexa -dificuldade na análise
 CABELO

1 cm
2 cm
3 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
8 cm
9 cm
10 cm
 MECÔNIO

CARACTERÍSTICAS:
•Exposição fetal
•Coleta não-invasiva
•Matriz complexa -dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Disponibilidade
•Possibilidade de contaminação
UNHA
UNHA

CARACTERÍSTICAS:
•Coleta não-invasiva
•Baixa concentração
•Dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Uso intenso
•Disponibilidade????
•Adulteração: difícil
•Possibilidade de contaminação
 SUOR

CARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva
• Coleta através de adesivos “patch”
• Baixa concentração
• Dificuldade na análise
• Não existem muitos estudos
• Monitorar pacientes em tratamento
 Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
 -Derivação
Ex. opiáceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condições
cromatográficas (GC)
N.CH3
N.CH3
H BSTFA
H
H 70°C 20 H
min
CH3 CH3
CH3 Si O O O Si CH3
HO O OH
CH3 CH3
-Derivação
Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade
para detectores ECD

CH3 CH3
N PFP/PFPA N

O
O 70°C 20 C O CH2CF2CF3
C O H
min O
O O C
O C
Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a

estrutura química das moléculas

D
E
R
I
V
A
Ç
Ã
O