P r o c . N a t L A c a d . S c i .

U S A
V o l . 8 0 , p p . 1 7 1 2 - 1 7 1 6 , M a r c h 1 9 8 3
M e d i c a l S c i e n c e s
A l l e r g e n c h a l l e n g e o f l u n g t i s s u e f r o m a s t h m a t i c s e l i c i t s b r o n c h i a l
c o n t r a c t i o n t h a t c o r r e l a t e s w i t h t h e r e l e a s e o f
l e u k o t r i e n e s C 4 , D 4 , a n d E 4
( b r o n c h i a l s m o o t h m u s c l e r e a c t i v i t y / s l o w r e a c t i n g s u b s t a n c e o f a n a p h y l a x i s / a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m / a i r w a y a n a p h y l a x i s /
b r o n c h i a l a s t h m a )
S V E N - E R I K D A H L I N * t , GOR A N H A N S S ON t , P E R H E D Q V I S T * , T H U R E B J OR C K * , E L I S A B E T H GR A N S T R OM t ,
A N D B A R B R O D A H L I N
D e p a r t m e n t s o f * P h y s i o l o g y , W P h y s i o l o g i c a l C h e m i s t r y , a n d I T h o r a c i c M e d i c i n e , K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t , S - 1 0 4 0 1 S t o c k h o l m , S w e d e n
C o m m u n i c a t e d b y U . S . v o n E u l e r , D e c e m b e r 6 , 1 9 8 2
A B S T R A C T T h e l e u k o t r i e n e s C 4 , D 4 , a n d E 4 , p r e v i o u s l y r e -
f e r r e d t o a s s l o w r e a c t i n g s u b s t a n c e o f a n a p h y l a x i s , e l i c i t e d l o n g -
l a s t i n g c o n t r a c t i o n s o f b r o n c h i i s o l a t e d f r o m t w o b i r c h p o l l e n - s e n -
s i t i v e a s t h m a t i c s . T h e l e u k o t r i e n e s w e r e 1 , 0 0 0 t i m e s m o r e p o t e n t
o n a m o l a r b a s i s t h a n w a s h i s t a m i n e o r p r o s t a g l a n d i n F 2 a . M o r e -
o v e r , a l l e r g e n r e l e a s e d l e u k o t r i e n e s C 4 , D 4 , a n d E 4 f r o m t h e l u n g
t i s s u e o f t h e a s t h m a t i c s i n a m o u n t s t h a t a p p e a r e d t o c o r r e l a t e w e l l
t o t h e a n a p h y l a c t i c b r o n c h i a l c o n t r a c t i o n . I r r e s p e c t i v e l y o f w h e t h e r
t h e l u n g w a s s t i m u l a t e d w i t h s p e c i f i c a l l e r g e n , t h e i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7
o r " 4 C - l a b e l e d a r a c h i d o n i c a c i d , 1 5 - h y d r o x y i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ,
a n d o t h e r l i p o x y g e n a s e - d e r i v e d m o n o h y d r o x y a c i d s w e r e t h e m a -
j o r m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d i n t h e l u n g , a n d t h r o m b o x a n e
A 2 a n d p r o s t a g l a n d i n 1 2 w e r e t h e p r e d o m i n a n t c y c l o o x y g e n a s e
p r o d u c t s i d e n t i f i e d . H o w e v e r , c y c l o o x y g e n a s e i n h i b i t i o n w i t h i n -
d o m e t h a c i n h a d n o e f f e c t o n t h e c o n t r a c t i o n r e s p o n s e t o a n t i g e n
i n t h e b r o n c h i , w h e r e a s , i n t h e p r e s e n c e o f U - 6 0 2 5 7 , a n i n h i b i t o r
o f l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s , t h e a l l e r g e n n e i t h e r r e l e a s e d l e u k o -
t r i e n e s f r o m t h e l u n g n o r c a u s e d b r o n c h i a l c o n t r a c t i o n . T h e s e
f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t l e u k o t r i e n e s C 4 , D 4 , a n d E 4 a r e m a j o r m e -
d i a t o r s o f a l l e r g i c b r o n c h o c o n s t r i c t i o n i n m a n .
S l o w r e a c t i n g s u b s t a n c e o f a n a p h y l a x i s ( S R S - A ) h a s l o n g b e e n
c o n s i d e r e d t o b e a n i m p o r t a n t m e d i a t o r o f t h e b r o n c h o s p a s m i n
a l l e r g i c a s t h m a ( 1 ) . F u r t h e r m o r e , i t h a s r e c e n t l y b e c o m e e v i -
d e n t t h a t S R S - A i n f a c t c o n s i s t s o f t h r e e c l o s e l y r e l a t e d a r a c h -
i d o n i c a c i d d e r i v a t i v e s , t h e c y s t e i n y l - c o n t a i n i n g l e u k o t r i e n e s C 4
( L T C 4 ) , D 4 ( L T D 4 ) , a n d E 4 ( L T E 4 ) ( c f . r e f . 2 ) ( F i g . 1 ) . T h e s e
t h r e e l e u k o t r i e n e s a r e o u t s t a n d i n g b r o n c h o c o n s t r i c t o r s ( 3 - 8 ) a n d
p o t e n t i n d u c e r s o f t i s s u e e d e m a ( 4 , 5 , 9 ) - p e r t u r b a t i o n s t h a t
i n d e e d p l a y a m a j o r r o l e i n t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f b r o n c h i a l
a s t h m a . S o f a r , h o w e v e r , i t h a s n o t b e e n k n o w n w h e t h e r l e u -
k o t r i e n e s a r e f o r m e d i n t h e l u n g s o f a s t h m a t i c s .
H e r e w e r e p o r t f i n d i n g s w i t h l u n g t i s s u e o b t a i n e d f r o m t w o
a s t h m a t i c p a t i e n t s s p e c i f i c a l l y s e n s i t i v e t o b i r c h p o l l e n . T h e e f -
f e c t o f a n t i g e n c h a l l e n g e o n a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m i n t i s -
s u e s a m p l e s a n d t h e c o n t r a c t i l e e f f e c t s o f l e u k o t r i e n e s a n d s p e -
c i f i c a l l e r g e n i n b r o n c h i f r o m t h e s a m e p a t i e n t s w e r e c o n s i s t e n t
w i t h t h e p o s s i b i l i t y t h a t L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 a r e m a j o r m e -
d i a t o r s o f a l l e r g e n - i n d u c e d b r o n c h o c o n s t r i c t i o n i n m a n .
M A T E R I A L A N D M E T H OD S
M a t e r i a l s . L e u k o t r i e n e s w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y B . S a m -
u e l s s o n ( K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t ) ; U - 6 0 2 5 7 ( 6 , 9 - d e e p o x y - 6 , 9 -
( p h e n y l a m i n o ) - A 6 ' 8 - P GI 1 ) ( 1 0 ) , P GB 2 , a n d P GF 2 < , , b y M . K . B a c h
a n d J . P i k e ( U p j o h n ) ; a n d F P L 5 5 7 1 2 , b y F i s o n s , E n g l a n d . [ 1 -
1 4 C ] A r a c h i d o n i c a c i d ( 5 6 m C i / m m o l ; 1 C i
=
3 . 7 x 1 0 1 0 B q ) a n d
[ 5 , 6 , 8 , 9 , 1 1 , 1 2 , 1 4 , 1 5 - 3 H ] a r a c h i d o n i c a c i d ( 1 3 1 C i / m m o l ) w e r e
p u r c h a s e d f r o m t h e R a d i o c h e m i c a l C e n t r e ; b i r c h p o l l e n ( S p e c -
t r a l g e n ) w a s f r o m P h a r m a c i a , U p p s a l a , S w e d e n ; h o r s e d a n d e r
a n d t i m o t h y ( A l l p y r a l ) w e r e f r o m M e d a D o m e , Go t e b o r g , S w e -
d e n ; a n d i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 w a s f r o m C a l b i o c h e m - B e h r i n g .
A c e t y l c h o l i n e c h l o r i d e , a d e n o s i n e , h i s t a m i n e d i h y d r o c h l o r i d e ,
m e p y r a m i n e ( p y r i l a m i n e - m a l e a t e ) , i n d o m e t h a c i n , a n d s e r o -
t o n i n w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a .
L u n g T i s s u e . A p p r o x i m a t e l y 2 0 0 g w e t w e i g h t ( w w ) o f m a -
c r o s c o p i c a l l y n o r m a l l u n g w a s o b t a i n e d f r o m t w o a s t h m a t i c s
u n d e r g o i n g s u r g e r y b e c a u s e o f b r o n c h i a l c a r c i n o m a . B o t h p a -
t i e n t s , a 5 3 - y e a r - o l d w o m a n a n d a 4 5 - y e a r - o l d m a n , h a d s u f f e r e d
f r o m a l l e r g i c a s t h m a f o r a t l e a s t 1 0 y e a r s . B i r c h p o l l e n s e n s i t i v i t y
w a s i n d i c a t e d b y c a s e h i s t o r i e s , p o s i t i v e i n t r a c u t a n e o u s r e a c -
t i o n s t o b i r c h p o l l e n , a n d t h e p r e s e n c e o f s p e c i f i c I g E i n s e r u m .
N e i t h e r p a t i e n t w a s o n a s t h m a m e d i c a t i o n a t t h e t i m e o f s u r -
g e r y .
Or g a n B a t h E x p e r i m e n t s . C o n t r a c t i o n s o f h e l i c a l l y c u t b r o n c h i
( d i a m e t e r , 2 - 4 m m ) w e r e r e c o r d e d i s o m e t r i c a l l y u n d e r n o n f l o w
c o n d i t i o n s ( 3 ) . P a r e n c h y m a l s t r i p s o f g u i n e a p i g l u n g w e r e u s e d
f o r b i o a s s a y o f l e u k o t r i e n e s ( 7 ) .
I n c u b a t i o n C o n d i t i o n s . S p e c i m e n s ( 1 5 g ) o f c h o p p e d l u n g w e r e
i n c u b a t e d i n D u l b e c c o ' s b u f f e r ( 1 1 ) a t 3 7 C a n d p H 7 . 4 f o r 1 0
m i n i n t h e p r e s e n c e o f 1 5 , u C i o f ' 4 C - l a b e l e d ( 1 8 n m o l / g o f t i s -
s u e ) o r 3 H - l a b e l e d ( 7 . 5 p m o l / g o f t i s s u e ) a r a c h i d o n i c a c i d . C h a l -
l e n g e w a s p e r f o r m e d w i t h b i r c h p o l l e n ( 3 , 3 0 0 u n i t s / m l ) , h o r s e
d a n d e r ( 4 5 0 u n i t s / m l ) , o r i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 ( 5 , u M ) . T h e r e -
a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f e t h a n o l .
E x t r a c t i o n , P u r i f i c a t i o n , a n d A n a l y t i c a l M e t h o d s . T h e e t h a n o l
s o l u t i o n f r o m t h e i n c u b a t i o n s w a s f i l t e r e d , e v a p o r a t e d t o d r y -
n e s s , d i s s o l v e d i n w a t e r ( p H 5 . 0 ) , a n d a p p l i e d t o a n A m b e r l i t e
X A D - 8 c o l u m n . T h e m a t e r i a l e l u t e d f r o m t h e c o l u m n w i t h
m e t h a n o l w a s t r a n s f e r r e d t o a S i l i c A R C C - 7 ( M a l l i n c k r o d t ) c o l -
u m n i n m e t h a n o l / e t h y l a c e t a t e , 1 0 : 9 0 ( v o l / v o l ) ( 1 2 ) . T h e s a m e
s o l v e n t s y s t e m w a s u s e d t o e l u t e p r o s t a g l a n d i n s , t h r o m b o x a n e s ,
H H T , m o n o - H E T E s , l e u k o t r i e n e B 4 ( L T B 4 ) , a n d a r a c h i d o n i c
a c i d , w h e r e a s t h e c y s t e i n y l - c o n t a i n i n g l e u k o t r i e n e s w e r e e l u t e d
A b b r e v i a t i o n s : GC / M S , g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y ; L T B 4 ,
L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 , l e u k o t r i e n e s B 4 , C 4 , D 4 , a n d E 4 , r e s p e c t i v e l y ;
m o n o - H E T E s , m o n o h y d r o x y i c o s a t e t r a e n o i c a c i d s ( h y d r o x y p o s i t i o n
d e s i g n a t e d b y p r e f i x ) ; d i - H E T E s , d i h y d r o x y - H E T E s ; S P - H P L C , s t r a i g h t -
p h a s e H P L C ; R P - H P L C , r e v e r s e - p h a s e H P L C ; S R S - A , s l o w r e a c t i n g
s u b s t a n c e o f a n a p h y l a x i s ; T X A 2 a n d T X B 2 , t h r o m b o x a n e s A 2 a n d B 2 ;
P GB 2 , P GD 2 , P GE 2 , P GF 2 a , P GI 1 , a n d P GI 2 , p r o s t a g l a n d i n s B 2 , D 2 ,
E 2 , F 2 , , I 1 , a n d I 2 , r e s p e c t i v e l y ; w w , w e t w e i g h t ; H H T , 1 2 - h y d r o x y h e p -
t a d e c a t r i e n o i c a c i d .
t
T o w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

P r e s e n t a d d r e s s : D e p t . o f A n a l y t i c a l C h e m i s t r y , A B H a s s l e , S 4 3 1 8 3
M o l n d a l , S w e d e n .
1 7 1 2
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -
m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 ) 1 7 1 3
9 - H P E T E 1 2 - H P E T E
8 - H P E T E
5 - H P E T E - A A -
1 5 - H P E T E
1 1 - H P E T E
. - P GG_ H H T
L T A 4 L T C 4 T X B 2 - T X A 2 - P GH 2 P GD 2
L T B 4
L T D 4
1 5 - K D H P GI 2
P GF 2 a
P GE 2
I 4 ~ ~ ~ T X B
2
4 4
2 0 - OH -
L T E 4
6 - K - 1 5 - K D H -
P GB 2
L T B 4
P GF i a P GF 2 a
F I G. 1 . P a t h w a y s f o r a r a c h i d o n i c a c i d ( A A ) m e t a b o l i s m . D o t t e d l i n e s
i n d i c a t e p o s s i b l e t r a n s f o r m a t i o n s . L i p o x y g e n a s e - i n i t i a t e d o x y g e n a -
t i o n s g e n e r a t e h y d r o p e r o x y i c o s a t e t r a e n o i c a c i d s ( H P E T E s ; t h e p r e f i x
d e n o t e s t h e p o s i t i o n o f t h e h y d r o p e r o x y g r o u p ) , w h i c h a r e f u r t h e r c o n -
v e r t e d i n t o t h e r e s p e c t i v e m o n o h y d r o x y i c o s a t e t r a e n o i c a c i d s ( m o n o -
H E T E s ) o r , i n t h e c a s e o f 5 - H P E T E , a l s o i n t o t h e l e u k o t r i e n e s . T h e i n -
d o m e t h a c i n - s e n s i t i v e c y c l o o x y g e n a s e p a t h w a y f o r m s t h e e n d o p e r o x -
i d e s ( P GG2 a n d P GH 2 ) , w h i c h a r e t r a n s f o r m e d i n t o p r o s t a g l a n d i n s
D 2 , E 2 ,
F 2 . ,
B 2 , 1 2 ( P GD 2 , P GE 2 , P GF 2 a , P GB 2 , P GI 2 ) , t h r o m b o x a n e s A 2
a n d B 2 ( T X A 2 a n d T X B 2 ) , o r 1 2 - h y d r o x y h e p t a d e c a t r i e n o i c a c i d ( H H T ) .
T h e 1 5 - k e t o d i h y d r o m e t a b o l i t e s o f T X A 2 a n d P GF 2 a : a r e a b b r e v i a t e d
1 5 - K D H - T X B 2 a n d
1 5 - K D H - P GF 2 . ,
r e s p e c t i v e l y , a n d t h e 6 - k e t o d e r i v a -
t i v e o f p r o s t a g l a n d i n F l , , i s s h o w n a s 6 - K - P GF 1 , , . F o r d e t a i l s o n b i o -
c h e m i s t r y , s e e r e f 2 .
w i t h m e t h a n o l . B o t h f r a c t i o n s w e r e a n a l y z e d b y r e v e r s e - p h a s e
H P L C ( R P - H P L C ) w i t h a s e m i p r e p a r a t i v e c o l u m n o f P o l y g o s i l
6 0 - 1 0 C 1 8 i n t h e s o l v e n t s y s t e m m e t h a n o l / w a t e r / a c e t i c a c i d ,
7 0 : 3 0 : 0 . 1 ( v o l / v o l ) , b u f f e r e d w i t h a m m o n i u m h y d r o x i d e t o p H
4 . 2 ( m e a s u r e d b e f o r e a d d i t i o n o f t h e m e t h a n o l ) . C o m p o u n d s
w e r e d e t e c t e d b y c o n t i n u o u s m o n i t o r i n g o f U V a b s o r p t i o n a t
2 3 5 n m a n d a t 2 7 0 n m o r 2 8 0 n m a n d b y a s s a y o f t h e r a d i o a c -
t i v i t y .
T h e m a t e r i a l i n t h e m e t h a n o l / e t h y l a c e t a t e e l u a t e f r o m t h e
s i l i c i c a c i d c o l u m n w a s c h r o m a t o g r a p h e d b y R P - H P L C a n d s e p -
a r a t e d i n t o f i v e m a i n f r a c t i o n s . F r a c t i o n I , c o n t a i n i n g p r o s t a -
g l a n d i n s a n d t h r o m b o x a n e s w a s p u r i f i e d b y u s i n g S E P - P A K C 1 8
c a r t r i d g e s ( 1 3 ) a n d a n a l y z e d b y t w o - d i m e n s i o n a l T L C ( 1 4 ) .
F r a c t i o n I I , c o n t a i n i n g L T B 4 a n d o t h e r d i h y d r o x y - H E T E s ( d i -
H E T E s ) , w a s e s t e r i f i e d w i t h d i a z o m e t h a n e a n d a n a l y z e d b y
s t r a i g h t - p h a s e H P L C ( S P - H P L C ) o n N u c l e o s i l 5 0 - 5 w i t h h e x -
a n e / i s o p r o p a n o l / a c e t i c a c i d , 9 6 : 4 : 0 . 0 2 ( v o l / v o l ) , a s t h e s o l v e n t
s y s t e m ( 1 5 ) . L T B 4 w a s q u a n t i t a t e d b y m e a s u r e m e n t o f t h e a b -
s o r b a n c e a t 2 7 0 n m ( E = 5 0 , 0 0 0 ) . F r a c t i o n I I I c o n t a i n e d H H T ,
w h i c h w a s i d e n t i f i e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m -
e t r y ( GC / M S ) ( 1 6 ) . F r a c t i o n I V c o n s i s t e d o f m o n o - H E T E s , w h i c h
w e r e p a r t i a l l y s e p a r a t e d o n R P - H P L C a n d q u a n t i t a t e d b y m e a -
s u r e m e n t o f a b s o r b a n c e a t 2 3 5 n m ( E = 3 0 , 0 0 0 ) . T h e s e c o m -
p o u n d s w e r e p o o l e d a g a i n a n d f u r t h e r i d e n t i f i e d a n d q u a n t i -
t a t e d b y GC / M S b y u s i n g t h e h y d r o g e n a t e d d e r i v a t i v e s ( 1 7 ) .
F r a c t i o n V c o n t a i n e d a r a c h i d o n i c a c i d .
T h e m e t h a n o l e l u a t e f r o m t h e s i l i c i c a c i d c o l u m n w a s a l s o
s e p a r a t e d o n t h e s e m i p r e p a r a t i v e R P - H P L C c o l u m n . B i o l o g i -
c a l l y a c t i v e f r a c t i o n s o f t h e e l u t e d m a t e r i a l w e r e r e c h r o m a t o -
g r a p h e d o n R P - H P L C w i t h a n a n a l y t i c a l c o l u m n o f N u c l e o s i l 5
C 1 8 i n m e t h a n o l / w a t e r / a c e t i c a c i d , 6 5 : 3 5 : 0 . 1 ( v o l / v o l ) , b u f f -
e r e d w i t h a m m o n i u m h y d r o x i d e t o p H 4 . 2 . U V s p e c t r a o f t h e
c o m p o u n d s i s o l a t e d w e r e r e c o r d e d i n m e t h a n o l . C y s t e i n y l - c o n -
t a i n i n g l e u k o t r i e n e s w e r e q u a n t i t a t e d b y m e a s u r e m e n t o f t h e
a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m ( E
=
4 0 , 0 0 0 ) a n d b y b i o a s s a y ( s e e a b o v e ) ,
p r o v i d i n g d e t e c t i o n l i m i t s o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 a n d 0 . 1 p m o l ,
r e s p e c t i v e l y .
D e t e r m i n a t i o n o f S p e c i f i c R a d i o a c t i v i t y . T h e s p e c i f i c a c t i v -
i t y o f T X B 2 , w a s d e t e r m i n e d b y a s s a y i n g r a d i o a c t i v i t y a n d b y
u s i n g a s p e c i f i c r a d i o i m m u n o a s s a y f o r T X B 2 ( 1 8 ) . P r i o r t o t h e
d e t e r m i n a t i o n s , T X B 2 w a s s e p a r a t e d f r o m t h e o t h e r l a b e l e d
c o m p o u n d s i n f r a c t i o n I b y r e c h r o m a t o g r a p h y o n t h e a n a l y t i c a l
R P - H P L C c o l u m n .
T h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s o f m o n o - H E T E s w e r e d e t e r m i n e d b y
GC / M S w i t h h y d r o g e n a t e d m e t h y l e s t e r t r i m e t h y l s i l y l e t h e r
d e r i v a t i v e s . T h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f t h e m a j o r c a r b o x y l g r o u p -
c o n t a i n i n g f r a g m e n t o f e a c h m o n o - H E T E a n d t h e i s o t o p i c i o n s
a t m / z o f n + 2 w e r e m e a s u r e d ; a f t e r c o r r e c t i o n f o r t h e n a t u r a l
i s o t o p i c a b u n d a n c e s o f t h e s e f r a g m e n t s , t h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s
c o u l d b e c a l c u l a t e d .
T h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s o f t h e c y s t e i n y l - c o n t a i n i n g l e u k o -
t r i e n e s w e r e e s t i m a t e d b y c o m p a r i s o n s o f U V a b s o r b a n c e a n d
b i o a s s a y q u a n t i t a t i o n s w i t h t h e r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e s a m e
s a m p l e .
R E S U L T S
B r o n c h i a l R e a c t i v i t y . A c e t y l c h o l i n e ( 0 . 3 - 1 0 0 M M ) , h i s t a -
m i n e ( 0 . 3 - 1 0 0 . M ) , P GB 2 ( 0 . 1 - 3 , u M ) ,
P GF 2 c
( 1 - 1 0
A u M ) ,
a n d
l e u k o t r i e n e s L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 ( 1 - 1 0 n M ) e l i c i t e d d o s e -
d e p e n d e n t c o n t r a c t i o n s o f t h e b r o n c h i a l s t r i p s ( F i g . 2 ) . H i s t a -
m i n e a n d a c e t y l c h o l i n e w e r e e q u i p o t e n t a n d e v o k e d c o n t r a c -
t i o n s t h a t w e r e c o m p a r a t i v e l y r a p i d i n o n s e t , w h e r e a s t h e c o n -
t r a c t i o n s i n d u c e d b y
P GF 2 ,
a n d , i n p a r t i c u l a r , P GB 2 a n d t h e
l e u k o t r i e n e s d e v e l o p e d m o r e s l o w l y a n d w e r e r e m a r k a b l y p e r -
s i s t e n t . M o r e o v e r , P GB 2 w a s m o r e p o t e n t t h a n e i t h e r h i s t a m i n e
o r P GF 2 a . A d e n o s i n e a n d s e r o t o n i n w e r e f o u n d t o c a u s e t h r e s h -
o l d c o n t r a c t i o n s a t 1 0 , u M i n t w o s t r i p s ( n o t s h o w n ) .
T h e l e u k o t r i e n e s w e r e a p p r o x i m a t e l y 1 , 0 0 0 t i m e s m o r e p o -
t e n t o n a m o l a r b a s i s t h a n w a s h i s t a m i n e ( F i g . 3 ) . F u r t h e r m o r e ,
t h e l e u k o t r i e n e s r e m a i n e d f u l l y a c t i v e i n t h e p r e s e n c e o f m e -
p y r a m i n e ( 1 , u M ) a n d i n d o m e t h a c i n ( 1 0 , u M ) ( F i g . 2 ) , i n d i c a t i n g
t h a t t h e c o n t r a c t i o n w a s n o t d u e t o r e l e a s e o f h i s t a m i n e , p r o s -
t a g l a n d i n s , o r t h r o m b o x a n e s . On t h e o t h e r h a n d , F P L 5 5 7 1 2 ( 1 0
, M ) ,
a p r o p o s e d S R S - A e f f e c t o r a n t a g o n i s t ( 1 9 ) , s e l e c t i v e l y r e -
5 m i n
I I
1 0 0
5 0 3
H i 3 0 0
4
L T C 4
3
3
P G
B 2
3 0 0
E 1 0 0 -
X 5 0 1
q E
J _
<
A c h l OO0
P GF 2 c x
1 0 0 0 0
L T E 4
1
e
0
6 C 1
0
C - )
1 0 0
5 0 1
0
1 0 0 ] -
5 0 -
O-
i
H i 3 0 0 0 n M
4
L T D 4
1 0 n M
F P L 5 5 7 1 2 1 0 p l M
< - - o K -
H i 1 0 0 0 L T C 4 3
H i 1 0 0 0 0 L T C 4 1 0
4 4
H i 1 0 0 0 L T C 4 3 n M
M E P YR . p M + I N D O. 1 0 p M
i 1
H i 1 0 0 0 0 L T C 4 1 0
n M
F I G. 2 . I s o m e t r i c r e c o r d i n g s o f c o n t r a c t i o n r e s p o n s e s i n b r o n c h i
i s o l a t e d f r o m t w o a s t h m a t i c s , e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e o f m a x i m a l c o n -
t r a c t i o n s i n d u c e d b y 1 0 0 u M a c e t y l c h o l i n e a n d 4 0 m M K C l . H i , h i s -
t a m i n e ; A c h , a c e t y l c h o l i n e ; M E P YR , m e p y r a m i n e ; I N D O, i n d o m e t h -
a c i n .
M e d i c a l S c i e n c e s : D a h l e - n e t a L
I
1 7 1 4 M e d i c a l S c i e n c e s : D a h l e n e t a l .
1 0 0 t
E i
0
g
=s
0
0
5 0
0 - i
0
0
0
0 7
/ o
S
0
: :
0
* 0
* 0
1 0
* 0
0
* 0
0
9 8 7 6
D o s e , - l o g M
5
F I G. 3 . D o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s f o r h i s t a m i n e ( o ) , L T C 4 ( o ) ,
L T D 4 ( o ) , a n d L T E 4 ( v ) i n 1 1 b r o n c h i a l s t r i p s f r o m t w o a s t h m a t i c p a -
t i e n t s . R e g r e s s i o n l i n e s f o r L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 a s a g r o u p ( n = 1 5 )
a n d f o r h i s t a m i n e ( n = 3 7 ) w e r e c a l c u l a t e d b y t h e m e t h o d o f l e a s t
s q u a r e s .
d u c e d t h e e f f e c t o f L T C 4 ( F i g . 2 ) .
B i r c h p o l l e n ( 1 - 1 , 0 0 0 u n i t s / m l ) e l i c i t e d d o s e - d e p e n d e n t a n d
l o n g - l a s t i n g c o n t r a c t i o n s o f t h e b r o n c h i ( F i g . 4 ) , w h e r e a s e x -
p o s u r e o f t h e b r o n c h i t o u n s p e c i f i c a n t i g e n s ( h o r s e d a n d e r a n d
t i m o t h y ) w a s i n e f f e c t i v e . M e p y r a m i n e a n d i n d o m e t h a c i n h a d n o
s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e r e s p o n s e t o b i r c h p o l l e n ( F i g . 4 ) . On t h e
o t h e r h a n d , t h e l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s i n h i b i t o r U - 6 0 2 5 7 ( 1 0 0
, u M ) ( 1 0 ) s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d t h e r e s p o n s e t o c u m u l a t i v e d o s e s
o f b i r c h p o l l e n ( F i g . 4 ) , w h e r e a s e x o g e n o u s L T C 4 s t i l l w a s a c -
t i v e i n t h e p r e s e n c e o f U - 6 0 2 5 7 ( n o t s h o w n ) .
T r a n s f o r m a t i o n s o f A r a c h i d o n i c A c i d . C h o p p e d l u n g w a s
c h a l l e n g e d w i t h s p e c i f i c a l l e r g e n ( b i r c h p o l l e n ) , u n s p e c i f i c a l -
l e r g e n ( h o r s e d a n d e r ) , o r t h e i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , a w e l l - k n o w n
s t i m u l u s f o r l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s ( c f . r e f . 2 ) . I n m o s t e x -
p e r i m e n t s ,
[ I 4 C ] a r a c h i d o n i c
a c i d w a s i n c l u d e d a s a m a r k e r f o r
a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m . A t t h e u s e d l o a d o f e x o g e n o u s
s u b s t r a t e , 1 1 5 % ( m e a n S D o f s i x i n c u b a t i o n s ) o f t h e r e -
1 0 0 -
M e p y r / I n d o
S
1 0 0
0 J
c U s
M e p y r / I n d o / U - 6 0 2 5 7
. : 1 0 0 I
1 1 0 1 0 0 1 , 0 0 0
B i r c h p o l l e n , u n i t s / m l
F I G. 4 . C u m u l a t i v e c h a l l e n g e w i t h a s p e c i f i c a l l e r g e n ( b i r c h p o l -
l e n ) i n t h r e e b r o n c h i a l s t r i p s f r o m a n a s t h m a t i c p a t i e n t . T h e c o n t r o l
c o n t r a c t i o n r e s p o n s e ( T o p ) i s l a r g e l y u n a f f e c t e d b y 1 , u M m e p y r a m i n e /
1 0 , u M i n d o m e t h a c i n ( M e p y r / I n d o ) ( M i d d l e ) b u t s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d
b y t h e l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s i n h i b i t o r U - 6 0 2 5 7 a t 1 0 0 , u M w i t h 1
M M m e p y r a m i n e / 1 0 , M i n d o m e t h a c i n ( B o t t o m ) . T h r e e o t h e r s t r i p s w e r e
t r e a t e d s i m i l a r l y , a n d t h e r e s u l t s w e r e s i m i l a r , a l t h o u g h U - 6 0 2 5 7 f u l l y
a b o l i s h e d t h e e f f e c t o f b i r c h p o l l e n i n t h a t p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t .
T a b l e 1 . R e l a t i v e t r a n s f o r m a t i o n o f [ ' 4 C ] a r a c h i d o n i c a c i d i n l u n g
t i s s u e o f b i r c h p o l l e n - s e n s i t i v e a s t h m a t i c s
I n c u b a t i o n C o n v e r t e d r a d i o a c t i v i t y , %
c o n d i t i o n s P Gs / T X s H H T H E T E s L T B 4 L T C 4 - E 4
C o n t r o l * 1 0 3 8 6 0 . 2 t N D
H o r s e d a n d e r * 3 9 1 7 4 4 Ol t N D
B i r c h p o l l e n * 1 7 1 0 6 6 0 . 3 t 0 . 2 t
B i r c h p o l l e n * 4 4 1 7 3 8 N D 0 . 2 t
A 2 3 1 8 7 * 1 8 5 6 5 8 . 4 0 . 2 t
A 2 3 1 8 7 1 2 0 8 5 8 8 . 3 0 . 4 *
N D , n o t d e t e c t e d ; P Gs / T X s , p r o s t a g l a n d i n s a n d t h r o m b o x a n e s .
*
C h o p p e d l u n g .
t L T B 4 w a s n o t i d e n t i f i e d o n S P - H P L C .
i L T C 4 - E 4 w e r e i d e n t i f i e d b y U V s p e c t r o m e t r y a n d b i o a s s a y .
M a t e r i a l w a s s t o r e d a t - 2 0 ' C f o r 1 m o n t h a n d t h a w e d o n i c e b e f o r e
i n c u b a t i o n .
H o m o g e n i z e d l u n g .
c o v e r e d r a d i o a c t i v i t y w a s a s s o c i a t e d w i t h m e t a b o l i t e s , w h e r e a s
t h e r e m a i n d e r w a s e l u t e d a s i n t a c t a r a c h i d o n i c a c i d .
M o n o - H E T E s a c c o u n t e d f o r t w o - t h i r d s o f t h e l a b e l , r e g a r d -
l e s s o f w h e t h e r t h e t i s s u e w a s i n c u b a t e d w i t h [ 1 4 C l a r a c h i d o n i c
a c i d a l o n e o r i n t h e p r e s e n c e o f b i r c h p o l l e n , h o r s e d a n d e r , o r
t h e i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 ( T a b l e 1 ) . T h e d e t e c t e d a m o u n t s o f t h e
m o n o - H E T E s w e r e i n t h e r a n g e 1 - 1 0 n m o l / g o f t i s s u e ( w w ) , a s
d e t e r m i n e d b o t h b y U V s p e c t r o m e t r y a n d GC / M S . T h e r e l a -
t i v e f o r m a t i o n o f t h e d i f f e r e n t m o n o - H E T E s w a s s i m i l a r i n a l l
i n c u b a t i o n s : a p p r o x i m a t e l y 5 0 % 1 5 - H E T E , 3 5 % 1 2 - H E T E , 5 %
l l - H E T E , a n d 5 % 5 - H E T E . T r a c e a m o u n t s o f 8 - H E T E w e r e
i d e n t i f i e d i n s o m e i n c u b a t e s , w h e r e a s 9 - H E T E w a s n o t d e -
t e c t e d a t a l l .
T h e c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d a n d i d e n t i f i e d
o n t w o - d i m e n s i o n a l T L C ( F i g . 5 ) . A l l i n c u b a t e s c o n t a i n e d t w o
m a j o r s p o t s w i t h m i g r a t i o n p r o p e r t i e s c o r r e s p o n d i n g t o T X B 2
a n d
6 - k e t o - P GF 1 , ,
( s e e F i g . 1 ) , i n d i c a t i n g r e l e a s e o f T X A 2 a n d
P GI 2 , r e s p e c t i v e l y . P GE 2 a n d P GF 2 a w e r e a l s o i d e n t i f i e d , a n d
s o m e m a t e r i a l s h o w e d c h r o m a t o g r a p h i c p r o p e r t i e s c h a r a c t e r -
i s t i c o f P GD 2 ( n o t s h o w n i n F i g . 5 ) . I n a d d i t i o n , 1 5 - k e t o d i h y d r o -
T X B 2 , 1 5 - k e t o d i h y d r o - P GF 2 a , a n d H H T w e r e i d e n t i f i e d i n a l l
i n c u b a t i o n s .
I d e n t i f i c a t i o n a n d Q u a n t i t a t i o n o f L e u k o t r i e n e s . On l y t r a c e s
o f l e u k o t r i e n e s w e r e d e t e c t e d w h e n c h o p p e d l u n g w a s i n c u -
1 k e l ^^y o
* e t
. e
F I G. 5 . T w o - d i m e n s i o n a l t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a m o f t h e f r a c t i o n
c o n t a i n i n g p r o s t a g l a n d i n s a n d t h r o m b o x a n e s i n o n e e x p e r i m e n t w h e r e
c h o p p e d l u n g w a s c h a l l e n g e d w i t h s p e c i f i c a l l e r g e n .
P r o c . N a d A c a d . S c i . U S A 8 0
( 1 9 8 3 )
P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 ) 1 7 1 5
T a b l e 2 . D e t e c t e d l e v e l s o f l e u k o t r i e n e s i n l u n g t i s s u e o f b i r c h
p o l l e n - s e n s i t i v e a s t h m a t i c s
L e u k o t r i e n e s , p m o l / g o f t i s s u e ( w w )
I n c u b a t i o n L T B 4 L T C 4 L T D 4 L T E 4 .
c o n d i t i o n s U V U V B I O W B I O U V B I O
C o n t r o l * N D N D 1 . 6 N D 0 . 5 N D 0 . 2
H o r s e d a n d e r * N D N D N D N D N D N D N D
B i r c h p o l l e n * N D 4 5 2 5 2 0 3 6 2 9 1 3
B i r c h p o l l e n t N D 2 0 2 3 3 3 8 3 3
A 2 3 1 8 7 * 4 3 0 8 5 3 5 6 2 2 5 6 1 4 7
A 2 3 1 8 7 * 3 2 5 4 2 2 4 2 6 1 4 6 4 2 8
B i r c h p o l l e n * t
+ U - 6 0 2 5 7 N D N D 0 . 5 N D 0 . 1 N D 0 . 1
A 2 3 1 8 7 * t
+ U - 6 0 2 5 7 N D N D 0 . 6 N D 0 . 3 N D 0 . 5
[ 1 4 C ] A r a c h i d o n i c a c i d w a s p r e s e n t i n a l l i n c u b a t e s . N D , n o t d e t e c t e d ;
U V , U V s p e c t r o m e t r y ( d e t e c t i o n l i m i t , < 1 p m o l / g o f t i s s u e ) ; B I O,
b i o a s s a y ( d e t e c t i o n l i m i t , < 0 . 0 1 p m o l / g o f t i s s u e ) .
* C h o p p e d l u n g .
t S t o r e d a t - 2 0 ' C f o r 1 m o n t h a n d t h a w e d o n i c e b e f o r e i n c u b a t i o n .
* H o m o g e n i z e d l u n g .
b a t e d w i t h [ ' 4 C ] a r a c h i d o n i c a c i d a l o n e o r i n t h e p r e s e n c e o f h o r s e
d a n d e r ( T a b l e s 1 a n d 2 ) . On t h e o t h e r h a n d , b i r c h p o l l e n c a u s e d
a m a r k e d s t i m u l a t i o n o f l e u k o t r i e n e f o r m a t i o n . T h u s , t h r e e p e a k s
w i t h U V a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m w e r e i d e n t i f i e d o n R P - H P L C a t
t h e s a m e r e t e n t i o n v o l u m e s a s s t a n d a r d s o f L T C 4 , L T D 4 , a n d
L T E 4 , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 6 ) . T h e m a t e r i a l i n t h e s e t h r e e r e g i o n s
e l i c i t e d t y p i c a l l e u k o t r i e n e c o n t r a c t i o n s o f t h e g u i n e a p i g l u n g
s t r i p , a n d a l l t h r e e p e a k s h a d U V s p e c t r a w i t h m a x i m a l a b s o r p -
t i o n a t 2 8 0 n m a n d s h o u l d e r s a t 2 7 0 a n d 2 9 0 n m ( F i g . 6 ) . T h e
t o t a l a m o u n t o f L T C 4 , L T D 4 , . a n d L T E 4 w a s i n t h e r a n g e 2 6 -
9 4 p m o l / g ( w w ) o f t i s s u e ( T a b l e 2 ) . H o w - e v e r , t h e r e c o v e r y o f
L T C 4 c a r r i e d t h r o u g h a l l s t e p s o f e x t r a c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n w a s
f o u n d t o b e < 1 0 %, i n d i c a t i n g t h a t t h e r e l e a s e d q u a n t i t i e s w e r e
a l m o s t 1 0 t i m e s l a r g e r t h a n t h e a m o u n t s d e t e c t e d .
C h a l l e n g e o f t h e l u n g w i t h t h e i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 i n d u c e d
f o r m a t i o n o f L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 t o a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e
e x t e n t a s d i d b i r c h p o l l e n ( T a b l e 2 ) . I n c o n t r a s t t o b i r c h p o l l e n ,
h o w e v e r , t h e i o n o p h o r e a l s o e v o k e d r e l e a s e o f L T B 4 ( T a b l e s 1
a n d 2 ) . R e c h r o m a t o g r a p h y o f t h i s m a t e r i a l o n S P - H P L C , g a v e
o n l y o n e m a j o r p e a k , i d e n t i f i e d a s L T B 4 . T h u s , n e i t h e r t h e
5 ( S ) , 1 2 ( S ) - i s o m e r o f L T B 4 [ 5 ( S ) , 1 2 ( S ) - d i h y d r o x y - 6 - t r a n s , 8 - c i s , 1 0 -
t r a n s , 1 4 - c i s - i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ] ( 1 5 ) n o r a n y o t h e r k n o w n d i -
H E T E c o u l d b e i d e n t i f i e d .
0 . 0 2 1
0
C 9 0 . 0 1 .
0
8 0
1 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ - 9 :
I A 2 ~ ~ ~ - ' 8 0
2 8 0 2 8 0 n m
1 0 2 0 3 0 4 0
E l u t i o n t i m e , m i n
F I G. 6 . R P - H P L C o f t h e m o s t p o l a r m a t e r i a l f r o m s i l i c i c a c i d c h r o -
m a t o g r a p h y o f c h o p p e d l u n g t i s s u e t a k e n f r o m a b i r c h p o l l e n - s e n s i t i v e
a s t h m a t i c a n d i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f b i r c h p o l l e n . ( I n s e t ) U V
s p e c t r a o f m a t e r i a l c o r r e s p o n d i n g t o p e a k s 1 , I , a n d I I L ; t h e s e i s o l a t e s
a l l h a d l e u k o t r i e n e - l i k e c o n t r a c t i l e a c t i v i t y o n b i o a s s a y a n d w e r e i d e n -
t i f i e d a s L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 , r e s p e c t i v e l y .
I n t h e p r e s e n c e o f U - 6 0 2 5 7 ( 1 0 0 P M ) , c h a l l e n g e o f t h e l u n g
w i t h b i r c h p o l l e n o r t h e i o n o p h o r e f a i l e d t o e v o k e l e u k o t r i e n e
f o r m a t i o n ( T a b l e 2 ) , w h e r e a s f o r m a t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e p r o d -
u c t s w a s u n a f f e c t e d a n d t h e t o t a l a m o u n t s o f m o n o - H E T E s w e r e
o n l y s l i g h t l y r e d u c e d ( n o t s h o w n ) .
T r a n s f o r m a t i o n s o f E n d o g e n o u s V e r s u s E x o g e n o u s A r a c h -
i d o n i c A c i d . T h e m a j o r c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t , T X B 2 , h a d a
s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y o f 2 5 - 3 5 p C i / p m o l , a s c o m p a r e d w i t h 5 6
p C i / p m o l
f o r t h e a d d e d e x o g e n o u s s u b s t r a t e . T h e m o n o - H E T E s
s h o w e d a s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y o f 4 - 1 0 p C i / p m o l , i n d i c a t i n g a
l o w e r , b u t s t i l l s i g n i f i c a n t , i n c o r p o r a t i o n o f e x o g e n o u s s u b s t r a t e
i n t o t h e s e l i p o x y g e n a s e p r o d u c t s . On t h e o t h e r h a n d , i n d e p e n -
d e n t l y o f w h e t h e r t h e t i s s u e w a s c h o p p e d o r h o m o g e n i z e d , t h e
c y s t e i n y l - c o n t a i n i n g l e u k o t r i e n - e s h a d a l o w e r s p e c i f i c r a d i o -
a c t i v i t y t h a n d i d a n y o f t h e o t h e r c o m p o u n d s , 0 . 5 - 2 . 0 p C i / p m o l .
I n l i n e w i t h t h e v i e w t h a t t h e s e l e u k o t r i e n e s w e r e s y n t h e s i z e d
a l m o s t e x c l u s i v e l y f r o m e n d o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d , i n c u b a -
t i o n o f t h e l u n g t i s s u e w i t h b i r c h p o l l e n a l o n e o r w i t h b i r c h p o l -
l e n i n t h e p r e s e n c e o f m i n u t e a m o u n t s o f e x o g e n o u s s u b s t r a t e
( 7 . 5 p m o l o f [ 3 H ] a r a c h i d o n i c a c i d p e r g o f t i s s u e ) , a l s o p r o v i d e d
e v i d e n c e f o r l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s . A l t h o u g h U V q u a n t i t a -
t i o n o f t h e l e u k o t r i e n e s c o u l d n o t b e a c h i e v e d i n t h e s e e x p e r -
i m e n t s , t h e m a t e r i a l p o o l e d f r o m t h e L T C 4 - L T E 4 r e g i o n s a f t e r
R P - H P L C e x h i b i t e d l e u k o t r i e n e a c t i v i t y o n t h e g u i n e a p i g l u n g
s t r i p c o r r e s p o n d i n g t o 1 2 a n d 1 6 p m o l / g o f t i s s u e , r e s p e c t i v e l y ,
w h i c h ' w a s o n l y s l i g h t l y b e l o w t h a t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f
[ I 4 C ] a r a c h i d o n i c
a c i d .
D I S C U S S I ON
B r o c k l e h u r s t h a s d e m o n s t r a t e d t h a t a l l e r g e n c h a l l e n g e r e l e a s e d
c r u d e r S R S - A f r o m t h e l u n g t i s s u e o f t w o p o l l e n - s e n s i t i v e a s t h -
m a t i c s ( 2 0 ) . A f t e r t h e s t r u c t u r e e l u c i d a t i o n o f S R S - A ( 2 1 , 2 2 ) , i t
w a s f o u n d t h a t a n t i g e n c h a l l e n g e r e l e a s e d L T C 4 a n d L T D 4 f r o m
p a s s i v e l y s e n s i t i z e d h u m a n l u n g f r a g m e n t s ( 2 3 ) a n d t h a t L T D 4
w a s g e n e r a t e d b y i m m u n o l o g i c a l c h a l l e n g e o f a c t i v e l y s e n s i -
t i z e d g u i n e a p i g l u n g ( 2 4 ) . S i n c e t h e n , i t h a s b e c o m e e v i d e n t
t h a t L T C 4 i s t h e p r i m a r y S R S - A r e l e a s e d a n d t h a t f u r t h e r m e -
t a b o l i s m c o n v e r t s i t i n t o L T D 4 a n d L T E 4 ( c f . r e f . 2 ) . T h e r e f o r e ,
t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e s e l e u k o t r i e n e s i n a p a r t i c u l a r
p r e p a r a t i o n o f S R S - A w i l l d e p e n d u p o n e x p e r i m e n t a l c o n d i -
t i o n s a n d t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y i n t h a t t i s s u e ( c f . r e f . 2 ) .
T h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s s h o w t h a t a s p e c i f i c a l l e r g e n i n -
d u c e d t h e f o r m a t i o n o f L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 i n l u n g t i s s u e
f r o m t w o a s t h m a t i c p a t i e n t s . M o r e o v e r , s e v e r a l l i n e s o f e v i -
d e n c e i n d i c a t e t h a t t h e r e l e a s e o f t h e s e t h r e e l e u k o t r i e n e s c o r -
r e l a t e d w e l l t o t h e l o n g - l a s t i n g c o n t r a c t i o n e v o k e d b y t h i s a l -
l e r g e n i n b r o n c h i i s o l a t e d f r o m t h e v e r y s a m e a s t h m a t i c s . F i r s t l y ,
t h e l e u k o t r i e n e s p e r s e w e r e a l l e x q u i s i t e l y p o t e n t a g o n i s t s f o r
c o n t r a c t i o n i n t h e b r o n c h i . T h e a p p a r e n t e q u i p o t e n c y o f L T C 4 ,
L T D 4 , a n d L T E 4 i n t h i s r e s p e c t i s i n a g r e e m e n t w i t h f i n d i n g s
i n g u i n e a p i g a i r w a y p r e p a r a t i o n s ( 6 , 7 ) a n d i n d i c a t e s t h a t t h e
t o t a l a m o u n t o f t h e s e t h r e e l e u k o t r i e n e s , r a t h e r t h a n t h e r e l -
a t i v e p r o p o r t i o n , i s o f i n t e r e s t w h e n e v a l u a t i n g a p o s s i b l e m e -
d i a t o r f u n c t i o n f o r l e u k o t r i e n e s i n a l l e r g i c b r o n c h o c o n s t r i c t i o n .
S e c o n d l y , t h e q u a n t i t y o f L T C 4 , L T D 4 , a n d L T E 4 g e n e r a t e d i n
t h e l u n g d u r i n g a l l e r g e n c h a l l e n g e a p p e a r e d t o b e m o r e t h a n
s u f f i c i e n t t o c a u s e m a x i m a l b r o n c h o c o n s t r i c t i o n . T h u s , t h e d e -
t e c t e d a m o u n t ( 2 5 - 1 0 0 p m o l / g o f t i s s u e ) w o u l d g i v e r i s e t o a
c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 1 n M i n a 5 - m l o r g a n b a t h c o n -
t a i n i n g a 1 0 0 - m g b r o n c h i a l s t r i p , w h i c h b y i t s e l f i s s u f f i c i e n t t o
e v o k e a s i g n i f i c a n t c o n t r a c t i l e r e s p o n s e ( F i g . 3 ) . H o w e v e r , c o n -
s i d e r i n g t h e l o s s e s d u r i n g e x t r a c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n , t h e p r e s -
e n t d a t a i n d i c a t e t h a t t h e l u n g r e l e a s e d c l o s e t o 1 n m o l o f L T C 4 ,
L T D 4 , a n d L T E 4 p e r g o f t i s s u e d u r i n g t h e b r i e f 1 0 - m i n a l l e r g e n
c h a l l e n g e . F i n a l l y , t h e d o c u m e n t e d l e u k o t r i e n e b i o s y n t h e s i s
M e d i c a l S c i e n c e s : D a h l e ' n e t a l .
1 7 1 6 M e d i c a l S c i e n c e s : D a h l e n e t a l P
i n h i b i t o r U - 6 0 2 5 7 ( 1 0 ) i n h i b i t e d b o t h t h e f o r m a t i o n o f l e u k o -
t r i e n e s i n t h e c h o p p e d l u n g a n d t h e c o n t r a c t i o n r e s p o n s e t h a t
e n s u e d b i r c h p o l l e n c h a l l e n g e i n t h e i s o l a t e d b r o n c h i .
A s d o c u m e n t e d ( 2 5 ) , m o n o - H E T E s , e s p e c i a l l y 1 5 - H E T E ,
m a d e u p t h e b u l k o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s i d e n t i f i e d i n
t h e l u n g . T h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h e s e c o m p o u n d s i s n o t
k n o w n y e t . C y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s m a d e u p a n o t h e r s i g n i f -
i c a n t f r a c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d t r a n s f o r m a t i o n s . T h e s e i n -
c l u d e d t h e b r o n c h o c o n s t r i c t i v e T X A 2 ( i n d i c a t e d b y t h e p r e s -
e n c e o f T X B 2 a n d 1 5 - k e t o d i h y d r o - T X B 2 , a m e t a b o l i t e p r e v i o u s l y
n o t i d e n t i f i e d i n h u m a n l u n g ) , P GD 2 , P GF 2 q , a n d t h e m o r e o r
l e s s r e l a x a n t P GE 2 a n d P GI 2 . H o w e v e r , c y c l o o x y g e n a s e p r o d -
u c t s d i d n o t a p p e a r t o c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t h e a i r w a y a n a -
p h y l a x i s p r e s e n t l y s t u d i e d . I n f a c t , i t i s e v e n c o n c e i v a b l e t h a t
d i v e r s i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m f r o m r e l a x a n t a n d
m o d e r a t e l y c o n s t r i c t i v e c y c l o o x y g e n a s e p r o d u c t s t o t h e v e r y
c o n s t r i c t i v e l e u k o t r i e n e s m i g h t e x p l a i n t h e s y n d r o m e o f a s p i r i n -
s e n s i t i v e a s t h m a .
A s t h m a t i c s h a v e b e e n o b s e r v e d t o b e h y p e r r e a c t i v e t o i n -
h a l a t i o n o f P GF 2 , ( 2 6 ) a n d h i s t a m i n e ( 2 7 ) . H o w e v e r , t h e p r e s -
e n t f i n d i n g t h a t h i s t a m i n e , P GF 2 a , a n d L T C 4 h a d t h e s a m e a b -
s o l u t e a n d r e l a t i v e c o n t r a c t i l e p o t e n c y i n b r o n c h i f r o m a s t h m a t i c s
a s i n b r o n c h i f r o m n o n a s t h m a t i c s ( 3 ) w o u l d s e e m t o i n d i c a t e t h a t
h y p e r r e a c t i v i t y i s a n i n v i v o p h e n o m e n o n d u e t o f a c t o r s o t h e r
t h a n h y p e r s e n s i t i v i t y o f t h e b r o n c h i a l s m o o t h m u s c l e t o t h e a g -
o n i s t s . S o m e w h a t u n e x p e c t e d l y , P GB 2 w a s c o n s i d e r a b l y m o r e
p o t e n t t h a n h i s t a m i n e o r
P GF 2
i n t h e b r o n c h i , a n d t h e c o n -
t r a c t i o n r e s p o n s e h a d a t i m e c o u r s e r e s e m b l i n g t h a t o f t h e l e u -
k o t r i e n e s . H o w e v e r , P GB 2 w a s n o t i d e n t i f i e d i n a n y o f t h e i n -
c u b a t e s . T h e t h r e s h o l d c o n t r a c t i l e e f f e c t o f 1 0 , u M a d e n o s i n e i s
o f s o m e i n t e r e s t , b e c a u s e t h i s p u r i n e n u c l e o s i d e m a y r e a c h e v e n
h i g h e r p l a s m a l e v e l s d u r i n g , f o r i n s t a n c e , h y p o x i a ( 2 8 ) , a n d , i n
a d d i t i o n , t h e a n t i a s t h m a t i c d r u g t h e o p h y l l i n e i s k n o w n t o b e a n
e f f e c t o r a n t a g o n i s t f o r a d e n o s i n e ( 2 8 ) .
T a k e n t o g e t h e r , t h e p r e s e n t f i n d i n g s w i t h l u n g t i s s u e o b -
t a i n e d f r o m t w o s p e c i f i c a l l y a l l e r g i c a s t h m a t i c s i n d i c a t e t h a t L T C 4 ,
L T D 4 , a n d L T E 4 m u s t b e c o n s i d e r e d a s p o s s i b l e m a j o r m e d i a -
t o r s o f a l l e r g i c b r o n c h o c o n s t r i c t i o n i n m a n .
W e t h a n k M s . S i w A n d e l l , L i l i a n F r a n z e n , a n d U l l a P a l m e r t z f o r e x -
c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e , M s . U l l a L i n d g r e n f o r e x p e r t s e c r e t a r i a l w o r k ,
a n d D r . I n g e l a S j o g r e n , D e p t . o f T h o r a c i c M e d i c i n e , K a r o l i n s k a I n -
s t i t u t e t , f o r a l l e r g o l o g i c a l a d v i c e . T h e w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m
t h e S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l ( P r o j e c t s 0 4 X 4 3 4 2 , 0 3 P - 5 8 0 4 ,
a n d 0 3 X - 0 5 9 1 5 ) , t h e S w e d i s h S o c i e t y A g a i n s t H e a r t a n d C h e s t D i s e a s e s ,
t h e S w e d i s h S o c i e t y o f M e d i c a l S c i e n c e s , t h e S w e d i s h S o c i e t y f o r M e d -
i c a l R e s e a r c h , H a r a l d a n d Gr e t a J e a n s s o n F o u n d a t i o n , M a g n u s B e r g v a l l
F o u n d a t i o n , a n d K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t .
1 . Or a n g e , R . P . & A u s t e n , K . F . ( 1 9 6 9 ) A d v . I m m u n o l 1 0 , 1 0 5 - 1 4 4 .
2 . S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 8 2 ) i n A d v a n c e s i n P h a r m a c o l o g y a n d T h e r a -
p e u t i c s I I , e d s . Yo s h i d a , H . , H a g i h a r a , Y. & E b a s h i , S . ( P e r g a -
m o n , N e w Yo r k ) , V o l . 4 , p p . 5 5 - 7 5 .
3 . D a h l e n , S . - E . , H e d q v i s t , P . , H a m m a r s t r o m , S . & S a m u e l s s o n ,
B . ( 1 9 8 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 8 , 4 8 4 - 4 8 6 .
4 . D r a z e n , J . M . , A u s t e n , K . F . , L e w i s , R . A . , C l a r k , D . A . , Go t o ,
G. , M a r f a t , A . & C o r e y , E . J . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A
7 7 , 4 3 5 4 - 4 3 5 8 .
5 . H e d q v i s t , P . , D a h l e n , S . - E . , Gu s t a f s s o n , L . , H a m m a r s t r 6 m , S .
& S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 8 0 ) A c t a P h y s i o l S c a n d . 1 1 0 , 3 3 1 - 3 3 3 .
6 . L e w i s , R . A . , D r a z e n , J . M . , A u s t e n , K . F . , T o d a , M . , B r i o n , F . ,
M a r f a t , A . & C o r e y , E . J . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 7 8 ,
4 5 7 9 - 4 5 8 3 .
7 . D a h l e n , S . - E . , H e d q v i s t , P . & H a m m a r s t r o m , S . ( 1 9 8 3 ) E u r . J .
P h a r m a c o l . 8 6 , 2 0 7 - 2 1 5 .
8 . W e i s s , J . W , D r a z e n , J . M . , C o l e s , N . , M c F a d d e n , E . R . , W e l l e r ,
P . W . , C o r e y , E . J . , L e w i s , R . A . & A u s t e n , K . F . ( 1 9 8 2 ) S c i e n c e
2 1 6 , 1 9 6 - 1 9 8 .
9 . D a h l e n , S . - E . , B j o r k ,
I . ,
H e d q v i s t , P . , A r f o r s , K . - E . , H a m m a r -
s t r 6 m , S . , L i n d g r e n , J . A . & S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l , A c a d .
S c i . U S A 7 8 , 3 8 8 7 - 3 8 9 1 .
1 0 . B a c h , M . K . , B r a s h l e r , J . R . , S m i t h , H . W . , F i t z p a t r i c k , F . A . ,
S u n , F . F . & M c Gu i r e , J . C . ( 1 9 8 2 ) P r o s t a g l a n d i n s 2 3 , 7 5 9 - 7 7 1 .
1 1 . D u l b e c c o , R . & V o g t , M . ( 1 9 5 4 ) J . E x p . M e d . 9 9 , 1 6 7 - 1 8 2 .
1 2 . H a n s s o n , G. & R A d m a r k , 0 . ( 1 9 8 0 ) F E B S L e t t . 1 2 2 , 8 7 - 9 0 .
1 3 . P o w e l l , W . S . ( 1 9 8 0 ) P r o s t a g l a n d i n s 2 0 , 9 4 7 - 9 5 7 .
1 4 . Gr a n s t r 6 m , E . ( 1 9 8 2 ) M e t h o d s E n z y m o l 8 6 , 4 9 4 - 5 1 1 .
1 5 . L i n d g r e n , J . A . , H a n s s o n , G. & S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 8 1 ) F E B S L e t t .
1 3 0 , 1 0 7 - 1 1 2 .
1 6 . H a m b e r g , M . & S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 7 4 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A
7 1 , 3 4 0 0 - 3 4 0 4 .
1 7 . B o e y n a e m s , J . M . , B r a s h , A . - R . , Oa t e s , J . A . & H u b b a r d , W . C .
( 1 9 8 0 ) A n a L B i o c h e m . 1 0 4 , 2 5 9 - 2 6 7 .
1 8 . Gr a n s t r 6 m , E . , K i n d a h l , H . & S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 7 6 ) A n a L L e t t .
9 , 6 1 1 - 6 2 7 .
1 9 . A u g s t e i n , J . , F a r m e r , J . B . , L e e , T . B . , S h e a r d , P . & T a t t e r s a l l ,
M . L . ( 1 9 7 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) N e w B i o l 2 4 5 , 2 1 5 - 2 1 7 .
2 0 . B r o c k l e h u r s t , W . E . ( 1 9 6 0 ) J . P h y s i o l ( L o n d o n ) 1 5 1 , 4 1 6 - 4 3 5 .
2 1 . M u r p h y , R . C . , H a m m a r s t r 6 m , S . & S a m u e l s s o n , B . ( 1 9 7 9 ) P r o c .
N a t l A c a d . S c i . U S A 7 6 , 4 2 7 5 - 4 2 7 9 .
2 2 . H a m m a r s t r 6 m , S . , M u r p h y , R . C . , S a m u e l s s o n , B . , C l a r k , D . A . ,
M i o s k o w s k i , C . & C o r e y , E . J . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .
C o m m u n . 9 1 , 1 2 6 6 - 1 2 7 2 .
2 3 . L e w i s , R . A . , A u s t e n , K . F . , D r a z e n , J . M . , C l a r k , D . A . , M a r -
f a t , A . & C o r e y , E . J . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 7 7 , 3 7 1 0 -
3 7 1 4 .
2 4 . M o r r i s , H . R . , T a y l o r , G. W . , P i p e r , P . J . & T i p p i n s , J . R . ( 1 9 8 0 )
N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 5 , 1 0 4 - 1 0 6 .
2 5 . H a m b e r g , M . , H e d q v i s t , P . & R a d e g r a n , K . ( 1 9 8 0 ) A c t a P h y s i o l
S c a n d . 1 1 0 , 2 1 9 - 2 2 1 .
2 6 . M a t h e , A . A . , H e d q v i s t , P . , H o l m g r e n , A . & S v a n b o r g , N . ( 1 9 7 3 )
B r . M e d . J . 1 , 1 9 3 - 1 9 6 .
2 7 . C u r r y , J . J . ( 1 9 4 ) J . C l i n . I n v e s t . 2 5 , 7 8 5 - 7 9 1 .
2 8 . F r e d h o l m , B . ( 1 9 8 0 ) E u r . J . R e s p i r . D i s . , S u p p l . 1 0 9 , 6 , 2 9 - 3 6 .
P r o c . N a d A c a d . S c i . U S A 8 0
( 1 9 8 3 )