Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Unidade de Novo Hamburgo Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Microbiologia Geral
Professora Dra. Jane Marlei Boeira

Angenor Geovani Auler Paola Tosi

Agosto/Setembro de 2013

Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Unidade de Novo Hamburgo Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Microbiologia Geral Aula prtica 1: Confeco de meio de cultura- Agar nutriente (20-05) Aula prtica 2: Isolamento de Microrganismos de diferentes ambientes (27-05) Aula prtica 3:Estudo macroscpico de colnias bacterianas e colorao de Gram (04-09) Experimento Cultura e identificao microbiana

Agosto/Setembro de 2013

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INDICE

Introduo.....................................................................................................4

Objetivos.......................................................................................................11

Metodologia..................................................................................................12

Resultados e discusso ...............................................................................14

Concluso ....................................................................................................16

Referncias ..................................................................................................17

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1. INTRODUO

Na natureza os microrganismos encontram-se formando populaes mistas. Por outro lado, o desenvolvimento da microbiologia assim como todos os procedimentos laboratoriais para o diagnstico, dependem da obteno edo crescimento dos microrganismos na forma de populaes puras, que quando crescidas em meios de cultura denominam-se culturas puras ou axnicas. A obteno de uma cultura pura a partir de uma cultura mista denomina-se isolamento, conseguido atravs da semeadura dos microrganismos na superfcie de meios de cultura slidos em placas de Petri, o que permitir a formao de colnias. (MENDONA & NASCIMENTO) O tamanho das bactrias da ordem micrmetros (m), podendo, no entanto, serem observadas em microscopia ptica, sendo que macroscopicamente podemos observar a formao morfolgica de suas

colnias.(http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf) O desenvolvimento de colnias til porque o tamanho e a aparncia destas costumam estar fortemente associadas espcie da bactria que compe. Quando uma populao mista cultivada adequadamente, pelo isolamento das colnias possvel identificar a colnia desejada, baseando-se nas suas caractersticas macroscpicas, como na figura abaixo.

Figura 1: Morfologia de colnias bacterianas

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Como todos os seres vivos, os microrganismos necessitam de nutrientes apropriados ao seu desenvolvimento, assim como condies fsicas ou ambientais favorveis. Quando cultivados em laboratrio, estas necessidades devem ser respeitadas. O meio de cultura, portanto, deve conter nutrientes em concentraes adequados ao crescimento do microrganismo que desejamos cultivar, alm das condies ambientais requeridas. (MENDONA & NASCIMENTO) Os meios de cultura so utilizados em trs diferentes tipos de consistncia: sob a forma lquida (denominados de meios lquidos ou caldos), slida (denominados de meios slidos ou solidificados, obtidos pela adio de Agar-agar ao meio) eeventualmente semi-slida (denominados de meios semi-slidos, obtidos pela adio de pequena quantidade de Agar-agar ao meio). (RIBEIRO & SOARES, 2005) Conforme j dito, o estudo dos microrganismos depende da obteno de uma grande quantidade de microrganismos idnticos (cultura pura), que so obtidos em laboratrio atravsdo isolamento a partir de uma populao mista. Para isto

devemos preparar meios de cultura estreis e conserv-los em condies estreis. Ao introduzirmos no meio estril o inoculo, teremos o cuidadotcniconecessrio paraqueno haja contaminao externa. (RIBEIRO & SOARES, 2005) Depois de inoculado, o meio de cultura contendo os microrganismos incubado em local apropriado e se for o caso, em local cuja temperatura seja controlada. Aps coletar a amostra do ambiente e seme-la na placa necessrio acompanhar o seu crescimento por 2-3 dias. No caso de haver crescimento de muitos microrganismos ser necessrio realizar isolamento por esgotamento para obter-se culturas puras. O crescimento significar o desenvolvimento de umapopulao a partir de uma ou algumas clulas. Este poder ser evidenciado a olho nu, sob a forma de turvao (em meio lquido) ou formao de colnias quando em meio slido. O isolamento feito de acordo com a proporo de microrganismos na amostra. Pode ser diretamente da amostra ou aps o enriquecimento. Os mtodos mais utilizados para o isolamento so por estrias (meio slido) ou por diluio (meio lquido). (MENDONA & NASCIMENTO)

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A tcnica de esgotamento consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma pequena alquota do material e depois espalh-lo em forma de estrias. Para fazer o esgotamento divide-se a placa em setores, conforme mostra a figura a seguir.

Figura 2: Tcnica de esgotamento Com o auxlio de uma ala de platina, deve-se espalhar o material em estrias, lembrando-se de no voltar a ala sobre a estria que j foi feita, de maneira a obter quantidades cada vez menores do material. (RIBEIRO & SOARES, 2005) O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

(http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42) Alguns procedimentos so essenciais na hora da preparao de cada meio de cultura para a obteno de melhores resultados e evitar contaminaes, como nos diferentes casos: quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos no precisam estar esterilizados; quando distribuir o meio aps a autoclavagem, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis e os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos tampas fechadas no permitem a entrada do vapor. Agar nutriente um meio relativamente simples, de fcil preparo e barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de microbiologia.

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 utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas exames bacteriolgicos e isolamento de organismos para culturas puras, conservao e manuteno de culturas em temperatura ambiente, como mtodo opcional para os laboratrios que no dispem do mtodo da criopreservao e observao da esporulao de espcies de bacilos Gram positivos. (http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html). Isolamento consiste na obteno de culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravsdaobservaodaproduodedeterminadoprodutooudamorfologiada (MENDONA & NASCIMENTO) Normalmente, as colnias de microrganismos se originam somente de uma clula ou esporo de microrganismo. Essas colnias apresentam caractersticas morfolgicasdiferentes,asquaispermitemadistinoentreosmicrorganismos, como colnia.

mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualizao das colnias independentes no meio slido, necessrio a distribuio uniforme das bactrias sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2005). De uma maneira geral, as bactrias podem ser observadas de duas formas, a primeira a fresco, atravs de observao de suspenso bacteriana entre lmina e lamnula, ou pela gota pendente, e a segunda atravs de um esfregao fixado e corado. (http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf) Geralmente, a observao a fresco utilizada para visualizao da mobilidade e morfologia de bactrias espiraladas (que podem ficar distorcidas se fixadas), ou mesmo em outras bactrias, para observar alteraes na diviso celular e formao de esporos. Neste caso, utiliza-se geralmente um microscpio de campo escuro, pois as bactrias ao microscpio de campo claro tendem a aparecer transparentes, sendo necessria, muitas vezes, a utilizao de filtros de densidade neutra para diminuir a intensidade luminosa e facilitar a visualizao.

(http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf) Quando utilizamos material fixado e corado, temos vrias vantagens, pois alm de as clulas ficarem mais visveis aps a colorao, podemos transportar estas lminas sem risco (pois o material est fixado), bem como diferenciar clulas

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de

afinidades

distintas

aos

corantes

de

morfologia

variada.

(http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42) O esfregao do material deve ser pouco espesso e homogneo. Deve ser feito em rea de segurana biolgica, a partir de um caldo preferencialmente, ou do material diludo em salina, espalhado com ala bacteriolgica em lminade vidro limpa, desengordurada e seca. Posteriormente, a lmina dever ser seca ao ar. Aps a secagem, o material dever ser fixado lmina, atravs do calor ou quimicamente. (RIBEIRO & SOARES, 2005) A maioria das bactrias tem afinidade por um grande nmero de corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados bsicos da anilina (azul de metileno, violeta de genciana, tionina, fucsina bsica, etc.). Quando fazemos uma colorao com apenas um corante e observamos a morfologia da bactria, chamamos de colorao simples. Quando utilizamos mais de um corante ou reagente, com o intuito de evidenciar diferenas entre clulas bacterianas, damos o nome de colorao diferencial ou seletiva. (http://pt.scribd.com/doc/61141376/praticas-micro-geral) Atravs do estudo das bactrias e de seu comportamento diante de diferentes corantes, verificou-se que h diferentes reaes caractersticas de determinados grupos bacterianos, o que facilita, neste caso, a identificao destes grupos, baseadana resposta da amostra ao determinado mtodo de colorao.

(http://pt.scribd.com/doc/61141376/praticas-micro-geral) Dentre os diferentes mtodos de colorao diferencial existentes, um dos mais adotados o Mtodo de Gram, desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram, em 1884. Tem como fundamento o fato de que as bactrias, quando coradas por derivados prximos da rosanilina (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta, etc.) e depois de tratadas pelo iodo (soluo iodo-iodetada, conhecida como lugol), formam um composto de colorao escura, entre o iodo e o corante, chamado iodopararosanilina. Este composto, nas bactrias Gram-positivas, fortemente retido e no pode ser facilmente removvel pelo tratamento posterior com o lcool, ao passo que nas Gram-negativas este composto facilmente descorado pelo lcool. (http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf)

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Aps a ao do lcool, feita uma segunda colorao pela safranina ou fucsina de Ziehl, diluda a 1/10. Neste caso, as bactrias Gram-negativas aparecero vermelhas, devido cor do corante de fundo, e as Gram-positivas aparecero roxas, pois conservam a cor do corante inicial (Figura 3)

(http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf)

Figura 3: Colorao de Gram

Esta distino muito importante na sistemtica bacteriana e ocorre com base nas diferenas existentes na parede celular das bactrias Gram-positivas eGram negativas. Todavia, importante sempre utilizar culturas jovens para no haver resultados.http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf A parede celular bacteriana composta de uma rede macromolecular denominada peptideoglicana, que est presente isoladamente ou em combinao com outras substancias. A peptideoglicana consiste de um dissacardeo repetitivo unido por polipeptdios para formar uma rede que circunda e protege a clula. A poro dissacardica composta por monossacardeos denominados falsos

Nacetilglicosamina (NAG) e cido Nacetilmurmico (NAM). (TORTORA et al., 2005). Na maioria das bactrias grampositivas, a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicana, formando uma estrutura rgida. Alm disso, contm

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cidos teicicos, que consistem primariamente de um lcool e fosfato. (TORTORA et al., 2005). As paredes celulares das bactrias gram-negativas consistem de uma ou algumas camadas de peptideoglicana e uma membrana externa. A peptideoglicana est ligada a lipoprotenas na membrana externa e est no espao periplasmtico, um espao entre a membrana externa e a membrana plasmtica. As paredes gramnegativas no possuem cidos teicicos, mas sim de lipopolissacardeos (LPS) e fosfolipdios. (TORTORA et al., 2005).

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2. OBJETIVOS

Confeccionar o meio de cultura Agar- nutriente, a fim de cultivar microorganismos coletados de gua de vertente e maaneta de armrio.Estes microorganismos devero ter a morfologia de suas colnias identificas, e, utilizando a colorao de Gram, classificadas em Gram positivas ou Gram negativas.

Identificao macroscpica de colnias de bactrias e microscpica de bactrias isoladas a partir de coletas feitas em gua de vertente e maaneta de armrio, cultivadas em meio de cultura Agar nutriente.

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3. METODOLOGIA

Para a realizao do experimento necessita-se dos seguintes equipamentos e materiais: Erlenmeyer de 250 ml Algodo Autoclave Placas de Petri esterilizadas Cmara de fluxo laminar Peptona (5 g/l); Agar (15 g/l); gua destilada 300 ml Cotonete esterilizado Lupa Microscpio tico Lmina para microscpio leo de imerso Corante cristal violeta Lugol lcool acetona Fucsina Ala de platina Na primeira aula prtica, referente ao dia 20-08, preparou-se o meio de cultura (Agar - nutriente). Aps a pesagem, obteve-se 1,5062 g de peptona, 4,4923 g de Agar, para diluir nos 300 ml de gua destilada. O pH deve ficar em 6,8 (+/-0,2). O Erlenmeyer contendo a soluo vedado com algodo.

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Aps esta etapa, o meio autoclavado 121C, 1atm de presso por 15 minutos, e ento, aps chegar temperatura de 40C distribudo nas placas de Petri, na capela de fluxo laminar. Aps o meio solidificar, as placas so seladas, identificadas (com nome, data e disciplina) e guardadas na geladeira at a aula seguinte. Na 2a aula prtica, referente ao dia 27-08 foram coletados os microorganismos de uma garrafa pet contendo gua de vertente e da maaneta da porta de um armrio, com auxlio de um cotonete esterilizado. Os micro-organismos foram semeados na placa de Petri com o meio de cultura preparado na aula anterior, na cmara de fluxo laminar, e incubado em estufa a 37C, devendo ficar ali por 2-3 dias, quando devero ser guardados em geladeira. Na 3a aula prtica, o primeiro procedimento foi visualizar o crescimento microbiano ocorrido nas placas. As placas so suspensas, observando (em diferentes ngulos, inclusive com auxlio de lupa) as colnias formadas. Caractersticas como a forma, elevao e margens das colnias so anotadas. Outra parte da identificao bacteriana consiste na colorao de Gram, que inicia com a preparao da lmina. Com o auxlio de uma ala platinada esterilizada coloca-se uma pequena gota de gua destilada estril em uma lmina. Flamba-se a ala, e aps esfriar coleta-se uma pequena amostra de uma colnia de bactria sobre a gota de gua na lmina fazendo uma pequena suspenso, espalhando para obter uma suspenso homognea. Em seguida, para fazer a fixao, passa-se a lmina pela chama do bico de bunsen (2 ou 3 vezes). Deixa-se esfriar o esfregao, passando a realizar ento a colorao de Gram, que segue os seguintes passos. Cobrir o esfregao com soluo cristal violeta, deixando agir por 1 minuto; Escorrer o excesso de corante, lavando a lmina em um filete de gua corrente; Cobrir a lmina com lugol, deixando agir por 1 minuto e 30 segundos; Escorrer o lugol na pia e lavar a lmina em um filete de gua corrente; Gotejar lcool-acetona sobre a lmina at que no haja mais desprendimento do corante (em torno de 30 segundos);

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Lavar a lmina rapidamente em um filete de gua corrente; Deixar a lmina secar ao ar livre. A prxima etapa consiste em visualizar a lmina no microscpio. Para isto,

inicialmente, coloca-se a lmina no microscpio, iniciando a visualizao com a menor resoluo. Aps focalizar o que se pretende visualizar pode-se aumentar gradativamente a resoluo at alcanar a resoluo de 100X, onde se torna necessrio adicionar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

Para lacrar o Erlenmeyer contendo o meio de cultura preparado utilizou-se um punhado dealgodo, que permite uma boa esterilizao do interior do Erlenmeyer, no sendo necessrio a vedao deste, uma vez que a sobreposio das fibras do algodo permitem as trocas gasosas sem deixar haver contaminao do meio, devido ao pequeno tamanho dos poros deixados. Analisando macroscopicamente o resultado da semeadura microbiana nas placas de Petri pode-se constatar que da maaneta do armrio obteve-se fungos, e da gua de vertente obteve-se ao menos 4 espcies de bactrias. Destas 4 espcies, 2 apresentaram forma circular e 2 apresenta forma irregular, e ambas apresentaram margem inteira. Quanto elevao, somente 1, de forma irregular, apresentou formato convexo, enquanto as demais tinham elevao plana. Tambm pde-se observar a colorao da colnias (2 brancas, 1 amarela e 1 amarela transparente.). Para a anlise microscpica, selecionaram-se clulas da colnia de forma irregular, elevao convexa e cor branca. A anlise microscpica demonstrou se tratar de uma bactria filamentosa Gram-negativa, conforme figura abaixo:

Figura 4: Foto resultante da microscopia da amostra bacteriana selecionada

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5. CONCLUSO

Com as respectivas prticas realizadas conclui-se que h uma real eficcia na colorao de gram para identificar microorganismos e classifica-los, conforme suas caractersticas morfolgicas, bem como o meio desenvolvido para o crescimento bacteriano se mostrou suficiente.

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6. REFERNCIAS

Amendoeira, M. R. R. Caputo, L. F. G. Molinaro, E. M. Conceitos e Mtodos para Formao de profissionais em Laboratrios de Sade, disponvel em <http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf> acesso em 07 Set. 2013. 237-241p.

MENDONA, S. C.; NASCIMENTO, C. Microbiologia Industrial CEFET- PE. Cultivo de microrganismos e laboratrio, s/d, p. 1-6.Disponvel em: <recife.ifpe.edu.br/recife/Isolamento_Microrganismos.doc > Acesso em: 31 Ago. 2013.

Nicsio,

R.

G.

Meios

de

Cultura.

Disponvel

em acesso

<http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html> em 31 Ago. 2013

RIBEIRO, Mariela C.; SOARES, Maria M. S. R. Microbiologia prtica: Roteiro e Manual: Bactrias e Fungos. 1 ed. So Paulo: Atheneu, 2005. 3,5,6,7,8 p.

Tortora,G.J., Funke, B.R., Case, C.L. Microbiologia 8a edio: Editora Artmed, 2005. 54-68 p. Departamento de Microbiologia ICB/UFMG. Procedimentos bsicos em microbiologia: tcnicas asspticas e cultivo de microrganismos. Disponvel em: <http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42>.

Acesso em: 31 Ago. 2013. Roteiro de aulas prticas- Microbiologia Geral, Universidade Federal Fluminense, disponvel em <http://pt.scribd.com/doc/61141376/praticas-microgeral> Acesso em 20 Ago. 2013 2,8,9,10,16,17,18,19 p Figura 1 disponvel em:

<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAXDUAH/isolamentomicrorganismos>.Acesso em 01 Set. 2013. Figura 2 disponvel em

<http://microbiosamigos.blogspot.com.br/2007/09/tcnica-de esgotamento.html>. Acesso em 01 Set. 2013

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Figura 3 disponvel em: <http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-degram/>. Acesso em 07 Set. 2013

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