1975, 29(2):297. Appl. Microbiol.

James W. Mayhew and Sherwood L. Gorbach

in Contaminated Food
Clostridium botulinum Detection of
Technique for Presumptive
Rapid Gas Chromatographic
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A P P L E D M I C R O B I O L O G Y , F e b . 1 9 7 5 , p . 2 9 7 - 2 9 9
C o p y r i g h t 0 1 9 7 5 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
V o l . 2 9 , N o . 2
P r i n t e d i n U . S . A .
R a p i d G a s C h r o m a t o g r a p h i c T e c h n i q u e f o r P r e s u m p t i v e
D e t e c t i o n o f C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m i n C o n t a m i n a t e d F o o d
JA M E S W. M A Y HE W* A N D S HE R WO O D L . G O R B A C H
I n f e c t i o u s D i s e a s e s S e c t i o n , V e t e r a n s A d m i n i s t r a t i o n Ho s p i t a l , S e p u l v e d a , C a l i f o r n i a 9 1 3 4 3 * a n d D e p a r t m e n t
o f M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a M e d i c a l C e n t e r , L o s A n g e l e s , C a l i f o r n i a 9 002 4
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 9 N o v e m b e r 1 9 7 4
A s i m p l e g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y e n d - p r o d u c t a s s a y i s r e p o r t e d f o r b u t y r i c
a n d o t h e r s h o r t - c h a i n f a t t y a c i d s a s p r e s u m p t i v e i n d i c a t o r s o f C l o s t r i d i u m
b o t u l i n u m c o n t a m i n a t i o n i n f o o d .
C o n t a m i n a t i o n o f f o o d b y C l o s t r i d i u m
b o t u l i n u m i s c u r r e n t l y a s s e s s e d b y d e t e c t i n g t h e
p r e s e n c e o f t o x i n i n t h e s u s p e c t m a t e r i a l . T h i s
a s s a y i n c l u d e s t h e r e l a t i v e l y c u m b e r s o m e t e c h -
n i q u e s o f i n v i v o m o u s e n e u t r a l i z a t i o n t e s t s a n d
i n v i t r o s e r o l o g i c a l p r o c e d u r e s b a s e d o n s p e c i f i c
t o x i n - a n t i t o x i n r e a c t i o n s ( 3 , 4 ) . E n d - p r o d u c t
a n a l y s i s o f c l o s t r i d i a ( 1 , 2 ) m a y p r o v i d e a n
a l t e r n a t e o r s u p p l e m e n t a l a p p r o a c h t o r a p i d ,
p r e s u m p t i v e d i a g n o s i s o f C . b o t u l i n u m c o n t a m -
i n a t i o n .
C h r o m a t o g r a m s o f o r g a n i c e x t r a c t s f r o m c o n -
t a m i n a t e d a n d n o n c o n t a m i n a t e d f o o d s w e r e
c o m p a r e d t o t h o s e o f b a c t e r i a l c u l t u r e s t o v e r i f y
t h e d i a g n o s t i c p o t e n t i a l o f t h e t e c h n i q u e . V o l a -
t i l e f a t t y a c i d s w e r e e x t r a c t e d o v e r i c e f r o m 1 . 0
m l o f a c i d i f i e d a q u e o u s s p e c i m e n w i t h 1 . 0 m l o f
d i e t h y l e t h e r . D e r i v a t i z e d p r o f i l e s w e r e d e v e l -
o p e d f r o m 0. 5 - m l c h l o r o f o r m e x t r a c t s o f a c i d i -
f i e d s p e c i m e n ( 1 . 0 m l ) p r e v i o u s l y s u p p l e m e n t e d
w i t h 1 . 0 m l o f b o r o n t r i f l u o r i d e m e t h a n o l ( A p -
p l i e d S c i e n c e , S t a t e C o l l e g e , P a . ) . A P a c k a r d
4 1 9 d u a l - c o l u m n g a s c h r o m a t o g r a p h e q u i p p e d
w i t h f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r s w a s r o u t i n e l y
o p e r a t e d a t a s e n s i t i v i t y o f 2 . 5 x 1 0- o A .
C h r o m a t o g r a p h i c d e f l e c t i o n s w e r e r e v e a l e d o n a
Ho n e y w e l l 1 - m V s p a n r e c o r d e r a n d p e a k a r e a s
w e r e i n t e r p r e t e d a s M V / s o n a S h i m a d z u I T G -
2 A e l e c t r o n i c d i g i t a l i n t e g r a t o r . T h e s i l a n i z e d
P y r e x c o l u m n s c o n t a i n e d 6% c a r b o w a x 2 0
M - t e r e p h t h a l i c a c i d o n 8 0/ 1 00 G a s - c h r o m Q
( A p p l i e d S c i e n c e ) . O p e r a t i n g c o n d i t i o n s i n -
c l u d e d : i n j e c t o r a n d d e t e c t o r b l o c k s , 2 00 C ;
o v e n , 1 2 5 C ( i s o t h e r m a l ) ; N 2 , H2 , a n d a i r f l o w s ,
r e s p e c t i v e l y , a t 1 3 , 3 0, a n d 3 00 m l / m i n . T h e
t o t a l t i m e f o r e x t r a c t i o n , d e r i v a t i z a t i o n , a n d
c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s w a s a p p r o x i m a t e l y
4 5 m i n .
F i g u r e 1 i l l u s t r a t e s a c h r o m a t o g r a m o f T r y p -
t i c a s e - p e p t o n e - y e a s t - g l u c o s e b r o t h a f t e r f i v e
d a y s o f a n a e r o b i c i n c u b a t i o n w i t h a s t r a i n o f C .
b o t u l i n u m t y p e B ( p r o t e o l y t i c , t o x i g e n i c ) .
P r o m i n e n t e n d p r o d u c t s i n c l u d e d : b u t y r i c a c i d ;
i s o v a l e r i c a c i d ; a n i s o c a p r o i c i s o m e r ; a n d a n
u n k n o w n , m e t h y l a t e d c o m p o u n d a t r e t e n t i o n
t i m e r e l a t i v e t o s u c c i n y l d i m e t h y l e s t e r ( R R T s
3 . 5 6) . T h i s u n k n o w n p e a k m a y b e a f a t t y a c i d o r
n e u t r a l c o m p o u n d ( 1 ) . I t s r e l a t i v e r e t e n t i o n
4 5
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4 8 1 0 2 6 2 8
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F I G . 1 . V o l a t i l e ( p a t t e r n o n l e f t ) a n d n o n v o l a t i l e
( p a t t e r n o n r i g h t ) S C F A c h r o m a t o g r a m s o f T r y p t i -
c a s e - p e p t o n e - y e a s t - g l u c o s e b r o t h c u l t u r e o f C . b o t u -
l i n u m t y p e B . 1 , A c e t i c ; 2 , p r o p i o n i c ; 3 , i s o b u t y r i c ;
4 , b u t y r i c ; 5 , i s o v a l e r i c ; 6, v a l e r i c ; 7 , i s o c a p r o i c i s o -
m e r ; 8 , s u c c i n y l d i m e t h y l e s t e r ; 9 , R R T s 3 . 5 6.
2 9 7

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A P P L . M I C R O B I O L .
t i m e d o e s n o t c o r r e s p o n d t o a u t h e n t i c p a l m i t i c ,
o l e i c , o r s t e a r i c m e t h y l e s t e r s . I n F i g . 2 , f l u i d
f r o m c a n n e d m u s h r o o m s c o n t a m i n a t e d w i t h C .
4 5
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2 6 1 0 2 6 2 8
M I N U T E S
F I G . 2 . V o l a t i l e ( p a t t e r n o n l e f t ) a n d n o n v o l a t i l e
( p a t t e r n o n r i g h t ) S C F A c h r o m a t o g r a m s o f m u s h -
r o o m s c o n t a m i n a t e d w i t h C . b o t u l i n u m t y p e B . 1 ,
A c e t i c ; 2 , p r o p i o n i c ; 3 , i s o b u t y r i c ; 4 , b u t y r i c ; 5 , i s o -
v a l e r i c ; 6, v a l e r i c ; 7 , i s o c a p r o i c i s o m e r ; 8 , s u c c i n y l
d i m e t h y l e s t e r ; 9 , R R T s 3 . 5 6.
T A B L E 2 . M i c r o b i a l s h o r t - c h a i n
b o t u l i n u m t y p e B e x h i b i t s a q u a l i t a t i v e l y s i m i -
l a r p r o f i l e . B a s e l i n e s h o r t - c h a i n f a t t y a c i d s
( S C F A ) l e v e l s i n n o n c o n t a m i n a t e d m u s h r o o m s
i n c l u d e d n o n e o f t h e f o u r m a r k e r s c i t e d .
T a b l e 1 l i s t s t h e p u r e s t r a i n s o f C . b o t u l i n u m
a s s a y e d . T a b l e 2 s c h e m a t i c a l l y i l l u s t r a t e s
S C F A p r o d u c t i o n f r o m p u r e c u l t u r e s a f t e r 5
d a y s o f a n a e r o b i c i n c u b a t i o n i n T r y p t i c a s e - p e p -
t o n e - y e a s t - g l u c o s e . A l l s e v e n s t r a i n s o f p r o t e o -
l y t i c C . b o t u l i n u m ( i n c l u d i n g t y p e s A , B a n d F ) ,
a n d t h r e e s t r a i n s o f C . s p o r o g e n e s , e v o l v e d a
u n i q u e c h r o m a t o g r a p h i c s i g n a t u r e - t h e c o m -
p l e t e v o l a t i l e f a t t y a c i d s r a n g e f r o m a c e t i c t o
i s o c a p r o i c a c i d s t o g e t h e r w i t h t h e u n k n o w n
d e f l e c t i o n , R R T s 3 . 5 6, w h i c h w a s u s u a l l y t h e
l a r g e s t s i n g l e p e a k . N e i t h e r C . s p o r o g e n e s n o r
t h e f o u r a t o x i g e n i c C . b o t u l i n u m ( t w o A - l i k e
s t r a i n s a n d t w o E s t r a i n s ) c o u l d b e c h r o m a t o -
g r a p h i c a l l y d i s t i n g u i s h e d f r o m t o x i g e n i c C .
b o t u l i n u m . N o n p r o t e o l y t i c C . b o t u l i n u m
s t r a i n s l a c k e d t h e R R T s 3 . 5 6 p e a k , a n d w e r e
v e r y s i m i l a r t o t h e s i n g l e s t r a i n o f C . t e t a n i . A l l
T A B L E 1 . P u r e s t r a i n s o f C . b o t u l i n
N o . o f
T y p e
s t r a i n s
F D A c o d e R e m a r k s
A 3 4 2 6A , 62 A , V 1 4 1
A - l i k e 2 4 4 4 9 N o n - t o x i g e n i c
4 4 7 2 N o n - t o x i g e n i c
B 2 1 1 5 B P r o t e o l y t i c
1 7 B N o n - p r o t e o l y t i c
E 2 006B N T N o n - t o x i g e n i c
S - 5 N o n - t o x i g e n i c ,
b o t i c i n ( + )
F 2 L a n g e l a n d P r o t e o l y t i c
7 0 F N o n - p r o t e o l y t i c
f a t t y a c i d p r o d u c t i o n i n T P Y G
F a t t y a c i d s a
S p e c i e s
~ N o . o f
S p e c i e s | s t r a i n s A P i B B u i V V i C L S
3 . 5 6
C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m 5 ( p r o - 7 + + + + + + +
t e o l y t i c )
C . b o t u l i n u m " ( n o n p r o t e o l y t i c ) 4 +
-
_ +
-
_ _ _ _
C . s p o o g e n e s
3 + + + + + + +
- +
C . t e t a n i 1 + + - + - - - - - -
C . h i s t o l y t i c u m 1 + - _ _ _ _ _ _ _
B a c i l l u s s p . 5 1 + - - - + - - - - -
E s c h e r i c h i a c o l i 1 + +
-
_ + + _
S t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s 1 + +
-
_ _ _ _ + _
B a c i l l u s f r a g i l i s 1 + +
- -
+
+ -+
a C o r r e c t e d f o r T r y p t i c a s e - p e p t o n e - y e a s t - g l u c o s e ( T P Y G ) b a s e l i n e l e v e l s . A b b r e v i a t i o n s : A , a c e t i c a c i d ; P ,
p r o p i o n i c a c i d ; i B , i s o b u t y r i c a c i d ; B u , b u t y r i c a c i d ; i V , i s o v a l e r i c a c i d ; V , v a l e r i c a c i d ; i C , i s o c a p r o i c i s o m e r ; L ,
l a c t i c a c i d ; S , s u c c i n i c a c i d .
b I s o l a t e d f r o m c o n t a m i n a t e d f o o d s .
2 9 8 N O T E S

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V O L . 2 9 , 1 9 7 5 N O T E S 2 9 9
T A L E 3 . S h o r t - c h a i n f a t t y a c i d s o f c o n t a m i n a t e d a n d n o n c o n t a m i n a t e d f o o d s
F a t t y a c i d s
S p e c m e n N o .
o f - _ _ _ _
S p e c i m e n s p e c i m e n s A P i B B u i V V i L S R R T s
3 . 5 6
M u s h r o o m s 4 4 - 4 - - - -
T o m a t o p a s t e 2 + + A _ _ _ -
S t r i n g b e a n s 2 + - _ _ _ _ -
T u n a 2 4
C h i l i s a u c e 2 + + - | | _ -
Ha m 2 +
M u s h r o o m s ( C l o s t r i d i u m 2 + + + + + + + _ + +
b o t u l i n u m B )
M u s h r o o m s ( B a c i l l u s s p . ) 1 + _ _ _ _ _ _ _ _
M u s h r o o m s ( P u t r e f a c t i v e 1 + + + + + + + + + +
a n a e r o b e s ) _ _ _ _
a
A b b r e v i a t i o n s a s i n T a b l e 2 , f o o t n o t e a .
b
P r e s e n t i n s o m e s p e c i m e n s .
o t h e r f a c u l t a t i v e a n d a n a e r o b i c s p e c i e s l i s t e d
w e r e c l e a r l y d i f f e r e n t a n d c o u l d b e d i s t i n -
g u i s h e d b y t h e a b s e n c e o f b u t y r i c a c i d .
T a b l e 3 p r e s e n t s t h e S C F A c o n t e n t o f s e v e r a l
c a n n e d f o o d s . A c e t i c , p r o p i o n i c , l a c t i c , a n d
s u c c i n i c a c i d s w e r e v a r i o u s l y d e t e c t e d i n l o w
c o n c e n t r a t i o n s i n n o n c o n t a m i n a t e d s p e c i m e n s .
C a n n e d m u s h r o o m s c o n t a m i n a t e d w i t h C .
b o t u l i n u m o r m i x e d p u t r e f a c t i v e a n a e r o b e s
( o t h e r t h a n C . b o t u l i n u m ) c o n t a i n e d a p p r o p r i -
a t e S C F A . O n t h e o t h e r h a n d , m u s h r o o m s
c o n t a m i n a t e d w i t h B a c i l l u s s p e c i e s h a d o n l y
a c e t i c a c i d .
I n s u m m a r y , b u t y r i c a c i d m a y b e r e g a r d e d a s
a p r e s u m p t i v e m a r k e r f o r C . b o t u l i n u m i n
c o n t a m i n a t e d f o o d s . O t h e r a c i d s ( i s o b u t y r i c ,
i s o v a l e r i c , i s o c a p r o i c , R R T s 3 . 5 6) m a y a l s o b e
p r e s e n t a n d c o u l d s u b s t a n t i a t e t h e p r e d i c t i o n .
A n a l y s i s f o r C l o s t r i d i u m - p r o d u c e d a m i n e s , n e u -
t r a l c o m p o u n d s , a n d l o n g - c h a i n f a t t y a c i d s m a y
s u p p l e m e n t t h i s c h r o m a t o g r a p h i c a p p r o a c h ( 1 ) .
I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t o t h e r n o n t o x i -
g e n i c c l o s t r i d i a , p a r t i c u l a r l y C . s p o r o g e n e s ,
m a y p r o d u c e s i m i l a r S C F A p r o d u c t s s o t h a t
f i n a l i d e n t i f i c a t i o n w o u l d d e p e n d o n s p e c i f i c
t o x i n a s s a y . Ho w e v e r , t h e s p e e d , s i m p l i c i t y ,
a n d s e n s i t i v i t y ( 0. 05 u n m o l m l ) o f t h i s a s s a y m a y
b e a d v a n t a g e o u s f o r r a p i d s c r e e n i n g o f m a s s i v e
s p e c i m e n l o t s b y s i n g l e o r p o o l e d s a m p l e t e c h -
n i q u e s .
We t h a n k D . A . K a u t t e r o f t h e F D A ( F o o d M i c r o b i o l o g y
B r a n c h ) f o r p r o v i d i n g u s w i t h m i c r o b i a l c u l t u r e s a n d c o n t a m -
i n a t e d f o o d s p e c i m e n s .
L I T E R A T U R E C I T E D
1 . Ho l d e m a n , L . V . , a n d J. B . B r o o k s . 1 9 7 0. V a r i a t i o n a m o n g
s t r a i n s o f C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m a n d r e l a t e d c l o s t r i d i a ,
p . 2 7 8 - 2 8 6. I n M . He r z b e r g ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e f i r s t
U . S . - Ja p a n c o n f e r e n c e o n t o x i c m i c r o o r g a n i s m s , m y c o -
t o x i n s , b o t u l i s m . U . S . D e p a r t m e n t o f I n t e r i o r , Wa s h i n g -
t o n , D . C .
2 . Ho l d e m a n , L . V . , a n d W. E . C . M o o r e . 1 9 7 2 . A n a e r o b e
L a b o r a t o r y M a n u a l . V i r g i n i a P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e a n d
S t a t e U n i v e r s i t y A n a e r o b e L a b o r a t o r y , B l a c k s b u r g , V a .
3 . Jo h n s o n , H. M . , K . B r e n n e r , R . A n g e l o t t i , a n d H. E . Ha l l .
1 9 66. S e r o l o g i c a l s t u d i e s o f t y p e s A , B , a n d E b o t u l i n a l
t o x i n s b y p a s s i v e h e m a g g l u t i n a t i o n a n d b e n t o n i t e f l o c -
c u l a t i o n . J. B a c t e r i o l . 9 1 : 9 67 - 9 7 4 .
4 . V e r m i l y e a , B . L . , H. W. Wa l t e r , a n d J. C . A y r e s 1 9 68 .
D e t e c t i o n o f b o t u l i n a l t o x i n s b y i m m u n o d i f f u s i o n . A p p l .
M i c r o b i o l . 1 6: 2 1 - 2 4 .

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