Gentica Bacteriana

bacteriano consiste no conjunto total de gen~s transportados pelas bactrias quer em seu cromossomo ou em seus elementos genticos extracromossmicos, uando presentes. O cromos somo bacteriano difere do cromossomo humano em vrios aspectos. O cromos somo de uma bactria tpica como a Escherichia cali consiste em uma nica molcula de DNA circular, de filamrnto duplo, ~ontendo aproximadamente 5 milhes de pares de bases (ou 5.000 quilobase pares [kb]) medindo aproximadamente 1,3 mm (isto , cerca de 1.000 vezes o dimetro da clula). Os menores cromos somos bacterianos (encontrados nos micoplasmas) possuem cerca de um quarto desse tamanho. Em comparao, os seres humanos apresentam duas cpias de 23 cromossomos, que representam 2,9 X 109 pares de bases com 990 mm de comprimento. Cada genoma contm muitos o rons, ue so constitudos or enes. Os eucariontes geralmente apresentam uas cpias distintas de cada cromos somo (eles so, por conseguinte, diplides). As bactrias apresentam somente uma cpia de seus cromossomos elas so ha lides). Considerando que as bactrias ossuem apenas um nico cromossomo, a a teraao do ene (mutao) Ir exercer um efeito mais bvio sobre a cl a. m isso, a estrutura do cromossomo bacteriano mantid referentemente por oliaminas, como a es ermina e a es ermidina, o ue or histonas. s actrias tam em contm e ementos enticos extracromossmicos como os plasmdios ou bacterifaB:Js (vrus bacterianos). Esses elementos so independentes o cromossomo bacteriano e, em muitos casos, podem ser transmitidos de uma clula para outra. Os genes so seqncias de nucleotdios com determinada funo biolgica; como exemplos temos os genes das protenas estruturais (cstrons, que so genes codificadores), genes do RNA ribossomal e stios de reconhecimento e ligao para outras molculas (promotores e operadores). Os promotores e operadores so seqncias de nucleotdios que controlam a expresso de um determinado ~e ao influencIar as sequencIas a serem transcntas emA mensageiro (RNAm) (ver discusso mais adiante). Os oprons so grupos de um ou mais genes estruturais ex ressos a artir de um determinado romotor ue izam em um elemento ara o trmino da transcri o. Por conseguinte, todos os genes que codificam as enzimas de uma determinadil via podem ser coordenadamente regulados. Os oprons com muitos genes estruturais so

o genoma

policistrnicos. O opron lac da E. cali inclui todos os genes necessrios para o metabolismo da lactose, assim como os mecanismos de controle para desativar (na pre. sena de glicose) ou ativar (na presena de galactose ou de indutor) esses genes somente quando necessrios. O opron lac inclui uma seqncia repressora, uma seqncia promotora e genes estruturais para a enzima 13galactosidase, uma permease, e uma acetilase (Fig. 5.1). O opron lac ser discutido posteriormente neste captulo.

Repressor

Beta-galactosidase

Permease Aeetilase

A0tl~1
Repressor RNAm

o_, _l~--z--I~
Nenhum RNAm lae RNAm.~
~ c

I~

I ~

~~~~essor ~

[!:]I l~
RNAm Repressor ~

Repressor

t~

RNAm

1
T

z
~
000 00

_I~'
~
@G

~ ~
Eil

Indutor alolactose

d
W
CAP
T Repressor ~

~ 9'
matlvo

Repressor

Lactose

Transgalaetosldao

111 ... 1--_'\-AMPe Adenilato ciclase

ATP

RNAm

[~].J;":J~====z====~
RNAm

I ~

R,p"=' ~
>-.... ~~~

+
~

000

~tc7o.~:~
~ ~

00 O O

Indutor

OJ

000

W
CAP
~-

Repressor inativo TAMPe

~Q)O

RNAm

[~] ... ..!>j~====Z ===~ t

Repressor eiclase Nenhum RNAm lae ~

.. I--A-d-e~~-i1a-toATP

Repressor ~ ativo _

Fig. 5.1 A, O opron da lactose transcrito como RNAmensageiro (RNAm) policistrnico a partir de um promotor (P) e traduzido em trs protenas: ~-galactosidase (Z), permease (Y) e acetilase (A). O gene lac 1 codifica a protena repressora. B, O opron da lactose no transcrito na ausncia de um indutor alolactose, uma vez que o repressor compete com a RNA polimeras e no stio operador (O). C, O repressor, complexa do com o indutor, no reconhece o operador devido a uma alterao de conformao no repressor. O opron lac ento transcrito em um nvel baixo. D, Escherichia coli crescendo em meio de cultura pobre, na presena de lactose como fonte de carbono. Tanto o indutor quanto o complexo CAP-AMPc esto ligados ao promotor, que est totalmente "ativado", e verifica-se um alto nvel de transcrio e traduo do RNAm lac. E, O crescimento de E. coli em meio de cultura pobre sem lactose resulta na ligao do complexo CAP-AMPc regio promotora e na ligao do repressor ativo seqncia do operador, uma vez que no h qualquer indutor disponvel. O resultado ser a ausncia de transcrio do opron lac. CAP = protena ativadora do gene catablito; AMPc = adenosina monofosfato cclico;ATP = adenosina trifosfato.

nos cromossomos filhos, cada um com seu par de forquilhas de crescimento para a sntese de novo DNA. A polimerase desloca-se ao longo do filamento do DNA, incorporando o nucleotdio apropriado (complementar) em cada posio. Areplicao se completa quando as duas forquilhas de replicao fazem um ngulo de 180 graus a partir da origem. O 'processo de replicao do DNA exerce uma forte tenso de torco sobre Q UNe cir~ular cromossomial; essa tenso aliviada elas to oisomera~ por exemp o, girase).1 topoisomerase essencial para as ,bactrias, constituindo o aJvo dos antibiticos quinolnicos:.
z:::t:::::;::: ---

Regulao

da Expresso

Gnica

~nzima ou enzimas de determinada via quando o substrato est ausente. ~ primeiro lugar, a organizao dos genes de uma via bioqumica em um opron, com mecanismos de controle g,entico apropriados, permite a produo coordenada das t;,nzimas necessrias em resposta a um estmulo nutricional. :gm segundo lugar, a transcrio do gene regulada diretamente pelas protenas repressoras (que se ligam aos operadoresfem resposta a sinais nutricionais no interior da clula ...Em terceiro lugar. a velocidade de sntese de protena pelo ribossomo pode regular a transcricg QQ rrg,carionJ:,es. A ausncia Qe uma membrana nuclear nos procariontes para separar os Q.ois processos permite ao ribossomo se ligar ao RNAm medida que ele est sendo transcrito a partir do DNA.* Regulao Transcricional

As bactrias desenvolveram mecanismos para se adaptar rpida e eficientemente s mudanas de concentrao de nutrientes em seu ambiente. Quando necessrio, as bactrias ativam um conjunto completo de enzimas e evitam sintetizar a

O incio da transcrio pode estar sob controle positivo ou negativo. Os genes sob controle negativo so expressos"a

Mltiplas

Forquilhas de Crescimento

Filamento seguidor

Filamento lder

{!)
~5' 11'

_;

Fig. 5.2 Admitindo-se um tempo de 40 minutos para completar um ciclo de replicao e considerando-se um novo incio a cada 20 minutos, o incio da sntese do DNA precede a diviso celular. Mltiplas forquilhas de crescimento podem ser iniciadas na clula antes da completa formao do septo e diviso celular. As clulas filhas "nascem grvidas".

um aumento na freqncia de iniciao da transcrio. O complexo CAP-AMPc pode aumentar a transcrio do opron atravs da interao protena-protena com a RNA polimerase ou atravs de uma interao protena-DNA. O o ron tri tofano (o ron contm os enes estrumrais necessrios iossntese o triptofano e possui meanismos de controle duplos transcricionais (Fig. 5.3). Embora o triptofano seja essencial para a sntese de protenas, um excesso de triptofano na clula pode ser txico; conseqentemente, ~ua sntese deve ser regulada. No nvel de DNA, a rotena re ressora ativada or um aumento da concentra~o intracelular do triptofano,.Jlara impedir a transcrio:l:i9 nvel de sntese de rotena, a r ida tradu o de um" e tqio teste' no incio do RNAm, na presena de triptofano, promove a formao de uma ala de filamento duplo no RNA, Que finaliza o processo de transcrico. A mesma ala formada se no houver nenhuma sntese de protena, uma situao em que no h necessidade de sntese de triptofano. Esse mecanismo re Ia a sntese do tri tofano no nvel de RNAm em um processo enominado atenuao, no gual a sntese do RNAm prematuramente finalizada. Regulao Ps-transcricional ou Ps-traduo

A velocidade e a eficincia da sntese de protenas podem ser controladas por outros fatores. Estes podem incluir a estrutura do RNAm ou as concentraes do RNA transportador (RNAt) e de aminocidos na clula. Com o RNAm policistrnico, o controle da traduo pode resultar em diferenas na quantidade de cada protena expressa a partir de cada gene. Por exemplo, para o opron lac, a l3-galactosidase, a galactosdio permease e a acetilase so produzidas razo de 10:5 :2.

O DNA transmite a informao gentica; conseqentemente, as clulas devem ser capazes de replicar o DNA com preciso. Alm disso, leses adicionais ao DNA devem ser minimizadas atravs da elabora o de eficientes sistemas de reparo do DNA. fuses sistemas de conteno de eso so to importantes para a vida de uma clula que uma bactria deve edicar uma rande uantidade de seu enoma ara especific-!:e controlar as enzimas envo vi as nesse sistema. Mutaes que Afetam o DNA

Uma mutao se refere a qualql}er mudana na seqncia de bases do DNA. A alterao de uma nica base pode resultar em uma transio, na qual uma purina substituda por outra urina ou na ual uma irimidina substituda or outra eirimidina. Po e tambm ocorrer uma transverso, niLqual, por'exemplo, uma purina substituda por uma pirimidina e yice-versa. Uma mutao silenciosa uma alterao no nvel de DNA que no resulta em qualquer mudana de aminocido na protena codificada. Esse tipo de mutao ocorre porque mais de um cdon pode codificar um aminocido. Uma muto de sentido equvoco resulta na insero de um aminocido diferente na protena, mas essa pode ser ~a muta o conservativa se o novo aminocido a resenta ro12..riedadessemelhantes (por exemp o, va ina substituindo a

Fosforribosil ontroniloto isomerose/indol 3-glicerol-fosfato

sintetase

Triptofono sintetase alfa

Fosforribosil antronilato tronsferase Repressor

Triptofano sintetase beta

~--

CQ--~
RNAm ~inativo

__

D_~C_~

Nenhum RNAm trp

!
r

Repressor

1 8.
d-.

Repressor . ativo

Co-repressor (triptofano)

1-0:------

.---.--.--b L::EW

ATG

Peptdia TGA lder

W__

2_~~~

__ E_~

Alta concentrao de Trp

VJ...AAJJJJ Nenhum RNAm trp policistrnico

BBaixa concentrao de Trp

RNAm

trp policistrnico

Ausncia de sntese de protena

Nenhum RNAm VJ...AAJJJJ trp policistrnico

Fig. 5.3 Regulao do opron do triptofano (trp). A, O opron trp codifica as cinco enzimas necessrias para a biossntese do triptofano. Esse opron trp se encontra sob duplo controle. B, A conformao da protena repressora inativa alterada aps a sua ligao pelo triptofano co-repressor. O repressor ativo (R) resultante se liga ao operador (O), bloqueando qualquer transcrio do RNAm do trp pela RNA polimerase. C, O opron trp tambm est sob o controle de um mecanismo de atenuao-antiterminao. Acima dos genes estruturais esto o promotor (P), o operador e um lder (L), que pode ser transcrito em um pequeno peptdio contendo dois triptofanos (IV) prximo extremidade distal. O RNAm lder possui quatro repeties (1, 2,3 e 4) que podem formar pares diferentes de acordo com a disponibilidade do triptofano, resultando em terminao precoce da transcrio do opron trp ou em sua transcrio completa. Na presena de alta concentrao de triptofano, as regies 3 e 4 do RNAm lder podem formar pares, originando um grampo de terminao, no ocorrendo nenhuma transcrio do opron trp. Entretanto, na presena de pouco ou nenhum triptofano, os ribossomos permanecem na regio 1 durante a traduo do peptdio lder, devido seqncia dos cdons do triptofano. Em seguida, as regies 2 e 3 podem parear, formando o grampo de antiterminao e levando transcrio dos genes trp. Finalmente, as regies 1:2 e 3:4 do RNAm lder podem parear, acarretando tambm a paralisao da transcrio antes do primeiro gene estrutural trpE. A= adenina; G = guanina; T = timina.

alanina). Fina mente uma muta o sem sen .do modifica o ,don gue codifica um aminocido em um c on je terminalizao (por exemplo, TAG [timidina-adenina-guanina]), &zendo com que o ribossolllQ se desprenda do RNAm e Ill\ralise prematuramente a sntese da protena. Podem ocorrer alteraes mais drsticas nas protenas quando esto envolvidas vrias bases. Por exemplo, uma pequena depleo ou insero que no em mltiplos de trs produz uma mutao por deslocamento do quadro de leitura. Em conseqncia, ocorre uma alterao na estrutura de leitura, resultando geralmente em um peptdio sem sentido e

em truncamento prematuro da protena. As mutaes nulas, que destroem completamente a funo gnica, surgem uando ocorrem extensa inser o deleo ou rearran'o pronunciado na estrutura do cromossomo. A insero de longas seqncias e N muitos milhares de pares de bases) por. recombinao, transposio ou durante a engenharia gentica pode produzir mutaes nulas ao separar as partes de um gene, inativando-o. Muitas mutaes ocorrem espontaneamente na natureza (por exemplo, por erros da polimerase); entretanto, as mutaes podem tambm ser induzi das por agentes fsicos ou

qumicos. Entre os agentes fsicos utilizados para induzir mutaes em bactrias temos o calor, que resulta na desaminao dos nucleotdios; a luz ultravioleta, que induz a formao de dmeros de pirimidina; e a radiao ionizante, como os raios X, que originam radicais hidroxila muito reativos que podem ser responsveis pela abertura de um anel de uma base ou por quebras de filamentos simples ou duplos no DNA. Os agentes qumicos mutagnicos podem ser agrupados em trs classes. A primeira classe constituda pelos anlogos de bases nucleotdicas; eles so incorporados ao DNA durante a replicao e acarretam pareamento equvoco e freqentes erros durante a replicao do DNA. A semelhana entre 05bromouracil e a timidina permite a sua incorporao ao DNA. Entretanto, um rearranjo estrutural da molcula permite a ligao do 5-bromouracil guanina em vez da adenina, alterando o par de bases T-A para G-c. A segunda classe constituda por molculas planas policclicas, como o brometo de etdio ou os derivados da acridina; constituem exemplos de substncias que induzem mutao por deslocamento do quadro de leitura. Inserem-se (ou intercalam-se) entre as bases medida que elas se empilham na dupla hlice, causando a adio ou a deleo de uma nica base. Esses agentes de intercalao aumentam o espaamento entre sucessivos pares de bases destruindo o esqueleto regular de acar-fosfato e diminuindo o espao entre as voltas da hlice. Essas alteraes levam a erros freqentes durante a replicao do DNA. A terceira classe constituda por substncias qumicas capazes de reagir com o DNA; elas atuam diretamente sobre o DNA, resultando na modificao da base normal em outra estrutura quimicamente diferente. As bases modificadas podem fazer pareamentos anormais ou no fazer qualquer pareamento. O dano pode causar a remoo da base do arcabouo do DNA. Essa classe inclui o cido nitroso (HNO) e agentes alquilantes, como a nitroso guanidina e o sulfonato de etilmetano que so conhecidos por adicionarem grupos meti! ou etil aos anis das bases do DNA.

5',llllllli3'

5"1'1

iiii3'

3" I , I , , , , I 5' A base lesada reconhecida pela endonuclease, que c1ivao arcabouo fosfodister em ambos os lodos da leso

A base lesada reconhecida 3" I , I I , , , '5' pelo glicosilase, que diva a li Uma endonudease AP rec~ gao entre o acar do nhece o stio AP e c1iva o nucleotdio e o arcabouo fos- arcabouo fosfodister prfodister ximo ao local da base au sente

5'T0 : , : : : T~
3'------5
As exonucleases transportam o fragmento do DNA que foi cortado e que apresentava a base lesado

(l
l

5';-r-r-r--' -,--,3'
B
, 5'

.l

Provavelmente ocorre uma ou_3' ' . , "

Ira fenda no outro lado do stio AP

5' T'"TOH 3" , , , !,

T
I

3' '5'

A DNA palimerase I preenche o lacuna da 3'OH livre

A DNA ligose sela a fendo entre o fragmento recm-sintetizado e o Fjlomento original do DNA

5'

T""T""T"!T,-

r'"r 3'

Fig. 5.4 A, Mecanismos de reparo por exciso generalizada. B, Mecanismo de reparo por exciso especializada. AP = apurnica (endonuclease).

Inmeras bactrias, especialmente muitas espcies bacterianas patognicas, so promscuas com o seu DNA. A troca de DNA entre clulas permite o intercmbio de genes e caractersticas entre essas clulas, produzindo assim novas cepas bacterianas. Essa troca pode ser vantajosa para o receptor, especialmente se o DNA alterado codifica resistncia a antibiticos. O DNA transferido pode ser integrado no cromossoma do receptor ou mantido de modo estvel como elemento extracromossmico (plasmdio) ou em um vrus bacteriano (bacterifago) e transferido para as bactrias filhas como unidade de replicao autnoma. Os plasmdios so pequenos elementos genticos que se replicam independentemente do cromos soma bacteriano. Os plasmdios so, em sua maioria, molculas de DNA de filamento duplo, circulares, que variam de 1.500 a 400.000 pares de bases. Entretanto, a Borrelia burgdorferi, o agente etiolgico da doena de Lyrne, e a Borrelia hermsii, so singulares entre todas as eubactrias, uma vez que possuem plasmdios lineares. De maneira semelhante ao DNA cromossmico bacteriano, tm a capacidade de replicao autnoma e, em conseqncia, so considerados rplicons. Alguns plasmdios, como o plasmdio F de Escherichia coli, so epissomas, o que significa que eles podem se integrar ao cromossoma do hospedeiro. Os plasmdios transportam informao gentica, que pode no ser essencial mas pode fornecer uma vantagem seletiva bactria. Por exemplo, os plasmdios podem conferir altos nveis de resistncia antibitica, podem codificar a produo de bacteriocinas ou toxinas e podem conter genes capazes de conferir uma vantagem peculiar no metabolismo de alguns

Vetor

pBR322 (4.363 pb)

1 incio

14
20 26 37 51 55 62 73 75

82 94
103 112 126

Fig. 5.5 Plasmdios. O plasmdio pBR322 um dos plasmdios utilizados para a donagem do DNA. Esse plasmdio codifica resistncia ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e uma origem de replicao (ori). O stio de donagem mltipla no plasmdio pGEM fornece diferentes pontos de divagem de enzimas de restrio para a insero de DNA dentro do gene da l3-galactosidase (lacZ). Ele flanqueado por promotores de bacterifagos para permitir a expresso direcional do RNA mensageiro da seqncia donada.

substratos (Fig. 5.5). O nmero de cpias de plasmdio produzido pela clula determinado pelo plasmdio particular. O nmero de cpias a relao entre as cpias do plasmdio e o nmero de cpias do cromossoma. Essa relao pode ser to pequena quanto 1, no caso dos grandes plasmdios, ou de at 50, nos pequenos plasmdios. Os grandes plasmdios (20 a 120 kb), como o fator de fertilidade F encontrado em E. cali, ou o fator de transferncia de resistncia (80 kb), podem, com freqncia, mediar sua prpria transferncia de uma clula para outra por um processo denominado conjugao (ver adiante seo sobre conjugao). Esses plasmdios conjugativos codificam todos os fatores necessrios para a sua transferncia. Outros plasmdios podem ser transferidos para uma clula bacteriana por um mecanismo diferente da conjugao, como a transformao ou transduo. Esses termos sero discutidos posteriormente neste captulo. Os bacterifagos so vrus bacterianos. Esses elementos genticos extracromossmicos podem sobreviver fora de uma

clula hospedeira uma vez que o genoma de cido nuclico (que pode ser DNA ou RNA) protegido por uma capa de protena (Fig. 5.6). Os bacterifagos infectam as clulas bacterianas e ou se replicam em grandes nmeros causando a lise celular (infeco lrica) ou, em alguns casos, integram-se ao genoma do hospedeiro sem causar a sua morte (estado lisognico), como o bacterifago de E. cali (Fig. 5.7). Alguns bacterifagos lisognicos transportam genes de toxinas (por exemplo, o corinefago 13transporta o gene da toxina diftrica). O bacterifago permanece lisognico enquanto houver sntese de uma protena repressora que impede a desintegrao do fago e sua replicao independentemente do cromossoma do hospedeiro. Essa reao pode ser deflagrada se o DNA da clula hospedeira sofrer leso por irradiao ou por qualquer outro mecanismo ou se a clula no puder mais produzir a protena repressora, um sinal de que a clula hospedeira no est mais saudvel e no constitui mais um local adequado para "carregamento livre". Os transposons so elementos genticos mveis (Fig. 5.8) que podem passar de uma posio para outra no genoma ou entre diferentes molculas de DNA. Os transposons mais simples so denominados seqncias de insero. Os transposons complexos transportam outros genes, como os genes que conferem resistncia aos antibiticos. Algumas vezes os transposons se inserem nos genes, inativando-os. Se a insero e a inativao ocorrerem em um gene que codifica uma protena essencial, a clula morrer. Algumas bactrias patognicas utilizam um mecanismo semelhante para coordenar a expresso de um sistema de fatores de virulncia. Os genes para a atividade podem ser agrupados em uma ilha de virulncia ou de patogenicidade, que circundada por elementos mveis semelhantes aos transposons, o que permite aos genes se moverem dentro dos cromossomas e para outra bactria. A unidade gentica total pode ser desencadeada por um estmulo ambiental (por exemplo, pH, calor, contato com a superfcie da clula hospedeira) como meio de coordenar a expresso de um processo complexo. Por exemplo, a ilha SPI-l de Salmanella codifica 25 genes que permitem bactria penetrar em clulas no-fagocticas.

A troca de material gentico entre clulas bacterianas pode ocorrer por um de trs mecanismos: (1) conjugao, que o . acasalamento ou troca quase sexual de informao gentica de uma bactria (o doador) para outra bactria (o receptor); (2) transformao, que resulta na aquisio de novos marcadores genticos por incorporao de DNA estranho ou exgeno; ou (3) transduo, que a transferncia de informao gentica de uma bactria para outra atravs de um bacterifago. A conjugao ocorre na maioria das eubactrias, seno em todas. Em geral, a conjugao ocorre entre membros

____________

1 FC'B'

C~J
(~) (~)
(~) (~)
____ ~ ~Beta-Iactamase~

t-Stio res

DNAde

E. col;

~ 2.i

Segmento G passvel de inverso ~enes para a cabea e a uda

DNA de E. col; ~

cab

~~~
Repetio invertida da esquerda

Repetio invertida do direita

Fig. 5.8 Transposons. A, As seqncias de insero codificam apenas uma transposase (tnp) e possuem repeties invertidas (15 a 40 pares de bases) em cada extremidade. B, Os transposons compostos contm uma regio central que codifica a resistncia aos antibiticos, ou toxinas, flanqueadas por duas seqncias de insero (1S),que podem ser diretamente repetidas ou invertidas. C, Tn3, um membro da famlia do transposon TnA. A regio central codifica trs genes - uma transposase (mpA), uma resolvase (mpR) e uma l3-lactamase - conferindo resistncia ampicilina. Um stio de resoluo (stio Res) utilizado durante o processo replicativo de transposio. Essa regio central flanqueada, em ambas as extremidades, por trechos repetidos diretos de 38 pares de bases. D, O transposon associado ao fago exemplificado por um bacterifago p.

Fig. 5.7 Infeco lisognica de bactria por bacterifago temperado. A, O fago infecta uma bactria sensvel, e o DNA do fago injetado. B, O DNA do fago torna-se integrado no cromossoma bacteriano. C, A bactria se multiplica, aparentemente no-afetada pela infeco. Ela foi lisogenizada. D, Ocasionalmente o DNA do fago sofre exciso do cromossoma bacteriano, adquire o controle da clula e se replica. E, Uma clula individual (ou, por induo, todas as clulas) produz componentes do fago. F, Os componentes so posteriormente organizados em partculas de fagos. G, Finalmente, a clula sofre lise e libera partculas maduras de fagos.

de uma mesma espcie, mas foi tambm demonstrada a sua ocorrncia entre procariontes e clulas vegetais, animais e fungos. A transformao o processo pelo qual as bactrias captam fragmentos de DNA desnudo e o incorporam em seus genomas. A transformao foi o primeiro mecanismo de transferncia gentica descoberto em bactrias. Em 1928, Griffith observou que a virulncia dos pneumococos estava relacionada com a presena de uma cpsula polissacardica que circundava a clula e que extratos de clulas portadoras de cpsulas produziam colnias lisas que podiam transferir essa caracte-

rstica para bactrias no-capsuladas, geralmente aparecendo com bordas rugosas. Os estudos de Griffith levaram Avery, MacLeod e McCarty a identificar o DNA como o princpio transformador, cerca de 15 anos mais tarde. As bactrias gram-positivas e gram-negativas so capazes de capturar e manter o DNA exgeno de maneira estvel (Fig. 5.9). Certas espcies so naturalmente capazes de capturar DNA exgeno (essas espcies so denominadas competentes), e incluem Haemophilus influ-enzae, Streptococcus pneumoniae, espcies de Bacillus e espcies de Neisseria. A competncia se desenvolve no final da fase do crescimento logartmico, algumas vezes antes de uma populao entrar na fase estacionria. A maioria das bactrias no exibe uma capacidade natural de captao de DNA. So utilizados mtodos qumicos ou de eletroporao (uso de pulsos de alta voltagem) para induzir a entrada de plasmdios e outros DNA em E. coli e outras bactrias. Conjugao A transferncia gentica em E. coli foi descrita pela primeira vez por Lederberg e Taturn em 1946, quando eles observa-

cromossoma~ bactenano

. ~~. Captao +de DNA

-----

[ID0U
Transformao com plasmdio Plasmdio de DNA

Integrao por recombinao

.J

~)

O plasmdio F se auto transfere convertendo as clulas receptaras em clulas masculinas F+ (Fig. 5.10). Se um fragmento do DNA cromossmico for incorporado ao plasmdio, ele passa a ser designado plasmdio F primo (F'). Quando ele se transfere em uma clula receptora, transporta esse fragmento consigo e tambm a converte em clulas masculina F'. Se a seqncia do plasmdio F for integrada ao cromossoma bacteriano, a clula denominada clula Hfr. Hfr significa alta freqncia de combinao (high frequency of recombination). O DNA transferido por conjugao no constitudo por uma dupla hlice, mas por uma molcula de filamento simples. A mobilizao se inicia quando uma protena codificada pelo plasmdio efetua uma clivagem stio-especfica de fila-

, "" Degradao

O O
Captao +do plasmdio

As clulas entram em contato, e o processo de conjugao se inicia

(~:~~:o
Fenda no filamento nico em OriT e ligao de protena na extremidade 5', iniciando a replicao em circulo

~
Fig. 5.9 Transformao bacteriana. O DNA estranho pode ser captado ou forado a penetrar em bactrias e a se incorporar em seu genoma ou se manter como um plasmdio. Esse processo "transforma" a bactria em um novo microrganismo.

DNA de filamento nico transferido, e ocorre sntese do filamento complementar

ram troca semelhante a uma troca sexual entre duas cepas mutantes de E. coli K12. A conjugao o processo pelo qual o DNA transferido diretamente por contato entre duas clulas, durante o acasalamento das bactrias. A conjugao resulta na transferncia unidirecional do DNA de uma clula doadora (ou macho) para uma clula receptora (ou fmea) atravs do pilus sexual. O tipo de unio (sexo) da clula depende da presena (masculino) ou ausncia (feminino) de um plasmdio conjugativo, como o plasmdio F de E. coli. O plasmdio F definido como conjugativo porque ele transporta todos os genes necessrios para a sua prpria transferncia, incluindo a capacidade de produzir os pili sexuais e iniciar a sntese do DNA na origem de transferncia (OriT) do plasmdio. Alm de E. coli, a transferncia ocorre em bacterides, estreptococos, streptomyces e clostrdios. Muitos dos grandes plasmdios de conjugao especificam colicinas ou resistncia a antibiticos.

As clulas se separam no final da transferncia

mento nico na OriT. A "marca" inicia a replicao do crculo, e o filamento linear deslocado direcionado para a clula receptora. O DNA de filamento nico transferido adquire uma nova estrutura circular e seu filamento complementar sintetizado. Uma importante propriedade do plasmdio F a sua capacidade de integrao ao cromossoma bacteriano, gerando uma clula Hfr. Essa integraao do plasmdio F envolve a quebra e a religao de ambas as molculas de DNA. Nas clulas Hfr, os genes envolvidos na mobilizao e transferncia ainda so expressos. Assim, a conjugao pode ainda ser iniciada por uma marca no stio OriT no cromossoma para transferir uma parte da seqncia do plasmdio seguida por DNA cromossmico e, s vezes, embora raramente, pelo restante do plasmdio F na outra extremidade do cromossoma. Seriam necessrios 100 minutos a 37C para transferir o genoma masculino completo para o receptor feminino. Entretanto, a frgil conexo entre os pares de bactrias geralmente quebrada e a transferncia interrompida antes de ser completada, o que explica por que apenas as seqncias cromossmicas adjacentes ao F integrado so habitualmente transferidas. Interrupes artificiais de um cruzamento entre um par Hfr e F- foram de utilidade para a construo de um mapa coerente do DNA cromossmico de E. cali. Nesses mapas, a posio de cada gene fomecida em minutos de acordo com o seu momento de entrada em uma clula receptora em relao a uma origem fixa (Fig.5.11). Os plasmdios conjugativos R (resistncia a antibitico) foram encontrados em bactrias gram-positivas como estreptococos, streptamyces e clostrdios. Em vez de utilizar pili, o par mantido junto por uma molcula de adesina presente na superfcie da clula doadora.

Transduo A transferncia gentica por transduo mediada por vrus bacterianos (bacterifagos) (Fig. 5.12), os quais apanham fragmentos de DNA e os empacotam dentro de partculas do bacterifago. O DNA liberado nas clulas infectadas e torna-se incorporado ao genoma bacteriano. A transduo pode ser classificada como especializada se os fagos em questo transferem determinados genes (geralmente aqueles adjacentes aos seus stios de integrao no genoma) ou generalizada

Infeco por fogo, degradao do DNA do hospedeiro

Replicoo do fogo

Organizao do DNA viral e bacteriano pelo fogo

Fogo de transduo

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pvrO pvrC porB

A
Integrao do DNA do doador.

clula sofre lise, o fogo infecta outra clula e libera O DNA da clula doadora

Fig. 5.11 Mapa cromossmico dos genes de Escherichia coli. Os nmeros representam o tempo (em minutos) necessrio para transferir segmentos de DNA da origem da primeira cepa Hfr. (Modificado de Bachmann BJ, Low KB, Taylor AL: BaeteriolRev 40:116-167, 1976.)

se a seleo das seqncias for aleatria devido a reunio acidental do DNA do hospedeiro no capsdio do fago. As partculas de transduo generalizada devem conter principalmente DNA bacteriano e pouco ou nenhum DNA do fago. Por exemplo, o fago Pl de E. coli codifica uma nuclease que degrada o DNA cromossmico do hospedeiro E. coli. Uma pequena percentagem das partculas resultantes do fago acondiciona os fragmentos de DNA em seus capsdios. O DNA encapsulado, em lugar do DNA do fago, injetado em uma nova clula hospedeira, onde pode se recombinar com o DNA homlogo do hospedeiro. As partculas transdutoras generalizadas so importantes no mapeamento gentico dos cromossomas bacterianos. Quanto mais prximos dois genes estiverem no cromossoma bacteriano, maior a probabilidade de co-transduo. Transposons Conjugativos

Recombinao
A incorporao do DNA em um cromossoma ocorre por re combinao. Existem dois tipos de recombinao: homlog e no-homloga. A recombinao homloga (legtima ocorre entre seqncias de DNA estreitamente relacionada e geralmente substitui uma seqncia por outra. O processl requer um conjunto de enzimas produzidas (em E. colz) pelo genes rec. A recombinao no-homloga (ilegtima) ocorr entre seqncias de DNA diferentes e, em geral, produz in seres, delees ou ambas. Esse processo, em geral, reque enzimas especializadas de recombinao (algumas vezes stio especficas), como as produzidas por muitos transposons bacterifagos lisognicos.

Engenharia Gentica
Os transposons podem transferir DNA no interior de uma clula de uma posio para outra no genoma ou do DNA cromossmico para um plasmdio ou vice-versa. Os transposons encontrados em bactrias podem ser divididos em trs classes: seqncia de insero, transposons cfiPexos e transposons fago-associados. Os elementos de seqncia de insero so os transposons mais simples; variam em comprimento de 150 a 1.500 pares de bases e possuem repeties invertidas de 15 a 40 pares de bases em suas extremidades (ver Fig. 5.8). As seqncias de insero transportam apenas a informao gentica necessria para a sua prpria transferncia (isto , o gene que codifica a transposase). As seqncias de insero podem ser detectadas quando se inserem em um gene e interrompem ou inativam o gene ou liberam a expresso do gene adjacente.

A engenharia gentica, tambm conhecida como tecnologi do DNA recombinante, utiliza as tcnicas e ferramentas d{ senvolvidas pelos geneticistas bacterianos para purificar, am plificar, modificar e expressar seqncias gnicas especfic A utilizao da engenharia gentica e da "clonagem" revoh: cionou a biologia e a medicina. As ferramentas bsicas da er genharia gentica so (1) vetores de clonagem, que podeI ser utilizados para liberar as seqncias de DNA nas bactr as receptivas e amplificar a seqncia desejada; (2) enzim~ de restrio, que so utilizadas para clivar o DNA reprod~ tvel em seqncias definidas (Quadro 5.1); e (3) DNA ligasl a enzima que une o fragmento ao vetor de clonagem. Os vetores de clonagem devem permitir a insero d DNA estranho, mas ainda devem ser capazes de se replic: normalmente na bactria hospedeira. Muitos tipos de vet< res so utilizados. Os plasmdios vetores, como pue, pBR32:

Microrganismo Acinetobaeter calcoaceticus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd H. influenzae sorotipo c, 1160 Providencia stuartii 164 Serratia marcescens S~aphylococcusaureus 3A Xanthomonas malvacearum

Enzima AccI BarnHI EcoRI HindIII HincII PstI SmaI Sau3AI XmaI

Stio de Reconhecimento 5' GTI@ CA CD

(X)

CB1AC TG

5' GIGATC C C CTAGIG 5'GIAATTC C TTAAIG 5' AIAGCT T T TCGAIA 5' G T (1) I (X) A C C A (X) Ct) T G 5' CiGCAIG GACGTC 5' C C C IGGG GGG CCC 5' IGA T C CTAGI 5' CICCGG G GGCCIC G