PPG EM BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO

Disciplina: BIOLOGIA MOLECULAR 2016.1

Professores: Rafael Rosa e Yara Muniz

Expressão Heteróloga
de Proteínas

Mestrandos Fernanda & Tiago F. Chaves

 INTRODUÇÃO

Expressão Heteróloga De Proteína

?
 INTRODUÇÃO

Expressão Heteróloga De Proteína

(hétero+logo) Que consiste em elementos diferentes

 INTRODUÇÃO

Expressão Heteróloga De Proteína

Indução experimental de uma proteínas recombinante

inseridas para se expressar em uma célula (Hospedeiro)
que normalmente não expressa está especifica proteína.
 INTRODUÇÃO

Expressão Heteróloga De Proteína

Indução experimental de uma proteínas recombinante

inseridas para se expressar em uma célula (Hospedeiro)
que normalmente não expressa está especifica proteína.

Proteínas recombinante

São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados.

Atravez da técnica de DNA recombinante
 INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína

Importante na compreensão dos estudos funcionais das

mesmas.
Utilização de microrganismos geneticamente modificados
(OGMs), capazes de sintetizar proteínas em grande quantidade
Processo economicamente vantajoso de produção em
relação aos processos clássicos.
sistemas de expressão: procariotos e eucariotos.
 Histórico

Herbert Boyer e Stanley N. Cohen- tecnologia

de DNA recombinante. Plasmídeo pSC 101

Hebert Boyer desenvolve a INSULINA

humana recombinante
1977 1977

1973 1978

Itakura Keiichi e colaboradores 1º proteína

recombinante - SOMATOSTATINA
Insulina foi aprovada (FDA) para
utilização comercial desenvolvido pela
Empresa de Boyer, a Genentech.
 PROTEÍNAS

essenciais na estrutura, na função, e no

regulamento das células

responsáveis pela homeostasia celular

 inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica,

biotecnológicas e prevenção (vacinas)
Relembrando

Clonagem gênica: isolamento, amplificação e purificação de

um gene (s), a partir do material genético de um organismo.

Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos

de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em
uma célula hospedeira adequada.

Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento

rápido e constituição genética bem conhecida.
 Proteína de
Hospedeiro
Interesse

Escolher o
Processo: vetor

Preparar o Preparar o
vetor Inserto

Clonar o Inserto
no Vetor Purificação
Transformação em
célula
de expressão Cultura de
células
Extração
Indução
 Proteína a ser Expressada
Características:
Origem
Procariota X Eucariota ?
Propriedades

Sequência nucleotídica
Propriedades químicas (Tamanho, pI, modificações pós-
traducional)
Estabilidade (pH, temperatura)
Toxicidade
Destino (intra/extracelular)
 Hospedeiros

 PROCARIOTO
Bactérias (E. coli)

 EUCARIOTO
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris)
Baculovírus/células de inseto (Drosophila melanogaster)
Cultura de células de mamíferos (Células COS e CHO)
Células de plantas (Cloroplastos e protoplastos)
 Expressão heteróloga de
proteínas em procarioto
Bactérias (E. coli)
Vantagens
Bem caracterizada geneticamente
Diversidade de vetores de clonagem
Controle da expressão genica facilitado
Crescimento rapido
Secreção do produto no meio de cultura

Desvantagens
 Não realiza modificações pós-traducionais (glicosilações, ligações
dissulfeto e enovelamento incorreto)
 Produção de proteases
 Baixo nível de expressão
 Expressão heteróloga de
proteínas em eucariotos
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Pichia
pastoris)
Vantagens
Expressão rápida e de baixo custo
Genoma pequeno e de simples análise (cerca de 200X menor do
que dos mamíferos)
Permitem modificações de enovelamento de proteínas e algumas
pós-traduções

Desvantagens
 Estruturas de glicanos N-ligados diferenets das proteínas de
mamíferos.
 Necessitam de peptídios sinais para proteinas da via segretora.
 Expressão heteróloga de
proteínas em eucariotos
Baculovírus/células de inseto
(Drosophila melanogaster)
Vantagens

Desvantagens
 Expressão heteróloga de
proteínas em eucariotos

Vantagens
Cultura de células de mamíferos
(Células
Desvantagens COS e CHO)
VETOR
Promotores

 Principais promotores:
Lac = semelhante ao da E.coli (reprimido pela lacl na ausência de
indutor – lactose ou IPTG
Tac – região operadora (onde a RNApolimerase se liga)e a
promotora (onde o repressor se liga)
T7 – utiliza a RNApolimerase do fago T7 = indução indireta
aumento de expressão da proteína T7 RNA polimerase que se liga
ao promotor do DNA plasmidial = aumento de expressão

 Promotor metalotioneína liga-se zinco = 10x mais


Expressão
 Plasmideos introduzidos em células (E. coli)
 Células plaqueadas em meio semi-sólido (37ºC ) por 12 a 14hrs
 Células submetidas a antibióticos que as células que não
produzem proteínas recombinantes sejam sensíveis
 Colônias inoculadas em meio rico com indutor (lactose ou
IPTG)mais 5-6 horas de cultivo
 Coletas das bactérias por centrifugação
 Eletroforese de uma amostra de bactérias induzidas (PM maior)
 Códons não utilizados pela E.coli podem ser substituídos por
códons sinônimos mais utilizados (Códon adaptation index –
CAI)Códons ideais são comercializados
ANÁLISE DE PROTEÍNAS

 •Eletroforese;
 •Focalização Isoelétrica;
 •Eletroforese Bidimensional(2D).
Eletroforese de proteínas
Separação com base na migração de proteínas carregadas em um
campo elétrico.
Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
Submete-se as proteínas ao SDS que desdobra a proteína = Aumento
de negatividade
Eletroforese de Proteínas

Vantagens :
 Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas.
 Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes
em uma amostra ou o grau de pureza.
 Permite determinação do ponto isoelétrico e massa molecular
aproximada.

Desvantagem:
 Não é utilizado para purificar grandes quantidades de proteínas
porque afetam sua estrutura e a função.
Focalização isoelétrica

 •Processo utilizado para a determinação do ponto isoelétrico (pI)

de uma proteína.
 Em gel com gradiente de pH, uma mistura de proteínas é aplicada
e migram até que o pH coincida com o pI
 Eletroforese Bidimensional
 Combinação da
Focalização isoelétrica e
da Eletroforese de
proteínas
 Em um primeiro gel com
diferença de pH é
determinado o ponto
isoelétrico
 Depois a coluna já
separada por pI é
horizontalmente
submetida ao gel
poliacrilamida SDS
Bibliografia

Santos A K, Resende R R . PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES HUMANAS: Boa, Barata E Em Larga
Escala. Edição Vol. 2, N. 08, 24 de Fevereiro de 2015.
DOI:http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2015.02.24.006