Exigências nutricionais e meio de

cultura em microorganismos
Prof. Dra. Adriana Dantas
UERGS, Bento Gonçalves, RS
 Nutrição e crescimento

Nutrição microbiana
Componentes necessários às células
Meios de cultura
Condições ambientais

Crescimento populacional
Velocidade de crescimento
Tempo de geração
Medidas do crescimento
Proliferação de Microrganismos
 As bactérias são microrganismos unicelulares com uma
estrutura muito simples, o que lhes permite replicarem-se
muito rapidamente caso encontrem nutrientes,
temperatura, pH, humidade e concentração de oxigénio
favoráveis.
 Alguns casos, apenas 20 minutos são suficientes para que
o número de bactérias duplique, o que significa que um
número inicial de 10 bactérias num determinado local em
condições favoráveis, se multiplicará de tal modo que se
terão aproximadamente 16000000 bactérias ao fim de 8
horas.
Proliferação exponencial
 Esta proliferação
exponencial aliada à sua
resistência faz com que as
bactérias se espalhem
muito rapidamente,
estando presentes em
todos os locais, não só à
nosso volta, no meio
ambiente, como também
no nosso próprio corpo:
nas nossas mãos, nariz,
boca, tracto
gastrointestinal, etc.
Artificial x Natural
Meios de cultura

 Até cerca de 1880, os microrganismos eram cultivados em

meios líquidos
 Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios de
cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies
isoladas (culturas puras), separando-as de espécies
contaminantes.

Meios de cultura consistem da

associação qualitativa e
quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes
necessários ao desenvolvimento
(cultivo) de microrganismos fora
do seu meio natural.
Condições favoráveis de crescimento
 Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos
microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura
para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.

Além dos nutrientes é preciso fornecer

condições ambientais favoráveis ao
desenvolvimento dos microrganismos,
tais como pH, pressão osmótica,
humidade, temperatura, atmosfera
(aeróbia, micro aeróbia ou anaeróbia),
entre outras...
Consistência dos meios
 Sólidos, quando contêm agentes solidificantes, principalmente
ágar (cerca de 1 a 2,0 %);
 Semi-sólidos, quando a quantidade de ágar ou gelatina é de
0,075 a 0,5 %, obtendo assim uma consistência intermediária,
de modo a permitir o crescimento de microrganismos em
tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade;
 Líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um
caldo, utilizados para activação das culturas, repiques de
microrganismos, provas bioquímicas, entre outros.
Procedência dos constituintes
 Podem ser naturais ou complexos:
 Ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais
(malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, cérebro,
fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura);
 Artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos:
 Composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e os seus
componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em
fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando são
conhecidas as necessidades nutricionais específicas.
 Meios de cultura básicos
 São os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma
exigência em especial;
 Meios de cultura complexos:
 Cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de
infusão de cérebro e coração, ágar sumo de tomate, ágar sangue, etc.
Funções dos meios de cultura
 Meios de pré-enriquecimento:
 Permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que
sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada.
 Meios de enriquecimento:
 Proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes
usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos
exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de
determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o
crescimento de outros.
 Meios Diferenciais:
 Contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito
parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para
coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue,
agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
 Funções dos meios de cultura
 Seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. A
maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colónias (sólidos) dos
microrganismos.
 Meios de triagem são os meios que avaliam determinadas actividades metabólicas
permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos
microrganismos.
 Identificação, prestam-se para a realização de provas bioquímicas e verificação de
funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação.
 Dosagem, são empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos
 Contagem, são empregados para a determinação quantitativa da população microbiana.
Estocagem ou manutenção são utilizados para conservação de microrganismos no
laboratório, i.e., garantem a viabilidade de microrganismos.
Meios de proliferação naturais

 No nosso dia-a-dia convivemos com bactérias, dormimos

com bactérias, comemos bactérias, e não conseguimos
viver sem elas.

 Elas estão por todo o lado e reproduzem-se em todo o

lado, apenas querem um local com condições propícias.

 Por isso, há que ter muito cuidado nas nossas casas, pois
apresentam-se como os melhores locais para a
proliferação das bactérias, tendo em conta que nelas
podem encontrar alimento, calor, humidade.
Nutrição de microrganismos

 Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados.

 Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas, enquanto outros
são tão exigentes quanto o homem.

 Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório:
- Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais.
- Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são
desconhecidas.
Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase) precisa de
hospedeiro para ser cultivado.
 Meios de cultura adequados

 Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de

cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.

 Os elementos químicos principais para o crescimento das células

são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).

 O carbono é um dos elementos mais importantes para o

crescimento microbiano.

 Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que

contém carbono
Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade.

- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.

Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas.

- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

P, S, K, Na ...

célula
Matéria seca
Água
Componentes necessários a célula
 Fonte de carbono:
- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
carboidratos
lipídeos
proteínas

- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos):

É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos
inorgânicos.

 Fonte de Nitrogênio:
- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

A capacidade de algumas
moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) bactérias em utilizar o
moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2) nitrogênio atmosférico (FBN) é
de fundamental importância
para a vida de todos os seres.
 Hidrogênio:
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e gases)

 Função:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas
Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração

• Oxigênio:
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos,
glicerídeos)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
Outros macronutrientes:

 P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP

 S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas
 K – Atividade de enzimas
 Mg – Estabilidade dos ribossomos
 Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
 Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.
Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.
 Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
 Outros componentes
 Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de um meio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)

- Nem sempre sua adição é necessária
- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
pura podem apresentar deficiências desses elementos.

Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte

o N2 para NH3 durante a FBN.
 Água e aditivos
 Água:

- Componente absolutamente indispensável

(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.

Aditivos:
Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar
inibição, estabilizar o pH:

 Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos

EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.
 Inibidores
Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
Outros aditivos
 Tampões
- Carbonato de cálcio
- Fosfatos
- Proteínas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulase

pectina induz a pectinase
amido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma

 Remoção de células, perda do produto, contaminação
 Redução do volume do meio

álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
Meios de cultura
Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Não existe um meio de cultura universal, mas

Existem vários tipos meios para diversas finalidades

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o

conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os
nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)

Classes
Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro,
leite, solo e rúmem de bovino)
Meios de cultura
 Meios quimicamente definidos são utilizados para
determinar as necessidades nutricionais

Até 1880 os microrganismos eram

cultivados em meios líquidos.
Robert Koch introduziu os meios
de cultura sólidos, os quais
permitiram o estudo de espécies
isoladas (culturas puras).

Meio de
cultura
solidificad
o com 1,5
% de ágar. Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos
sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
Meios de cultura
 Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de
formulações para inúmeras finalidades.

Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies

Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.

Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey

Microplacas com diferentes
meios de cultura para
identificação de
enterobactérias.
 Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue,
então o sangue é adicionado no meio de cultura.
As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas.

Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
Meios de cultura para fungos

• Todos os fungos são heterotróficos

Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos
pela peptona e extratos de carne ou soja.

Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os
meios para bactérias.

Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.

 Como determinar a composição inicial?
Passo 1: utilizar dados da composição elementar
Composição elementar média (% do peso seco)
Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários
de 1,3 g (13%) de N
ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)
Elemento Bactéria Fungo

Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem Carbono 52 51

introduzir o excesso de um deles. hidrogênio 7 7

Nitrogênio 13 8,5
Com relação ao carbono considerar também fração para
Fósforo 2,5 0,4-4,5
energia e manutenção (heterotróficos)
Enxofre 0,6 0,1-0,5
Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de Potássio 2,5 0,2-2,5
glicose (40% de C) Sódio 0,75 0,02-0,5

Fração para energia e manutenção (45%): Cálcio 0,55 0,1-1,4

YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -
Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1
Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

e assim por diante. Relação C:N:P:S 85:23:4:1

Passo 2: otimização
Condições ambientais (fatores abióticos)

 Temperatura
 Oxigênio
 pH
 Pressão osmótica, atmosférica,
hidrostática
 Radiação eletromagnética
 Temperatura
Grupos

1. Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de 15

o
C, suscetíveis de crescer a 0 oC.

2. Mesófilos – temperatura ótima 20o - 40 oC,

maioria dos patógenos humanos.

3. Termófilos – temperatura ótima acima de 45 oC.

 Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso
Durante as reações de com indicador
redução do O2 são formados redox:
vários intermediários Rosa quando oxidado
Incolor quando reduzido
tóxicos.
Ex: H2O2, OH°, O2-
Os microrganismos aeróbios
e facultativos utilizam
enzimas como a catalase
para destruir as formas
tóxicas
Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio
aerotolerante
Sistema para cultivo de anaeróbios
Sistema para cultivo de aeróbios
Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
 pH
 Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-se no valor
médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,
 Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto em todas
as condições de pH.
 Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os
metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.
 Necessário a adição de um tampão ao meio.
Pressão osmótica

 Não devem existir grandes diferenças na

concentração de solutos dentro e fora da célula,
pois podem desidratar-se ou romper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais

mais elevados.