15/05/2012

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia CLAE

Prof. Cleiton Nunes DCA/UFLA

Comparao CLC x CLAE

injeo: coluna: 10cm x 0,5-1,0 m conta-gotas partcula 60-200m reuso FE dificultado eluio: gravidade demorada deteco: coleta manual outras tcnicas gravimetria anlise qumica

anlise espectral
etc.

coluna: 4-10mm x 10-30 cm partcula 3-20 m reuso FE facilitado

injeo: seringa (3-10l)

eluio: alta presso rpida

deteco: automtica detectores on-line

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Tcnicas de separao em CLAE

Adsoro (lquido-slido) Principio de separao: competio de adsoro AN-FE por stios na FE (polar) FE: slido adsorvente Alumina Al2O3
F.M.

F.E S

slica SiO2
L

FM: Hexano Metil-tercbutil-eter CHCl3 CH2Cl2

Tcnicas de separao em CLAE

Troca inica

Princpio de separao: atrao entre ons do NA por stios catinicos/aninicos na FE

FE: matriz de polmero ou slica com grupos catinicos/aninicos ligados FE troca catinica: SO3-, COOFE troca aninica: NR3+

F.M.

F.E

FM: solues tampo

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Tcnicas de separao em CLAE

Excluso molecular Princpio de separao: diferena de tamanho das molculas de AN. Maiores eluem 1 FE: polmeros porosos. (PVA, poliacrilamida, S-DVB)

FM:

solvente orgnico - permeao em gel aquosa - filtrao em gel

F.M.
poros

F.E

Tcnicas de separao em CLAE

Partio (lquido-lquido) Princpio de separao: diferena de solubilidade AN entre FM/FE FE: FE lquida ligada superfcie do suporte (SiO2)
F.M. L F.E L

FE polar
Mais usado

FE apolar

FM: MTBE, CHCl3, CH2Cl2, hexano

FM: acetonitrila, MeOH, tetrahidrofurano, H2O

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Princpios de separao em CLAE FASE NORMAL FE polar FM apolar

apolar polar

FM mais usadas: Metil-tercbutil-eter Clorofrmio Diclorometano Hexano

Princpios de separao em CLAE

FASE REVERSA

FE apolar

FM polar

polar apolar FM mais usadas: Acetonitrila Metanol Tetrahidrofurano gua

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Processo de eluio em CLAE

40% de CH3CN

Eluio isocrtica Composio FM constante

Isocrtica

80% de CH3CN 30% de CH3CN 45% de CH3CN

Eluio por gradiente Composio FM variada Polaridade FM varia com o tempo Melhora separao Diminui tempo de corrida

Gradiente

Esquema para escolha de tcnica CLAE

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Equipamento para CLAE

Fase Mvel e Reservatrio

Fase Mvel Alto grau de pureza Dissolver a amostra sem a decompor No dissolver ou decompor a fase estacionria

Desgaseificao
Elimina gases na FM Gases podem formar bolhas no sistema O2 pode oxidar a FM

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Bombas

FUNO: proporcionar fluxo constante de FM pelo sistema Alta presso Constante Reprodutvel Controle do gradiente de FM

CONDIES DE FUNCIONAMENTO: Presses acima de 6000 PSI Fluxos de 0,1 a 10 mL/min

Bombas

BOMBAS RECPROCAS (MAIS USADAS) Consistem de um pequeno cilindro no qual o solvente impelido pelo movimento de vai-vem de um pisto acionado por um motor. Duas vlvulas se abrem e se fecham alternadamente controlando o fluxo do solvente para dentro e para fora do cilindro. Vantagem: Altas presses de sada Desvantagem: Produzem fluxo pulsado Uso de pistes duplos reduz a pulsao

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Bombas

BOMBAS DE SERINGA Consistem de uma cmara equipada com um mbolo que deslocado continuamente por um motor.

O lquido contido na cmara comprimido e flui para o sistema atravs de uma abertura.
Vantagem: Fluxo livre de pulsaes Desvantagem: Capacidade limitada de volume de solvente (~250mL)

Bombas

BOMBAS PNEUMTICAS Consistem de uma cmara equipada com um mbolo ou no (gs inerte comprimido). O lquido contido na cmara comprimido mediante presso exercida por um mbolo ou gs inerte e flui para o sistema atravs de uma abertura. Vantagem: Fluxo livre de pulsaes Desvantagem: Capacidade limitada de volume de solvente e de presso

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Sistema de injeo

Volumes de injeo: 1 100 L Reprodutibilidade alcanada pelo uso de ala de amostragem (loop)

Sistema de injeo
A introduo da amostra realizada por um sistema de vlvulas. Operam em duas posies:

Carga do loop com a amostra

Introduo da amostra na coluna

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Colunas Colunas
Contm a Fase Estacionria 5 a 30 cm de comprimento 4 a 10 mm de dimetro interno

Pr-coluna (coluna-guarda)
~2cm de comprimento Composio semelhante da fase estacionria Instalada entre o injetor e a coluna Remove partculas Remove substncia que teriam forte interao com a coluna So substitudas regularmente

Forno para coluna

Mantm a temperatura da coluna estvel Temperatura ambiente ou ligeiramente acima Maiores temperaturas causam maior degradao da coluna Para a quantificao a termostatizao essencial ( 0,1 C)

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Fases estacionrias
Cromatografia em fase normal FE polar FM apolar Cromatografia em fase reversa FE apolar FM polar Partculas com dimetro uniforme ( partcula 3-20 m) CLAE de partio lquido-lquido mais usada Slica microporosa serve como suporte
Partcula de slica Si O CH3 Si CH3 R

Fases polares comuns

R = (CH2)3NH2 R = (CH2)3CN R = (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH amino ciano diol

Fases apolares comuns

R = (CH2)17CH3 R = (CH2)7CH3 R = (CH2)3C6H5 octadecil octil fenil

Detectores

Funo
Monitora continuamente a sada da coluna

Mede alguma propriedade fsica dos componentes eludos

O sinal detectado transformado em um pico no cromatograma

Requisitos
Alta sensibilidade

Baixo nvel de rudo

Alta estabilidade Boa reprodutibilidade

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Detectores

UV-Vis
Aplicao Detecta a absorbncia de radiao UV-Vis do analito compostos que apresentam grupos cromforos FM deve absorver pouco ou no absorver no l utilizado Tipos monocromtico policromtico

Detectores

UV-Vis

Monocromtico Monitora um nico durante a deteco Permite mudar durante a anlise (190-600 nm)

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Detectores

UV-Vis

Policromtico
Registra o espectro inteiro para cada analito Usa um conjunto de fotodiodos para registrar a absoro em cada

Detectores

ndice de refrao
Relao entre a velocidade da luz no vcuo e a velocidade da luz em outro meio Mede a alterao do ndice de refrao do eluato ao passar o analito Resposta universal Baixa sensibilidade til para anlise de substncias sem cromforos

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Detectores

Espectrometria de massas
A FM evaporada em um spray por um gs (N2) de nebulizao A evaporao da FM em regio com certa DDP, gera cargas na molcula do analito A molcula carregada no analito detectada no espectrmetro de massas
Eventualmente a molcula pode ser fragmentada Os fragmentos gerados so caractersticos de cada substncia

Detectores

Espectrometria de massas

Aplicao universal Fornece informao estrutural do analito Massa molecular e/ou espectro de massas

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