CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

Existem vrias condies em que conveniente quantificar a populao microbiana de uma determinada amostra. Na anlise da eficincia de agentes antimicrobianos ou a eficcia de prticas higinco-sanitrias comum determinar a populao sobrevivente ao tratamento. Tambm, em determinadas condies clnicas, como em infeces do trato urinrio, quando o nmero de um determinado organismo superior a 100 mil/ml considera-se que esse organismo o agente da infeco. Tambm comum empregar tcnicas para quantificar a populao de microrganismos da gua e alimentos para avaliar a qualidade microbiolgica dos mesmos. Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o nmero de clulas presentes num determinado material ou superfcie, ou indiretamente, efetuando-se anlises da turbidez, determinao do peso seco, concentrao de substncias qumicas (protenas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metablica, DNA, RNA) ou atravs da contagem do nmero de microrganismos viveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na gua, em alimentos como leite, carnes, vegetais, superfcies, ar ou at mesmo em culturas puras. Contagem microscpica direta esse mtodo requer o uso de cmaras de contagem especiais como a de Petroff-Hauser, na qual uma alquota de uma suspenso da cultura ou de qualquer amostra contada e o nmero de clulas determinado matematicamente. O mtodo rpido mas no permite discriminar clulas vivas de clulas mortas. Tambm no sensvel o suficiente para determinao de populaes inferiores a 1 milho de clulas. Contagem eletrnica quantifica rapidamente o nmero de clulas numa suspenso, atravs da passagem do fluido por um orifcio minsculo contendo um fluxo de eltrons. Como as clulas no so condutoras, elas aumentam a resistncia eltrica do fluido condutor e a resistncia registrada eletronicamente, quantificando o nmero de clulas que passam atravs do orifcio. Esse mtodo tem o inconveniente de detectar clulas mortas e tambm quantifica materiais inertes porventura presentes na amostra. Anlise espectrofotomtrica a turbidez de uma cultura est relacionada com a concentrao de clulas. Quanto mais turva a cultura, maior a concentrao celular. O mtodo turbidimtrico mede a quantidade de luz transmitida no espectrofotmetro a 600m. Quanto menor for a quantidade de luz transmitida maior a concentrao celular daquela suspenso. Todos esses mtodos podem ser usados para contagem dos microrganismos. Alguns tm aplicaes especficas, como a contagem do nmero de microrganismos no leite ou numa cultura pura. No entanto, em determinadas circunstncias, como aquelas em que se avalia as prticas higinico-sanitrias ou processamento tecnolgico ou conservao, preciso determinar a populao de clulas viveis. Para efetuar a contagem total de bactrias numa determinada suspenso da amostra faz-se diluies decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela tcnica de pour plate ou disseminao com ala de Drigalsky, em meios de cultura apropriados. Aps o perodo de incubao em condies de temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do nmero de colnias. preciso, no entanto, tomar determinadas medidas para evitar interpretaes errneas, tais como perodo em que colhida a amostra, transporte apropriado, tempo transcorrido entre a coleta e a anlise, dentre outros. Nesse mtodo conveniente preparar as amostras no mais curto intervalo de tempo para evitar a multiplicao dos microrganismos. Por ser este ltimo mtodo o mais empregado na rotina o que demonstraremos na prtica.

Determinao do nmero de clulas viveis, contagem total de microrganismos viveis ou contagem padro em placas ou ainda contagem de viveis em placa. Distribuio dos reagentes para execuo da contagem padro em placas pela tcnica de Pour-plate:

Tubos Sol. Salina-peptonada Amostra (gua, cultura, etc) Total da Mistura sucessiva

1 225ml 25g/ml

2 9,0

3 9,0

4 9,0

5 9,0,

6 1,0

10,0 1/10 1/100 10-2

10,0 1/1000 10-3

10,0 1/1000 0 10-4

10,0 1/1000 00

Diluio final 10-1

Figura 29.

A partir de cada diluio utiliza-se 1,0 ml como inculo, em duplicata, e distribui-se nas placas previamente esterilizadas. Em seguida, pega-se o meio fundido e esfriado a 45oC (em Banho-Maria) e verte-se sobre a placa de Petri contendo a suspenso diluda da amostra. O material homogeneizado girando-se a placa atravs de movimentos circulares no sentido horrio e anti-horrio ou efetuando-se movimento descrevendo-se o nmero oito. Esses movimentos so efetuados por cerca de 10 vezes. Aps a solidificao do meio, as placas tampadas so invertidas e incubadas em estufas na temperatura e atmosfera apropriadas. Ao final da incubao, usualmente 48 horas, as colnias so contadas e o resultado mdio de cada diluio registrado e multiplicado pelo fator da diluio, que a recproca da diluio. As placas adequadas para contagem devem ter entre 30 a 300 colnias. Exemplo, 100 colnias na diluio 1/100, o resultado 10.000 UFC/ml ou grama da amostra. Usualmente o resultado final registrado em UFC que significa unidades formadoras de colnias isto porque em algumas situaes no uma nica clula que d origem a uma colnia, mas um agregado de clulas. O mtodo sofre uma ligeira variao quando aplicado para outras contagens. Para contagem de Staphylococcus aureus de uma amostra de alimento o mtodo de semeadura usado o da disseminao, em que da diluio 1/1;0 ou 10 -1retira-se trs alquotas de 0,3 ml e uma de 0,1 ml e verte-se cada uma sobre quatro placas de Petri contendo o meio de cultura Agar Baird-Parker. Cada alquota espalhada com auxlio de uma ala de Drigalsky previamente esterilizada em lcool a 70 85 % e ligeiramente flambada na chama do bico de Bunsen. As placas so invertidas e incubadas a 35oC por 48horas. As placas contendo entre 25 a 250 colnias tpicas so selecionadas e contadas. Supondo as contagens entre 89, 75, 85 e 25 colnias, respectivamente, para as alquotas 0,3, 0,3, 0,3, e 0,1, a contagem total de 274 UFC, multiplicada pelo fator de diluio 10, temos 2740 UFC ou 2,74 X 10 3 UFC/g ou ml da amostra. Caso as placas das alquotas de 0,3 ml apresentem mais de 300 colnias cada uma, conta-se as colnias da placa contendo a alquota de 0,1 ml e multiplica-se por 100 ou 10 2. Exemplo 120 colnias multiplicadas por 100 igual a 12000UFC ou 1,2 X 104 UFC de Staphylococcus aureus por grama ou mililitro da amostra. Este resultado ainda depende da confirmao de cerca de 10% das colnias pela prova da coagulase. Se todas forem positivas mantm-se o valor, caso contrrio, calcula-se o valor fazendo uma regra de trs simples. As vantagens da contagem padro em placa so:
2

1. Somente clulas viveis so contadas; 2. Permite o isolamento das colnias, que podem ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas. No entanto, algumas desvantagens so apresentadas: 1. No existe um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos; 2. necessria a incubao apropriada para permitir o desenvolvimento das colnias; 3. Usa-se muita vidraria e relativamente trabalhoso; 4. A necessidade de muita manipulao pode originar erros nas contagens devido a erros de diluio e/ou plaqueamento.