Workshop: Avanos na Engenharia de Protenas e Peptdeos 13h s 17h

* Estratgias e aplicaes da Espectrometria de Massas

Dra. Lucilene Delazari dos Santos UNESP, Campus Rio Claro, SP. ldsantos@rc.unesp.br

Histria da Espectrometria de Massas

1886- Descoberta do on- Goldstein

1910- Primeiro Espectro de Massas JJ Thomson- Ne

1918- Primeiro Espectrmetro de Massas- Dempster

1960- MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prmio Nobel)

O que Espectrometria de Massas? Uma poderosa tcnica analtica:

Medir massa molecular de compostos Identificar compostos desconhecidos Quantificar compostos Revelar a estrutura de molculas Determinar modificaes ps traducionais em protenas

Alguns Usos

Detectar e identificar substncias proibidas em atletas; Monitorar pacientes durante uma cirurgia; Determinar a composio de espcies encontradas no espao; Localizar depsitos de petrleo; Monitorar processos de fermentao; Deteco de dioxinas em peixes; Determinar danos em genes; Estabelecer composio elementar de material semi condutor.

Anlise de Biomolculas Por que espectrometria de massas?

Informao de massa molecular Com preciso Identificao de protenas usando massa molecular de
peptdeos trpticos

Informao Estrutural Sequenciamento de peptdeos Identificar modificaes ps-traducionais (fosforilao,

glicosilao e pontes de sulfeto)

Como um espectrmetro de massas trabalha? Uma pequena quantidade de amostra vaporizada e injetada no espectrmetro de massa; A amostra ento ionizada; Os ons formados podem ser positivos ou negativos; Fragmentos neutros no so detectados; Os ons so ento separados de acordo com sua razo m/z; m = massa; z = carga Os ons so ento detectados.

Espectrmetro de Massas Requer mtodos para:

Obter amostras na fase gasosa; Formar ons; Separar os ons de acordo com sua razo m/z Detectar os ons formados

Como um espectrmetro de massas trabalha?

Ionizao
+

Separao Analyzer

Deteco

Ion Detection

Source

Formao de ons Ions detectados

100 100 75 75

Inlet

Slida Liquida Gasosa

50 50 25 25 0 0

1330 1330

1340 1340

1350 1350

Introduo da amostra

Espectro de massas

Anlise dos dados

Tcnicas de Introduo de Amostras

Cromatografia Lquida LC/MS - termicamente instveis, compostos de alto PM LC/MS adequado para protenas e peptdeos Tcnica on-line Sondas de insero direta Amostras colocadas em uma sonda e inseridas Amostras podem misturadas a uma matriz Cromatografia Gasosa Amostras precisam ser volteis

Fonte de ons

Ionizao por eltron (EI)

Ionizao qumica (CI)

Eletronspray (ESI)

MALDI

Mtodos agressivos de ionizao (fragmentos podem nao ser detectados)

Mtodos suaves de ionizao

Fonte de ons

Ionizao por eltron (EI)

Ionizao qumica (CI)

Eletronspray (ESI)

MALDI

Mtodos agressivos de ionizao (fragmentos podem nao ser detectados)

Mtodos suaves de ionizao

Mtodos de ionizao

Mtodos de ionizao

A amostra misturada com uma matriz que absorva UV

A matriz absorve energia do laser o que causa sua volatilizao junto com a volatilizao da amostra

As molculas da matriz ionizada transferem prtons para a amostra

Mtodos de ionizao

Matrizes para MALDI

I - c i d o -4 -h y d r o x i -c y a n o c i n n a m i c o I I - c i d o Si n a p i c o II I H3CO COOH
CH C CN HO
HO OCH3

CH CH COOH

Mtodos de ionizao

Preparao da amostra

cido cinmico

Mtodos de ionizao

+ + ++ + + ++++ ++ + + + + +

Accelerated charged particles

Pulsed Laser Beam

Strong electric field (5-20 kv)

Caractersticas da Tcnica MALDI-TOF MS

Ionizao suave anlise de biomolculas intactas Extensa faixa de massa (> 400 kDa) Anlise de misturas - sem purificao Alta sensibilidade Fcil interpretao dos dados Tampes e sais tem pouco efeito Rpida Fcil uso e manuteno

Aplicaes MALDI-TOF
Proteinas
Medidas de Massa Confirmar PM de protenas

Peptdeos
Medidas de massa Confirmar sntese

Oligonucleotideos
Medidas de massa Confirmar sntese

Sequenciamento Sequenciamento Ladder sequnciaIdentificar modificaes Sequenciamento exonucleases ps traducionais qumico e enzimtico Genespectrometria Caracterizar protenas MS/MS Anlise Protemica Utilizar resultados para pesquisa em banco de dados

Mtodos de ionizao

Mtodos de ionizao

Mtodos de ionizao

Fonte de ionizao

Mtodos de ionizao

Mtodos de ionizao

Evaporao no ESI

Mtodos de ionizao

Equilbrio de estados de cargas

N-terminal amine 4+

H H M E H F

H R W G

H K

4+ H H H H H H

3+ H H

2+ H

1+ H

Mtodos de ionizao

Espectro de Massas ESI de peptdeos

m/z = (Mr+3H)/3 4+ H H H H H H H H H H 3+ 2+ m/z = (Mr+H) 1+

m/z = (Mr+4H)/4

m/z = (Mr+2H)/2 ES-MS 2+

Re l. I nte n.

3+ 1+ 4+

m/z

Mtodos de ionizao

Espectro de Massas ESI de Protenas

Mtodos de ionizao

Vantagens do ESI
1)

Apropriado para compostos carregados, polares e bsicos; de compostos de alta massa

2) Permite a deteco

molecular maioria dos espectrmetros de massas; 3) Melhor mtodos para anlises de compostos

multicarregados; 4) Baixo rudo qumico permite timos limites de deteco;

5) Permite o controle de fragmentaes; 6) Compatvel com mtodos de MS/MS

MALDI-TOF ou Electrospray? Vantagens do MALDI-TOF Maior resoluo e exatido (comparado ao LC/MS com
quadrupolos e ion-traps); Intervalo de massa de ~50 >400,000 Daltons;

Relativa tolerncia sais, tampes; Fcil interpretao dos dados; Possibilidade de analisar amostras difceis (Glicoproteinas, oligonucleotideos,carbohidratos); De fcil uso e manuteno.

MALDI-TOF ou Electrospray? Vantagens do Electrospray Sistema dinmico;

Aplicado a molculas pequenas, (particularmente triplo quadrupolo);

quantificao,

Opes de MS/MS

Massa exata de protenas intactas.

Concluses Anlise de Biomolculas por MS

Exatido nas medidas de massa Caracterizao de amostras sintticas, protenas, peptdeos... Verificao de homogeneidade de amostras antes do sequeciamento das protenas, Purificao de amostras on line Mapeamento de peptdeos Caracterizao estrutural da protena usando CID/MS and MS/MS Identificao de modificaes pos traducionais; Sequncia primria de peptdeos;
Software eficiente na anlise dos dados

Rpida identificao da protena utilizando pesquisas em banco de dados.

Resoluo
R= m/ m m= m/R

Anlise de protenas no ESI - BSA

100 90 80 70 1846.291 1748.868 1704.449 2373.148 60 50 40 30 20 1453.913 10 0 1000 1661.850 1620.910 2461.494 2556.378 2658.149 1954.345 2076.494 2143.433 2214.905 2291.345 3165

% Intensity

1510.337 2893.649 3025.703 3909.434 3164.460 3690.996 3327.893 4153.774 1700 2400 3100 3800 4500

Mass (m/z)

Anlise de protenas no ESI - BSA

100 90 80 66533 70 60 50 40 66684 30 20 10 0 66000 0 67600 66805 66424 3.9E+4

% Intensity

66320

66640

66960

67280

Mass (m/z)

Resoluo LC-MS-MS
Baixa resoluo (700)
692.5
1.8e5

692.429

Alta resoluo ~13000 Preciso ~2 ppm (internal cal.)

Intensity, cps

692.934
1.0e5

693.439 694.0
2.0e4 691.5 692.5 693.5 694.5

m/z, amu

High resolution gives you much more information & more accurate information about what is in a sample

Analisador de Massas

Quadrupolo (depende decorrente eltrica) Time of Flight (depende da massa) Ion Trap (depende da corrente eltrica) Setor Magntico (depende da voltagem)

Quadrupolo
Consiste de 4 bastes de metal paralelos Os bastes opostos tem potential de mesmo sinal angular

Quadrupolo
Voltagem aplicada aos eletrodos afeta a trajetria dos ons com o valor de m/z de interesse, e eles viajam dentro dos bastes Estes ons passam atravs do sistema de eletrodos ons sem interesse mudam sua trajetria original e chocam nas paredes dos quadrupolos; Desta maneira os ons de interesse so separado O espectro de massas obtido variando a voltagem nos bastes e monitorando quais ons passam pelo filtro

Em espectrometria de massas seqencial Normalmente existem 2 analisadores de massa em srie

O primeiro analisador (MS1) usado para SELECIONAR o on que se deseja fragmentar. O on selecionado por MS1 o on pai que pode ser o on molecular ou qualquer outro on resultante de uma fragmentao primria. A DISSOCIAO ocorre na regio de fragmentao. Os ons filhos so analisados no segundo analisador de massas e detectados no detector.

MS1

MS2

MS1, seleo do on pai. Regio de fragmentao, existe um gs neutro ( He, Ar, N2.) O on selecionado interage com as molculas de gs.A energia cintica dos ons transformada em energia interna, o que permite a sua fragmentao MS2, os ons formados so separados de acordo com sua razo m/a e detectados no detector.

MS

Ion Source

Q1

q2

Q3

Detector

m/z

MS/MS

Ion Source

Q1

q2

Q3

Detector

m/z

MS/MS

Ion Source

Q1

q2

Q3

Detector

m/z

MS/MS

Ion Source

Q1

q2

Q3

Detector

m/z

Aminocidos so sub unidades da protena

side chain

ALANI NA

Aminocidos so ligados por ligaes peptdicas e formam poli peptdeos

A polypeptide chain has two distinct ends (amino- or Nterminus and carboxyl- or C-terminus) and it is made up of a regularly repeating backbone and distinctive side chains or residues (R1 , R2 , R3 , R4 , R5 )

ons formados na fragmentao de um Peptdeo

CID de um Peptdeo Trptico

H2N + H2N + H2N + H2N
b4
Relative I ntensity

COOH + COOH
b6

+ COOH
y2

y1

b5

+ COOH
y3
y

y b1 K F
1 3

y G L
2

b2 L G b
3

F K m/z

Nomenclatura dos fragmentos dos peptdeos

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Separa os ons beseando no tempo de vo Os ons so acelerados por um campo eltrico

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Laser Detector

Signal processing

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Laser Detector

Signal processing

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Laser Detector

Signal processing

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Laser Detector

Signal processing

Spectrum

Analisador de Massas

Tempo de Vo
Laser Detector

Signal processing

Spectrum

Analisador de Massas

Reflectron TOF Z2

Signal processing

DETECTOR

PULSED LASER BEAM

ION-GATE

m/z 1 m/z 2 m/z1 = m/z2

20 kV

Signal processing

DETECTOR

LASER

ION-GATE

20 kV

Signal processing

DETECTOR

LASER

tx

ION-GATE

20 kV

Signal processing

DETECTOR

LASER

ION-GATE

20 kV

Signal processing

DETECTOR
m/z

LASER

ION-GATE

20 kV

Signal processing

DETECTOR
m/z

ION-GATE

20 kV

Signal processing

DETECTOR
m/z

ION-GATE

20 kV

ons b

m/z

ons y

m/z

Ac-S P D M V M K/Q G I/L K/Q I/L

G T I/L I/L G I/L I/L K/Q S I/L

Detectores

Multiplicador de eltrons
Multiplica uma corrente eletrnica, por acelerao de eltrons na superfcie de um eletrodo. A coliso libera um nmero de eltrons secundrios maior que o nmero de eltrons incidentes Os eltrons secundrios so acelerados tambm por um outro eletrodo que por sua vez libera outros eltrons secundrios e assim por diante, resultando em uma amplificao do sinal.

Detectores

Placa de Micros Canais (MCP)

Um arranjo de capilares de vidro - paredes internas - material condutor de energia eltrica - alta voltagem - on que colidir na parede interna dos capilares criar uma avalanche de eltrons secundrios

Detectores

Placa de Micros Canais (MCP)

GRUPO LBEZ www.rc.unesp.br/lbez

Prof. Dr. Mario Sergio Palma Ps-Doutorandos: Bibiana Monson de Souza Lucilene Delazari dos Santos Lilian Mari Marcondes Cesas-Togneli Daniel Saidemberg Nicoli Baptista Barao Paulo Csar Gomes Keity Souza Santos Mestrandos: Fernanda Pessoa de Sales Alessandra Vaso

Doutorandos:

I.C.:

Virginia Ferreira Jose Roberto dos Santos Nathalia Dias

APLICAES APLICAES Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas

Toxinas de venenos podem causar uma grande variedade de sintomas e apresentar vrios mecanismos de ao em diferentes tipos de clulas

Toxinas de Venenos podem ser usadas como uma importante ferramenta para estudos de bioatividade

Muitas destas toxinas tornam-se modelos estruturais para o desenvolvimento de novas drogas

As toxinas de venenos animais devem estudadas de acordo com sua natureza qumica:

Compostos de baixo peso molecular; Peptdeos e Protenas

O tipo de toxina depende do tipo do veneno animal em investigao:

Aranhas Escorpies Cobras Anmonas Insetos LMW + peptdeos Peptdeos Protenas + peptdeos LMW Protenas + peptdeos

Tetrahydro betacarbolinetoxins

Bloqueadores de Receptores Benzodiazipina Parawixia bistriata

HO NH NH 2

NH O

NH

NH 2

HO

NH NH NH NH 2 NH 2

Acylpolyamine Amide Toxins: 72 estructuras elucidadas

Non-Competitive Glutamate Receptor Blockers Nephila clavipes

OH NH HO O O NH CONH 2 O NH NH O NH CONH 2 NH O NH NH O NH NH
2

O NH NH NH

O NH NH
2

O NH NH O NH CONH 2 NH

O NH NH

O NH NH
2

HO

Nephila clavipes Web Insecto Toxins

Inseticidas
OH NH N O CH2 CH3 CH3

CH2 NH HO CH3 O .Fe NH2

5-hidroximetil-2-aminometil-N-carbonilamino-2-metilpropilfenona

Jelly Fish: Caribdea alata

OH O OH OH

Inflammatory factor:
OH

OH OH

Aplicaes

Structural Characterization of Novel Chemotactic and Mastoparan Peptides from the Venom of the Social Wasp Agelaia pallipes pallipes by HPLCESI-MS/MS

Maria Anita Mendes, Bibiana Monson de Souza, Lucilene Delazari dos Santos and Mario Sergio Palma

Cromatograma de massas do extrato de veneno bruto da vespa Agelaia pallipes pallipes

Sequncias dos peptdeos determinadas por ESI-MS/MS

I/L-I/L-G-T-I/L-I/L-G-I/L-I/L-K/Q-G-I/L-NH2

I/L-N-W-I/L-K/Q-I/L-G-K/Q-A-I/L-I/L-D-A-I/L-NH2

I/L Q/K

uso de ons fragmentos do tipo d e w uso de reao de acetilao com anidrido actico

Distinguindo Ile e Leu ons d e w

Distinguindo Ile e Leu ons d e w

Sequncia dos peptdeos determinadas por espectrometria de massas

Protonectina (MW 1207.8 Da)

I/L-L-G-T-I-L-G-L-L-K-G-I/L-NH2
Agelaia MP (MW 1565,0)

I/L-N-W-L-K-L-G-K-A-I-I-D-A-I/L-NH2

Atividades Biolgicas
Degranulao de Mastcitos

Atividades Biolgicas
Hemlise

Atividades Biolgicas
Quimiotaxia

Atividades Biolgicas
Quimiotaxia

Concluses
Poder da tcnica de espectrometria de massas

Determinao de sequncia primria de peptdeos;

Distino de resduos de amino cido isobricos;

-Caracterizao de peptdeos processo inflamatrios.

Rapid Commun Mass Spectrom 2004: 18, 639-642

envolvidos

em

MASS SPECTROMETRIC CHARACTERIZATION OF TWO NOVELINFLAMATORY PEPTIDES FROM THE VENOM OF THESOCIAL WASP Polybia paulista.

Bibiana Monson de Souza1, Mauricio Ribeiro Marques1, Daniela Maria Tomazela2, Marcos Nogueira Eberlin2, Maria Anita Mendes1Mario Sergio Palma1* ,

Determinao Estrutural
Perfil Cromatogrfico do veneno bruto da vespa Polybia paulista

Determinao Estrutural
Anlise de massas do peptdeos purificados

A:

B2

B:

B1

Determinao Estrutural

Determinao Estrutural

Distinguindo Ile e Leu ons d e w

Distinguindo Ile e Leu ons d e w

Tempo de reteno

Determinao Estrutural
Sequncia do peptdeo

I N W L K L G K M V I D A L-NH2
(MW 1611.98 Da)

Rapid Commun Mass Spectrom. 2004: 18

Structural and Functional Characterization of N-Terminal Blocked Peptides Isolated from The Venom of the Social Wasp Polybia Paulista

Susan Pereira Ribeiro1, Maria Anita Mendes1, Bibiana Monson de Souza1, Lucilene Delazari dos Santos, Maurcio Ribeiro Marques1, Walter Filgueira de Azevedo Jr2, Mario Sergio Palma1* (1) Dept. Biology - CEIS / IBRC - UNESP - Rio Claro, SP, (2) CEP: 13506-900 Brazil; (2) Dept. Physics, (3) IBILCE-UNESP, S.J.Rio Preto, SP- Brazil

RESULTADOS

Perfil cromatogrfico do extrato de veneno em gradiente de 5 to 60% (v/v) MeCN .

RESULTADOS

Frao 13 apresentou potente atividade de degranulao demastcitos.

RESULTADOS

Perfil cromatogrfico da frao 13 em fase normal sob condies isocrticas [50% (v/v) MeCN ].

Espectro de massas da Frao 13

FR 13-1
A:

FR 13-2

B2

B:

B1

Qumica Degradativa de Edman

Sequeciamento N-Terminal
No houve reao de acoplamento entre os grupos a-amino de ambos peptdeos com o reagente de Edman (phenylisothiocyanate)

N-Terminal modificado

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

Ac-S-A-D-L/I-V-K/Q-K/Q-L/I-W-D-N-P-A-L/I-NH2

Espectro de Massas Sequencial (ESI-MS/MS)

Ac-S-V-D-M-V-M-K/Q-G-I/L-K/Q-L/I-W-P-L/I-NH2

Uso Combinado de MS com Qumica de Protenas

Distino de resduos de amino cidos Isobricos

I/L

uso de ons fragmentos do tipo d e w (com alta energia de coliso)

Q / K uso de reao de acetilao com anidrido actico

Sequncia Completa dos Peptdeos

Polybine-I: Ac-S-A-D-L-V-K-K-I-W-D-N-P-A-L-NH2 Polybine-II: Ac-S-V-D-M-V-M-K-G-L-K-I-W-P-L-NH2

Sntese do peptdeos em fase slida Com e sem acetilao

Atividades Biolgicas

Degranulao de Mastcitos; Hemlise; Quimiotaxia; Antibiose.

Os peptdeos no apresentaram antibiticas nem hemolticas

atividades

Degranulao de Mastcitos

Quimiotaxia de clulas PMNL (Polybine I)

Quimiotaxia de clulas PMNL (Polybine II)

CONCLUSES
A acetilao dos grupos -amino dos resduos Nterminal do Polybine-I e II aumenta a atividade biologica para ambos peptdeos; Podem prevenir a ao de algumas exoproteinases sobre os peptdeos; Os peptdeos Polybines I e II constitutem uma nova famlia de peptdeos inflamatrios encontrados no veneno de vespas, apresentando em in vivo um bloqueio qumico no resduo N-terminal

APLICAES APLICAES Espectrometria de Massa x Espectrometria de Massa x Anlise Protemica Anlise Protemica

anlise de PROTenas expressas por um genOMA

PROTEOMA
separao sistemtica Identificao quantificao conjunto de Protenas

1 amostra

PROTEOMA
anlise de PROTenas expressas por um genOMA

PROTEOMA
anlise de PROTenas expressas por um genOMA

H muito mais protenas no proteoma que genes no genoma

GENOMA
Representa a soma de todos os genes de um organismo

PROTEOMA
No uma caracterstica fixa no organismo

O material gentico pode ser expresso de vrias maneiras Splicing do RNAm Modificaes pstraducionais

PROTEOMA
1995 Todas as protenas expressas por um genoma

Atualmente

Metodologia que objetiva documentar a distribuio geral de protenas de uma amostra, identificar e caracterizar protenas individuais e principalmente elucidar as suas associaes e funes

Estudo comparativo de venenos: A gravidade dos acidentes ofdicos causados por serpentes do gnero Bothrops atrox das regies de Manaus e da Fronteira Brasil- Colmbia so diferentes. O mesmo ocorre com diferentes esp cies de aranhas do gnero Loxosceles.

identificao de protenas de interesse biotecnolgico e farmacolgico.

SEQUENCIAMENTO PEPTDICO
Espectrometria de massas e/ou Sequenciamento Automtico (Qumica Degradativa de Edman)

Espectrometria de Massas

BIOINFORMTICA PROTEMICA
Dados oriundos da Espectrometria de Massas e Eletroforese Bidimensional

Programas de Busca (Ferramentas de Bioinformtica)

Bancos de Dados

Relatrio de um Espectrmetro de Massas do tipo ToF-ToF (Analyzer 4700 Applied Biosystems)

130

PROTEOMA DESCRITIVO Identificao das protenas mais abundantes da amostra analisada, a fim de compreender os mecanismos de ao Proteoma da gelia real e do veneno da abelha Apis mellifera

Proteoma do veneno de vespa Polybia paulista

Identificao das protenas do veneno de abelhas Africanizadas (Apis mellifera L.) imunoreativas ao soro antiveneno por abordagem protemica

16 protenas identificadas:
Fosfolipases Metaloproteases

Veneno total 92 spots

Protenas imunoreativas

Protenas no imunoreativas

cidas 210 spots

Bsicas 72 spots

111 spots

43 spots comuns Total: 239 spots diferentes

Extratos especficos para diagnstico e tratamento

Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As protenas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 protenas foram detectadas pela colorao com CBB.

IMUNODETECO
Soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa Polybia paulista x Veneno da vespa P. paulista
16 protenas imunoreativas

* 1 Relato: Identificao de antgenos clssicos e suas isoformas

Extratos especficos para diagnstico e tratamento

PROTEOMA DE EXPRESSO DIFERENCIAL Tecido sadio e doente ou Clulas perturbadas por drogas ou outros estmulos
Cncer de Cabea e Pescoo
pI 3.0 kDa 10.0 pI 3.0 10.0

50

40

30

25

Tecido Sadio

Tecido Doente

Softwares para Tratamento e Anlise de Gis 2D

Tecido Doente Tecido Sadio

Expresso Protica - Doena do Cancro Ctrico

kDa 50

Planta Sadia Doente

Planta

40

30

25

pI 4.0

5.9

4.0

5.9

PROTEOMA DE MAPEAMENTO A identificao de protenas e suas atividades em organelas, refletindo a atuao das mesmas (funes), o qual promove a visualizao das protenas (distribuio espacial celular) e se elas esto ativas.

Wu et al (2000) identificou vrias classes de protenas envolvidas na regulao da fuso de membranas e secreo utilizando eletroforese 2D e Espectrometria de Massas

Obteno funcional diferentes

de

um dos

screening estados retculos

entre

endoplasmticos de glndulas mamrias de ratos.

SHOT GUN

MALDI IMAGING

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