Lsectrofotometrlu

Msc. Lunlelle Ruchel

zcz
* Termo espectro utilizado inicialmente por Newton;
* Descoberta: Luz branca, ao atravessar um prisma,
dividida em vrias cores;
* A luz definida como uma forma de energia
eletromagntica, formada por ondas que apresentam
comprimentos diferentes.
ESPECTRO
* O comprimento de onda medido em nm;
* 1,0 nm equivale a 10
-9
m;
ESPECTRO
* Regies do espectro em funo do comprimento de onda
Regio Comprimento de onda (nm)
Raios X 0,1 a 100
Ultravioleta 100 a 400
Visvel 400 a 800
Infravermelho 800 a 5.000
Micro-onda 5.000 a 30.000
* Espectrofotometria ptica
- Comprimento de onda corresponde a luz visvel ou ultra-
violeta:
Faixa entre aproximadamente 100 a 800 nm!
Absoro de 8adlao
* vrlos fenmenos podem ocorrer com a radlao lumlnosa,
como: reexo, refrao, espalhamenLo ou ser !"#$%&'(!
pelo maLerlal.
* As substncias qumicas tem a capacidade de absorverem
luz em determinados comprimentos de onda;
* Fat o ut i l i zado par a s ua DETERMI NAO
QUANTITATIVA E QUALITATIVA;
* Por que?
* O espectro de absoro caracterstico para determinada
substncia;
* Quantidade de absoro (intensidade) dependente da
concentrao do composto.
* Os comprimentos de onda que uma certa substncia
absorvero so caractersticos da sua estrutura, diferindo
de substncia para substncia.
DNA e RNA = 260nm
Protenas = 280nm
Clulas bacterianas= 600nm
* a medida de absoro ou transmisso de luz;
* uma das mais valiosas tcnicas analticas amplamente
utilizadas em laboratrios de anlises clnicas;
* Exemplos de aplicao:
- Determinao de atividade enzimtica;
- Dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos;
Se dosa o produto colorido obtido por reao qumica!

ESPECTROFOTOMETRIA
* Tcnica baseia-se em:
- Quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma
soluo com molculas absorventes, parte da luz
absorvida pela soluo e o restante transmitido;
- Absoro de luz depende:
Concentrao das molculas absorventes
Espessura da soluo caminho ptico
Utilizar feixe de luz monocromtica de comprimento de onda
adequado, capaz de excitar o composto estudado.
* Beer (1852): Relao entre a transmisso e concentrao
do meio onde passa o feixe de luz.
- Determinada soluo absorve a luz proporcionalmente
concentrao molecular do soluto!
- A intensidade de um feixe de luz monocromtico
decresce medida que a concentrao da substncia
absorvente aumenta aritmeticamente".
* Anlise quantitativa em espectrofotometria realizada
atravs da Medida da Absorbncia;
* Segue lei de Lambert- Beer!
Lel de Lumbert8eer
* Atravs dessa lei, intensidade da radiao incidente e
emergente podem ser relacionadas com as concentraes
do material presente na soluo.
* Efeitos de reflexo, refrao e espalhamento no so
considerados nessa lei.
* A radiao incidente deve ser monocromtica
* Na bioqumica:
Espectrofotmetro
- Instrumento que serve para medir a intensidade da luz
em funo de um comprimento de onda especfico;
- Para medidas de absoro de luz visvel e ultravioleta
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lontes Lumlnosus
* Luz uv
* Lmpada de gs hldrognlo
* Mercurlo
* Luz vlslvel
* 1ungsLnlo
Cubetus
* LspecLrofoLomeLrla de Luz vlslvel
* CubeLa de vldro ou lsuco
* LspecLrofoLomeLrla de Luz ulLra- vloleLa
* CubeLa de CuarLzo
CURVA DE CALIBRAO PADRO
* Mostra relao entre concentrao do soluto e
absorbncia;
* Se houver proporcionalidade entre a absorbncia e a
concentrao da substncia, pode-se determinar a
concentrao da substncia em amostras de concentrao
no conhecida com base numa curva de calibrao;
* Para plotar curva padro = Necessria a leitura de pelo
menos quatro pontos!
* Ao menos em triplicata para cada ponto!
* Para elaborao:
- Soluo padro (concentrao conhecida);
- Referncia na determinao fotomtrica de concentraes
desconhecidas da mesma substncia;
* Ex: soluo padro de albumina 10 mg/mL


8runco
z mgjmL
mgjmL 6 mgjmL 8 mgjmL c mgjmL
* Obter os valores de Absorbncia;
* Relacionar os valores de Absorbncia (ordenada) com as
concentraes dos padres (abcissa);
* Ajuste dos pontos experimentais feito com uma reta;


z c 6 8
c
c
c,
c,
c,z
c,
c,
* lutor de Cullbruo (lC)
FC = Concentrao padro/ absorbncia do padro
Concentrao da amostra = absorbncia da amostra x FC


Concentrao padro = 200 mg/dL
Absorbncia do padro = 0,347
Absorbncia da amostra = 0,301

FC= 200/0,347 = 576,36
Concentrao da amostra = 0,301 x 576,36
173,48 mg/dL