MEIOS DE CULTURA

At cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios lquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas culturas puras!, separando"as de espcies contaminantes# $eios de cultura consistem da associa%&o qualitativa e quantitativa de subst'ncias que (ornecem os nutrientes necess)rios ao desenvolvimento cultivo! de microrganismos (ora do seu meio natural# *endo em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, e+istem v)rios tipos de meios de cultura para satis(azerem as variadas e+ig,ncias nutricionais# Alm dos nutrientes preciso (ornecer condi%-es ambientais (avor)veis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como p., press&o osmtica, umidade, temperatura, atmos(era aerbia, microaerbia ou anaerbia!, dentre outras# /s meios de cultura s&o classi(icados quanto ao estado fsico em slidos, quando contm agentes solidi(icantes, principalmente )gar cerca de 1 a 0,0 1!2 semi-slidos, quando a quantidade de )gar e ou gelatina de 0,034 a 0,4 1, dando uma consist,ncia intermedi)ria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tens-es variadas de o+ig,nio ou a veri(ica%&o da motilidade e tambm para conserva%&o de culturas2 e lquidos, sem agentes solidi(icantes, apresentando"se como um caldo, utilizados para ativa%&o das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, dentre outros# /s meios de cultura podem ainda ser classi(icados quanto a procedncia dos constituintes em naturais ou complexos, quando usa ingredientes com composio qumica no definida, tais como e+tratos de vegetais malte, tomate, amido de tubrculos, peptona de so5a, etc#! de animais carne, crebro, (gado, casena, etc#! e de microrganismos levedura! e artificiais, sintticos ou ainda quimicamente definidos quando a composio qumica conhecida usados para trabalhos de pesquisa! e seus componentes servem para suprir as e+ig,ncias nutritivas dos microrganismos, em (ontes de carbono, nitrog,nio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando ent&o s&o conhecidas as necessidades nutricionais espec(icas# 6uanto a composi%&o qumica podem ser simples meios b)sicos! ou comple+os# Bsicos s&o aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satis(azer contudo nenhuma exigncia em especial 7+# caldo e )gar simples!# Especiais quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de in(us&o de crebro e cora%&o, )gar suco de tomate, )gar sangue, meio de 8oe((ler com soro bovino!, )gar chocolate agar simples (undido, adicionado de sangue e aquecido a 809:!, $eio de *arozzi com (ragmento de (gado " para anaerbios!, $eio de 8o;enstein, meios <hahidi =erguson >er(ringens <=>!, *riptose <ul(ito :iclosserina *<:! , ?aird">ar@er com gema de ovo! meios ricos ou meios enriquecidos com as subst'ncias citadas!, etc# !"etivos 7sta parte trata de (amiliarizar o aluno com o preparo e esteriliza%&o de meios de cultura, bem como conhecer e discutir a aplica%&o dos diversos tipos de meios de cultura#

APLICAO DOS MEIOS DE CULTURA

Ae acordo com a (inalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem ser classi(icados emB #eios de pr-enriquecimento - s&o aqueles que permitem a dessensibiliza%&o de microrganismos in5uriados, i#e#, para amostras que so(reram algum tipo de tratamento trmico ou qumico!# 7+# Cgua peptonada, caldo lactosado isolamento de salmonelas de leite em p!# #eios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em bai+os nDmeros ou de crescimento lento, bem como microrganismos e+igentes e (astidiosos# 7sses meios t,m a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas e+istem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros# 7+# :aldo *etrationato e <elenito":istina para cultivo de <almonelas lquidos!, :aldo *ioglicolato para Clostridium perfringens# $iferenciais " quando contm subst'ncias que permitem estabelecer di(eren%as entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de *eague ou 7osina Azul de $etileno di(erencial para coli(ormes!, Cgar $ac:on@eE para a di(erencia%&o de enterobactrias, Cgar sangue, agar ?aird">ar@er para isolamento e di(erencia%&o de cocos Fram positivos slidos!# %eletivos " os que contm subst'ncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros# 7+emploB meios com telurito de pot)ssio para isolamento de Corynebacterium diphtheriae!, )gar <almonella" <higella <<! e )gar $ac:on@eE, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 3,41 de cloreto de sdio, meio ?aird">ar@er, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibiticos para isolamento de diversos microrganismos *<:, <=>, , meio de ?laser, meio de <@irro;, etc#!# A maioria deles tambm di(erencial, permitindo di(erenciar as colGnias slidos! dos microrganismos# #eios de triagem " meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindo caracteriza%&o e identi(ica%&o per(unctria ou presuntiva de muitos microrganismos )gar trplice a%Dcar e (erro, meio Hnstituto Adol(o 8utz, uria, etc#!2 &dentificao " prestam"se para a realiza%&o de provas bioqumicas e veri(ica%&o de (un%-es (isiolgicas de organismos submetidos a identi(ica%&o meios /+ida%&oI=ermenta%&o, Cgar :itrato, :aldo nitrato, meio semi"slido, caldo tripto(ano, meio de <ul(ito Hndol $otilidade, etc#2 $osagem " empregados nas determina%-es de vitaminas, antibiticos e amino)cidos2 'ontagem " empregados para a determina%&o quantitativa da popula%&o microbiana Agar de :ontagem em >lacas, *<:, Agar ?atata Ae+trose, Cgar ?aird">ar@er, etc#!2 Estocagem ou manuteno " utilizados para conserva%&o de microrganismos no laboratrio, i#e# garantem a viabilidade de microrganismos Cgar <abouraud, $eios com leite, Cgar suco de tomate, Cgar sangue, Cgar <imples, meio semi"slido, etc#!#

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'aldo %imples - formulao. 7+trato de carne ############ 0,J g >eptona ######################### 1,0 g :lor7to de sdio ############ 0,4 g Cgua destilada ############## 100,0 ml / )gar simples obtido adicionando"se 1,0 a 1,4 1 de )gar")gar ao meio de caldo simples o meio pode (icar um pouco amolecido, a depender da qualidade do )gar!# Aumentando"se a concentra%&o de )gar para 0,01 o meio (ica bem slido e pode"se evitar que certos microrganismos se espalhem, como os Proteus# (reparao 1# >esar as subst'ncias e coloc)"las em um bquer a e+ce%&o do )gar! 0# Acrescentar a metade dos 100 ml de )gua destilada ou desmineralizada, medida com uma proveta J# Aissolver os ingredientes em )gua agitando continuamente com um bast&o de vidro ou com um agitador eltrico uso de barra magntica!, evitando a (orma%&o de espuma# Aps a (orma%&o de uma suspens&o homog,nea, completar o volume do meio com o restante da )gua K# 6uando necess)rio, dissolver os ingredientes do meio de cultura em banho"maria, vapor (luente em autoclave ou utilizando a chama do bico de ?unsen, ou chapa aquecedora eltrica, protegida com tela de amianto, ou ainda em (orno de microondas, at a ebuli%&o, agitando sempre# 7vitar o aquecimento desnecess)rio 4# =iltrar em papel de (iltro qualitativo para retirar as impurezas L# Meri(icar o p. atravs de potenciGmetro ou (ita indicadora de p. e a5ustar para 3,0 usando solu%&o de )cido l)tico 0,1 1! ou hidr+ido de sdio 1,0 N!, com pipeta de 1 mililitro, gote5ando aos poucos# / p. do Oagar simplesP a5ustado antes da adi%&o do )gar")gar 3# Aistribuir 40 ml do meio em tubos de ensaio 4 a 3 ml por tubo! 8# *amponar os tubos, proteg,"los com papel e amarr)"los com barbante Q# 7sterilizar em autoclave a 1019: 1 atmos(era de press&o! por 00 minutos# Aei+ar dois tubos sem esterilizar, incub)"los a J39: por 0K a K8 horas, para constatar a necessidade de esteriliza%&o# /bserva%&oB Alguns meios de cultura s&o preparados da mesma (orma, porm se (or necess)rio utilizar algumas subst'ncias termol)beis uria! ou que rea5am com as subst'ncias dos meios amino)cidos, a%Dcares!, as mesmas s&o esterilizadas R parte ou por (iltra%&o utilizando =iltro <eitz ou =iltros contendo membranas de nitrocelulose ou acetato de celulose! com poros de 0,00um de di'metro $illipore, <artorius!, e depois incorporadas, asspticamente, ao meio previamente esterilizado# Ainda, podem ser esterilizados por tindaliza%&o, tambm conhecida como esteriliza%&o (racionada 1009: por

1 hora por J dias consecutivos, intercalados por incuba%&o entre J0 a K49:!, ou a 1109: por 10 a 14 minutos, a depender do tipo e carga microbiana#

/gar %imples

1# Aos 40 ml de caldo simples restantes, acrescentar 0,4 a 1,0 g de )gar")gar 0# :olocar o bquer sobre uma tela de amianto a5ustada num trip met)lico tendo por bai+o o bico de ?unsen aceso! J# Aissolver o )gar no meio, me+endo sempre com um bast&o de vidro, para n&o aderir ao bquer, at a completa dissolu%&o, evidenciada pela aus,ncia de gr'nulos de )gar nas paredes do recipiente, tornando"se lmpido# Hsto somente se consegue com a ebuli%&o do meio K# :olocar em 7rlenmeEer, tampar, proteger com papel e barbante 4# 7sterilizar em autoclave a 1019: por 00 minutos L# Retirar do autoclave, es(ri)"lo a 40"309: e distribuir cerca de 14 a 00 ml por cada placa! em placas de >etri 14 + 100mm! estreis# /u ainda, caso necess)rio, colocar em banho" maria a K4"449:, adicionar 10 ml de sangue o+alatado de coelho ou de ovino Cgar <angue!, e distribuir em placas de >etri estreis# previamente esterilizadas!# <e antes da distribui%&o este meio (or aquecido a 809: at (icar de cor marrom, temos o Agar chocolate#

Funo das substncias do gar e Caldo simples

7+trato de carne " =onte de carbono org'nico, nitrog,nio, vitaminas e sais minerais e, nesse caso de energia >eptona S protena semi"digerida que serve como (onte de nitrog,nio :loreto de sdio " aumenta a press&o osmtica e mantm a isotonia do meio Cgar")gar " <ul(ato de )cido poligalacturGnico e+trado de v)rias espcies de algas do g,nero Gellidum e outras algas a(ins# *em como (un%&o solidi(icar os meios e n&o metabolizado por bactrias de interesse clnico# /bs# 1# A adi%&o de e+trato de levedura 0,41! e glicose 0,4 a 1,0 1! ao caldo simples enriquece o meio (ornecendo vitamina ?, (onte adicional de nitrog,nio e carbono, e pode at permitir o crescimento de alguns microrganismos e+igentes# 0# /s meios de cultura aps esteriliza%&o devem ser incubados em condi%-es ambientais temperatura e atmos(era! adequadas para veri(ica%&o da esterilidade >rova da esterilidade!# J# A estocagem dos meios de cultura esterilizados e es(riados deve ser (eita acondicionando"os invertidos, em sacos pl)sticos (echados, para reduzir a desidrata%&o dos mesmos, colocando"os em re(rigera%&o por, no m)+imo 14 dias#