5 - CINTICA DE FORMAO DE PRODUTO Formao de produto metablito pode ser relacionada a consumo de nutriente.

Alm do mais, formao de produto no pode ocorrer sem a presena de clulas. Assim, esperado que crescimento e formao de produto esto intimamente relacionados utilizao de nutrientes que dependendo dos controles metablitos regulatrios, formao de produto ser ligada a crescimento e/ou concentrao celular. A relao cintica entre crescimento e formao de produto depende do papel do produto no metabolismo celular. As duas cinticas mais comuns so aquelas que descrevem a sntese do produto durante o crescimento e aps o crescimento ter cessado. Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento inicialmente ocorre sem formao de produto, mas aps algum perodo de tempo o produto comea a aparecer enquanto o crescimento continua. X X X [ ] [ ] [ ]

(a)

(b)

(c)

No grfico (a), a formao de produto associado ao crescimento celular. No grfico (b), temos formao de produto associado ao crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formao de produto parcialmente associada ao crescimento. No grfico (c), temos formao de produto no associada ao crescimento. A velocidade de formao de produto a derivada de P em cada ponto dP/dt. Da mesma forma que dX/dt e dS/dt no usado, dP/dt (velocidade de formao de protuto) pode ser transformada em Velocidade Especfica de Formao de Produto (p) que definido da seguinte maneira:

p=
onde:

1 dP X dt

P = concentrao de produto (g/L) X = concentrao celular (g/L) t = tempo (h) p = velocidade especfica de consumo de nutrientes (h-1)

uma vez admensionalizados pelos seus valores mximos max e pmax, podemos mostrar graficamente:

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/max 1 p/pmax 1

/max p/pmax

(d)

t /max 1

(e)

p/pmax

(f)

Os grficos acima mostram: (d) formao de produto associada ao crescimento; (e) formao de produto parcialmente associada ao crescimento e (f) formao de produto no associada ao crescimento.

6 - FATORES DE CONVERSO Crescimento e formao de produto por microrganismos so processos de bioconverso nos quais os nutrientes qumicos alimentados fermentao so convertidos a massa celular e metablitos. Cada uma dessas converses pode ser quantificada por um coeficiente de rendimentos, expresso como massa de clula ou produto formado por unidade de massa de nutriente consumido, Yx/s e Yp/s, para clula e produto, respectivamente. Assim, o coeficiente de rendimento representa a eficincia de converso. Nos processos cujo produto a clula (ex. obteno de levedura de panificao) o grfico representativo da fermentao mostrado abaixo

[] s
X

P X

s
tempo

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onde maximizado o crescimento celular e minimizado a formao de subprodutos. O coeficiente de rendimento de clula por nutriente torna-se Yx/s = X/S Nos processos cujo objetivo a formao de um produto e no a clula (ex. obteno de etanol, antibiticos) o grfico representativo da fermentao mostrado abaixo

[] s
P

X P

s
tempo

onde maximizado a formao de produtos e minimizado o crescimento celular. O coeficiente de rendimento do produto por nutriente ser: Yp/s = P/S A maneira usual de calcular rendimentos medir a massa celular ou produto produzido e substrato consumido sob um perodo de tempo e calcular Yx/s e Yp/s. Obs.: Quando no meio h mais de um substrato de carbono, considera-se o substrato limitante do crescimento.

7 - INFLUNCIA DA CONCENTRAO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECFICA DE CRESCIMENTO. Durante a maioria das fermentaes descontnuas tpicas, a velocidade especfica de crescimento constante e independente da concentrao de nutrientes que est variando. Todavia, velocidade de crescimento, como uma velocidade de reao qumica, uma funo da concentrao de compostos qumicos. Os compostos qumicos nesse caso so os nutrientes essenciais para o crescimento. A forma da relao entre
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velocidade de crescimento e concentrao de nutriente foi observada em 1949 por Monod, sendo similar cintica de saturao exibida por adsoro monomolecular de Langmuir. O modelo de Monod tem a forma: = vel. especfica de crescimento; = max. S KS + S max = vel. espec. de crescimento mximo; S = concentrao de nutriente; KS= constante de saturao e igual a S, quando = 0,5.max
.

(h-1) mx

0,5mx

KS

concetrao de S

Outra forma grfica de determinar as constantes da equao de Monod chamado Lineweaver-Burk, resultando da inverso da equao de Monod. 1 = KS max 1/ KS/mx

1 + S

1 mx

Interpolao -1/KS

1/mx 1/S

Alguns valores para Ks no modelo de Monod para crescimento Nutriente Glicose Glicose Glicose KS (mg/L) 1,0 2,0-4,0 25,0 Microrganismo Enterobacter aerogenes Escherichia coli Sacharomyces cerevisiae
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Observaes: a) Os valores de Ks so muito pequenos em relao concentrao do nutriente nas fermentaes industriais. b) max, quando S> 10 KS c) para S< 10 KS, uma forte funo da concentrao de nutriente. d) Durante a fase exponencial constante . 8 - EVOLUO DE CALOR DURANTE A FERMENTAO A evoluo de calor durante a fermentao est intimamente relacionada utilizao da fonte de carbono e energia. a) Quando a fonte de carbono est sendo ativamente incorporada massa celular via crescimento, tipicamente cerca de 40-50% da entalpia disponvel conservada na biomassa e o restante, perdido como calor (5060%). b) Quando a fonte de carbono est sendo metabolizada para manuteno celular, toda a entalpia associada com combusto desprendida como calor. c) Se um produto est sendo formado, ento o calor envolvido por unidade de fonte de carbono metabolizada est entre os dois extremos. O interesse na evoluo do calor est na necessidade de remov-lo durante o processo de fermentao e da utilidade do calor como indicador da viabilidade metablica.

9 - INFLUNCIA DO AMBIENTE NO CRESCIMENTO CELULAR A habilidade de um microrganismo crescer e sintetizar produtos em um dado ambiente determinado pelo microrganismo (m.o). O desenvolvimento bem sucedido de processos de fermentao dependente, primeiro da obteno de boas linhagens por isolamento e mutao, segundo, dos parmetros ambientais no crescimento celular e formao de produto, tais como: 9.1 Efeito da Temperatura no Crescimento Celular Crescimento microbiano e formao de produto so resultados de uma complexa srie de reaes qumicas. Como elas, eles so influenciados pela temperatura da seguinte forma: Trs tipos de curvas crescimento-temperatura normalmente ocorrem:

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Psicrfilos /max

Mesfilos

Termfilos

10
o

20

30

40

50

60

70

(To)

A maioria dos m.os crescem num intervalo de temperatura entre 20 e 40 C. A velocidade de crescimento cresce rapidamente quando a temperatura aumenta at a temperatura tima, mas a partir dessa, o crescimento cai tambm rapidamente. A maioria dos m.o. apresenta o seguinte comportamento:

Morte max

Crescimento

(1/T) pode ser dado pela equao de Arrhenius: = Ae-Ea/RT = Ae-Ea/RT A e A = constante (h-1) Ea e Ea = energia de ativao (cal/mol) R = 1,98 cal/mol K T = temperatura (K) = velocidade especfica de morte (h-1). = velocidade especfica de crescimento (h-1) A energia de ativao para crescimento varia de 15-20kcal/mol e para morte de 60-70kcal/mol. Assim a velocidade especfica de morte muito mais sensvel temperatura que a de crescimento. A temperatura tambm pode afetar outros aspectos importantes do crescimento microbiano como Yx/s. Na produo de biomassa o importante

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atingir a mxima converso de substrato massa celular. Assim o coeficiente de rendimento Yx/s celular de principal interesse. Esse coeficiente de rendimento mostrado na figura a seguir para crescimento de bactrias em metanol, em funo da temperatura. Yx/s

45

50

55

60

65

T(oC)

9.2 Efeito do pH no Crescimento Celular pH do meio afeta o crescimento e a formao de produtos. Os m.os. trabalham com uma variao mxima de 3 a 4 unidades de pH do valor timo. E a velocidade mxima de crescimento se d para intervalos de 1 a 1,5 unidades de pH max Escherichia coli (bactria)

Ex.:

5,0

6,0

7,0

8,0 9,0

10,0

pH

Bactrias pH 4 8 Leveduras pH 3 6 Mofos pH 3 7 Procaiotos superiores pH 6,5 7,5 Como consequncia o pH deve ser controlado nos seus valores timos para melhorar a performance do processo. Durante a fermentao, o pH tem uma tendncia a mudar por vrias razes. Quando a fonte de N um sal de amnio NH4+ o m.o. incorpora da forma R-NH3+ liberando H+, portanto o pH diminui.
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Quando a fonte de N NO3-, o m.o. remove H+ do meio para reduzir o NO3- a R-NH3+ logo o pH aumenta. Outra razo para variao do pH ocorre quando cidos orgnicos so produzidos (cido ltico, pirvico, actico e etc.). Atravs da medida do cido ou lcali adicionado para neutralizar a mudana de pH, possvel obter informaes sobre crescimento (X) e formao de produto (P). A figura abaixo mostra a relao entre a massa de NH4OH adicionado ao cultivo para controle de pH e a concentrao celular. O m.o. utilizado foi E. coli BL21(DE3)pLysS para produo da protena recombinante Troponina C X (g/L) X = 0,68 + 0,85(NH4OH) E. coli BL21(DE3)pLysS

NH4OH (g)

60