Como Purificar Proteínas?

Marcius S. Almeida; Eleonora Kurtenbach;

Introdução
 Importância da Purificação

 Estudo da atividade de uma enzima frente a

substâncias passíveis de serem usadas em
terapêutica;
 Uso direto como medicamento (tratamento de
doenças decorrentes da modificação da
estrutura e/ou atividade de proteínas);
 Proteoma, análise e caracterização das
proteínas expressas em uma situação;
 Análise da estrutura tridimensional para inferir
sua atividade através de análise de homologia
estrutural;
 Processos de purificação

 O que é: distinção das proteínas com base na

seqüência de aminoácidos, no conteúdo de
carboidratos e lipídios, estrutura tridimensional,
e atividade biológica;

 Mais utilizados:
o Cromatografia em coluna de gel;
o Filtração;
o Adsorção;
 Processos de purificação

 Problema: mudança na estrutura das proteínas

por ser imprevisível o seu comportamento no
decorrer do processo;

 Desafios hoje:
o Encontrar melhores estratégias;
o Adequação da metodologia;
o Custo, velocidade e pureza;
Considerações Iniciais
 Considerações Iniciais
 Proteínas são macromoléculas frágeis e sofrem
alterações físico-quimicas facilmente que levam
a modificação ou perda de sua atividade;

 Exemplos:
o Temperatura  adequar o ambiente;
o Oxidação  adicionar agentes redutores (β-
mercaptoetanol) ou evitar a formação de
bolhas;
o Soluções muito diluídas ou concentradas;
 Requerimento Inicial

 Consiste na liberação dessa proteína de sua

fonte natural  EXTRATO BRUTO;

 Obtenção do Extrato Bruto:

o Trituração dos tecidos;
o Lise das bactérias, das leveduras ou das
células animais provenientes da cultura;
 Requerimento Inicial

 Processos de Lise Celular:

o Sonicação;
o Variações repentinas de pressão;
o Osmolaridade;
o Forte agitação na presença de esferas de
vidro ou por enzimas citolíticas;
 Requerimento Inicial

 A proteína desejada pode estar restrita a uma

organela em particular;

 Purificação substancial dessa proteína:

o Isolamento dessas estruturas celulares;
o Centrifugação diferencial em gradiente de
sacarose;

 A liberação das proteínas pode ser facilitado

pelo uso de detergentes não iônicos;
 Requerimento Inicial

 Pode ocorrer acidentalmente a degradação

química ou enzimática da proteína de interesse;

 Como evitar:
o São incluídos diversos aditivos:
• Agentes redutores  β-mercaptoetanol;
• Estabilizantes  glicerol;
• Inibidores de proteases  EDTA;
 Requerimento Inicial

 Em alguns casos, esse passo inicial não é

necessário;
o Exemplo:
• Proteínas recombinantes  levedura Pichia
pastoris;
• São secretadas para o meio de cultura;
 Clarificação da Amostra

 Representa um grande problema;

o Técnicas utilizadas são centrifugação e
filtração;

 Exemplos de transtornos:
o Obtenção de uma solução ainda particulada;
o Entupimento das membranas de filtração;
o Manipulação de um grande volume num tempo
excessivamente longo;
o Custo elevado;
 Clarificação da Amostra

 Solução: Resinas Cromatográficas:

o Permitem a adsorção de amostras contendo

materiais particulados e/ou células;

o Sistema de Leito Expandido;

 Sistema de Leito Expandido

1. Equilibrar a fase estacionária na forma

expandida, com o tampão de equilíbrio;
2. Aplicar a amostra de células, no sentido de
baixo para cima, no leito estabilizado;
3. Lavar a resina de baixo para cima, com o
tampão de lavagem;
4. Eluir a proteína de interesse invertendo-se o
fluxo pela coluna, com o leito sedimentado;
5. A coluna é limpa e regenerada para um novo
uso;
Métodos de Purificação
 A Escolha dos Métodos de
Purificação

 Planejamento de estratégias;

 Esquema ideal de purificação de proteínas não

depende apenas das características da proteína
de interesse;
 Escolha do Procedimento

 A escolha do Procedimento deve considerar

vários aspectos:
o Estabilidade da proteína;
o Aplicação final do produto;
o Escala de manufatura necessária;
o Eficiência do processo;
o Viabilidade econômica;
o Existência de facilidades;
o Adequações à farmacopéia;
 Processo de purificação

 Linha geral de se seguir  divisão em 3 fases;

 Fase I:
o Baixo poder de resolução;
o Duas vantagens:
• Aumentar a concentração da proteína na
amostra;
• Preparar amostra para cromatografia;
o Utiliza-se: diálise, precipitação ou
precipitação fracionada;
 Processo de purificação

 Fase II:
o Fase mais eficiente;
o Explora as características físico-químicas da
proteína de interesse;
o Compreende o uso de diferentes técnicas de
cromatografia;
 Cromatografia

 É a passagem de uma mistura através de duas

fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A
grande variabilidade de combinações entre a
fase móvel e estacionária faz com que a
cromatografia tenha uma série de técnicas
diferenciadas.
 Cromatografia
 Cromatografia de troca iônica:
o Fase estacionária é altamente carregada
(sinal contrário da fase móvel);
o Separação pela afinidade iônica;
 Cromatografia de fase reversa:
o Fase estacionária  grupamentos
hidrofóbicos (hidrocarbonetos);
o Separação pela interação com a fase móvel;
 Cromatografia de afinidade:
o Fase estacionária  ligantes específicos;
o Separação pela ligação específicas;
 Processo de Purificação

 Fase III: Fase Final;

o Retira contaminantes:
• Liofilização;
• Diálise;
• Ultracentrifugação;

o Psd1 e Psd2 -> defensinas liofilizadas -

acetonitrila e ác. Trifluoracético
 Deve-se considerar

 Técnicas:
o Diferentes propriedades físico-químicas das
proteínas;
 Atividade:
o Método + simples e sensível;
 Quantidade:
o Absorção de luz (faixa UV);
o Azul de Coomassie;
o Sulfato de cobre II;
 Deve-se considerar

 Purificação:
o Pode ser acompanhada usando-se Ac.
Específicos;
o Dot Blotting e Western Blotting;

 Aumentar a seletividade e resolução no decorrer

do processo;

 Manter o processo simples;

Quantificação da Pureza
 Quantificação da pureza

 Sequênciamento peptídico automático;

 Espectrometria de massa;

 Ressonância magnética nuclear de alta

resolução;
 Procedimento mais comum

 Eletroforese - Impregnação de prata:

o Separação por peso molecular

 Eletroforese Bidimensional:
o Peso molecular e ponto isoelétrico

 Cromatografia em coluna:
o Ótima confiabilidade
 Conclusão

 Não existe um protocolo definido para

purificação de proteínas;

 É preciso desenvolver um protocolo específico –

diversos métodos;
Obrigada!!!
 Obrigada!!!

Hesther Bousquet; Maína Terra; Mayara Martins; Nígela Rodrigues

Biomedicina – 6º Período