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reao e a apresentao dos resultados de forma mais precisa e rpida, pois no mais requer a deteco em gel de eletroforese.
(sondas); Amplificao pode ser monitorada em tempo real; Ciclos mais rpidos; Deteco de alterao menor que 2x; Maior extenso dinmica (de at 1010 x); Requer 1000x menos DNA que demais ensaios; Confirmao da amplificao especfica; MAIS ESPECFICO, SENSVEL e REPRODUZVEL; No muito mais caro que a PCR convencional; (exceo: preo do equipamento);
nuclicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reao.
O ponto que detecta o ciclo na qual a reao atinge o limiar
Exponencial: Dobro do produto acumulado em cada ciclo (eficincia da reao ~100%). Reao especfica e precisa; Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reao); Plat: Deteco por gel para os mtodos tradicionais. Produtos no so mais produzidos e comeam ser degradados;
Procedimento
Faz-se um mix em um nico epeendorf, contendo: Primers (sense e anti-sense); Agua mili Q; Compostos fluorescentes;
Equipamentos
Sistema ptico; Termociclador; Hardware Software
Fluorforos
So molculas que absorvem e emitem luz em um
a excitao da luz emitida pelo sistema tico do termociclador. Durante a PCR, as molculas do SYBR Green vo se ligando ao DNA recm sintetizado Um aumento da fluorescncia observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contnuo da reao.
SYBR Green
No ligado emite pouca luz; Subtrada durante a anlise; Reconhecimento dos iniciadores; Polimerizao da enzima taq DNA polimerase; Desnaturao/ diminuio da fluorescncia; Extenso de cada ciclo/ aumento da fluorescncia;
Sistemas de deteco
um sinal fluorescente;
gerando
TaqMan
uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para
extremidade um quencher(molcula que aceita energia do fluorforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor).
TaqMan
1.Polimerizao
4.Polimerizao finalizada
Fluorforo Quencher
1) Linha basal: no houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescncia; 2) Fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo; 3) Fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
Molecular beacons
So oligonucleotdeos
usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundria entre as extremidades 5 e 3 chamada de haste-e-loop.
seqncia- alvo e a haste formada pelo anelamento das seqncias complementares que so localizadas nas extremidades.
No emitem fluorescncia quando esto livres em soluo.
Molecular beacons
A
B
(A) Oligonucleotdeo usado como sonda sintetizado de modo a possibilitar a formao de uma estrutura secundria nas extremidades 5e 3; (B) Toda fita nova formada durante a amplificao alvo para o anelamento do molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescncia.
Referncias Bibliogrficas
NOVAIS, Monteiro Caroline; ALVES, Pires Melissa; Silva, Freitas Fbio. PCR
em Tempo Real: Uma Inovao Tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Brasileira de Cincia e Desenvolvimento. Ed. 33 Jul/Dez 2004. Disponvel em: http//:http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/pcr.pdf Acesso em: 25 Mar 2011.
CARVALHO, Francisco Robson. PCR em Tempo Real. UNESP: Departamento
de Morfologia.