Olga Martins Marques (Prof

a
UNICAP - DQ)
Alexandra Amorim Salgueiro (Prof
a
UNICAP -DQ)
Maria Alie !omes de Andrade "ima (Prof
a
U#P$-D$Q)
Maria de "os Angeles Peres Pal%a (Prof
a
U#P$ - D$Q)
Sonia M
a
Sou&a Ca'alante de Al(uquerque (Prof
a
U#P$ -D$Q)
Recife - Pernambuco
1998
A)resenta*+o
A inexistncia de um text o de prticas de Microbiologia
Geral adaptado s nossas condi!es do nosso laborat "ri o# e destinado
aos cursos superiores de $ngen%aria &u'mica# &u'mica (ndust rial e
out ros# nos moti)aram reali*a+o deste manual, -s experimentos
foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos
no programa referentes primeira unidade do curso e podem ser
facilmente efetuados em laborat "rios de recursos limitados,
.ada experimento# poder ser efetuado por um grupo de
dois ou mais alunos, Muitas )e*es o experimento pode ser di)idido
entre )rios grupos da classe# sendo /ue cada grupo de)e fa*er o
experiment o numa det erminada condi+o, 0este caso# o instrut or de)er
fa*er uma discuss+o a posteiori e global do problema apresentado,
1
PRTICA N 1
OBJETIVOS:
2iscriminar as fun!es e3ou aplica!es
4impar
Acondicionar
1. FUNES E/OU APLICAES DO MATERIAL DO
LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
1.1. Matera! Per"a#e#te
a, Autola'e - c5mara de )apor com parede dupla# e/uipada com
dispositi)os /ue permitem o enc%imento da c5mara com )apor
saturado e sua manuten+o em det erminadas t emperat ura e press+o
por /uais/uer per'odos de tempo, - aut ocla)e 6 um e/uipament o
indispens)el ao laborat "rio de microbiologia na esterili*a+o de
meios de cultura# gua# suspens!es et c, 7)er modo de opera+o8
(, $stufas de $sterili&a*+o (#ornos de Pasteur) - esterili*a a seco
t oda )idraria con)enientemente acondicionada# a t emperat ura de 19:
a 1::
o
. por 1-1 %oras,
, -efrigerador - utili*ado na conser)a+o de culturas de
microrganimos sob baixa temperatura# diminuindo o t empo de gera+o
d, $stufa (ateriol.gia - fa)orece o crescimento de microrganismos
pela incuba+o na t emperat ura ade/uada,
Inu(a*+o ; manuten+o do meio semeado em determinadas
condi!es para promo)er o desen)ol)imento dos microrganismos,
e, Mesa agitadora (rum(eira) - fa)orece o crescimento de
microrganismos aer"bios# pela dissolu+o do oxignio no meio#
atra)6s da agita+o da mesa# em mo)imentos rot at "rios,
f, Ca(ine de fluxo laminar - c5mara ass6ptica# dot ada de exaust or e
l5mpada fluorescente# sendo utili*ada em repi/ues de microrganismos
g, #ermentador - e/uipament o onde ocorrem as fermenta!es# podendo
ser dot ado de sistemas de agita+o# aera+o# refrigera+o,
1.$. V%rara
<
a, /u(o de ensaio (tu(o de ultura) - utili*ado no culti)o de
microrganismos em pe/ueno )olume de meio e na conser)a+o de
culturas puras de microrganismos,
(, Plaa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos de)ido
grande superf'cie de crescimento /ue apresenta# possibilitando o
aparecimento de col=nias separadas,
Col0nia 1 aglomerado de c6lulas em meio s"lido# geralmente
originadas de uma >nica c6lula progenitora,
, Pi)eta - para diluir prepara!es di)ersas e inocular culturas l'/uidas
I nocul ar = i nseri r, i nt r oduzi r
In.ulo (ou semente) 1 concentra+o de c6lulas suficientes para
culti)ar uma de meio com bom rendimento
d, Pi)eta Pasteur - 6 um t ubo de )idro espic%ado em capilar# utili*ada
para t ransport ar pe/uenos )olumes de l'/uido
e, Al*a de Drigals23 - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa#
dobrada em 5ngulo ret o e depois em ?@. na c%ama, A utili*ada para
espal%ar microrganismos em meio de cultura s"lido,
f, 4al+o de fundo %ato- utili*ado geralmente para guardar meios de
cultura,
g, $rlenme3er - utili*ado para propaga+o celular de microrganismos
em meio l'/uido sob agita+o em mesa agitadora,
%, #ern(a% - idem
i, "5mina - para examinar microrganismos ao microsc"pios

"5mina $sa'ada - possui uma ou duas depress!es possibilitando
obser)ar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de
l'/uido 7$nsaio em got a pendente8
6, "am7nula - utili*ada para recobrir prepara!es microsc"picas Bin
)i)o
1.3.Materiais utilizados em ti tul a&'e() %e(t! a&'e()
*re*ara&'e( %e (+!,&-+ e %e "e+( %e .,! t,ra - Ce/uer# bast+o
de )idro# buret a# funil# pro)eta# bal+o )olum6trico# condensador dentre
out ros,
1./. D0er(+(
a, "8)is dermatogr8fio - utili*ado para escre)er em superf'cie de
)idro
?
(, Algod+o (ruto (ou ardado) - ser)e para prot eger o material
esterili*ado# do contat o com o ar ambiente,
, Ca(o de 9olle - feito com material isolante# adaptado em t rs formas
7c'rculo# ele# agul%a8, Der)e de suporte para um fio de platina ou uma
liga n'/uel-cromo# sendo utili*ado em inocula+o de microrganismos,
$. DESINFEC1O
a, Desinfe*+o do ar:
- at ra)6s da )apori*a+o de uma solu+o de %ipoclorit o de s"dio a
1EF
- pelo uso de l5mpadas de lu* ultra)ioleta,
- pode ser feita periodicamente com a )apori*a+o de uma
solu+o de formalina 7formol a ?:E8# no entant o# esta solu+o n+o se
pode usar para a desinfec+o de ambientes ocupadosF
(, Desinfe*+o da (anada:

Antes da reali*a+o de um determinado t rabal%o de microbiologia#
a bancada de)e ser limpa com uma solu+o detergente seguida de uma
solu+o alco"lica a 9:E,
, Desinfe*+o da 'idraria:
- vidraria contaminada - de)er ser inicialmente esterili*ada em
aut ocla)e para /ue t oda flora presente seGa dest ru'da e# em seguida
la)ada com uma solu+o det ergente ou sab+o neutroF
- vidraria sem contaminao - idem ao anterior# por6m sem
necessidade de aut ocla)a+o,
Observao: n+o 6 costume se utili*ar solu+o sulfocr=mica na la)agem
dos materiais do laborat "ri o de microbiologia# uma )e* /ue esta solu+o
cont 6m cromo /ue 6 um metal /ue pode intoxicar as c6lulas )i)as e
tamb6m por ser de dif'cil remo+o no material
2. ACONDICIONAMENTO
a, Plaas de Petri - embrul%adas com papel# geralmente formando
conGunt o de < unidades, A /uantidade depende da necessidade do
t rabal%o,
@
(, Pi)etas - obtura-se as bo/uil%as com mec%a de algod+o 71cm8 para
filtrar o ar soprado e para prot eger o operador durante a manipula+oF
em seguida s+o enroladas uma a uma com papel# anot ando a capacidade
de cada uma,
, /u(os de ensaio; (al<es de fundo %ato; $rlenme3ers; fern(a%s -
s+o preparados introdu*indo-se um tamp+o de algod+o cardado na boca
do recipiente, $sse tamp+o de)e ser feito# enrolando o algod+o no
sentido da fibra em /uantidade suficiente para facilitar o manuseio# isto
6# n+o de)e ser nem muito apertado# nem muito frouxo,
d, "5minas - mergul%adas em solu+o alco"lica# ficam apt as a serem
utili*adas a /ual/uer momento# e)itando paralelamente /ue seGam
arran%adas,
A/$N=>O: Hoda )idraria utili*ada no laborat "ri o de microbiologia
antes de ser preparada para esterili*a+o de)er estar limpa e seca,
$S/$-I"I?A=>O $M AU/OC"A@$
O)era*+o: ligar o aparel%o rede el6trica, Ap"s a coloca+o do
material dent ro do aut ocla)e# a t ampa 6 fec%ada e a t orneira de remo+o
de ar ou )apor 6 deixada abert a para remo)er t odo o ar, &uando t odo o
ar for remo)ido# deixe /ue um fluxo de )apor fluente persista por cerca
de @ minutos# antes de fec%ar a t orneira, A partir de ent+o a press+o
internamente ir aumentar e c%egar press+o de esterili*a+o usada#
/ue 6 de 1@ lb3pol
1
# ou 1atm# ou 1 Igf3cm
1
# correspondendo a uma
temperatura de 111
:
., - tempo de exposi+o do material no interior
deste e/uipamento ir depender do )olume de l'/uido a ser esterili*ado,
Para pe/uenos )olumes# at 6 < litros# podem ser esterili*ados durante 1:
a <: minutos a uma press+o de 1@ lb3pol
1
, .om rela+o a maiores
)olumes# ser necessrio# uma exposi+o mais prolongada, &uando a
temperatura re/uerida para a esterili*a+o 6 alcanada# de)e-se comear
a cont ar o tempo# usando um rel"gio de laborat "ri o 7com alarme8,
2ecorrido o tempo desliga-se o aparel%o da corrente el6trica e mant6m-
se a aut ocla)e e a t orneira de ar e )apor fec%ados# at 6 o man=met ro
)oltar ao pont o *ero# pois /uando a press+o da aut ocla)e 6 ali)iada
rapidamente# os l'/uidos dentro dos tubos e frascos fer)em
)iolentamente# fa*endo com /ue os t amp!es seGam arremessados para
fora dos mesmos,
.onclu'da a esterili*a+o# abre-se a t orneira de )aporF em seguida
a tampa do aut ocla)e 6 le)antada,
PRTICA N 2
OBJETIVOS:
Hrabal%ar assepticamente
.ulti)ar microrganimos
2iferenciar macroscopicamente fungos# le)eduras# bact6rias
J
INTRODU1O
- %omem no seu meio ambiente con)i)e com in>meras formas de
)ida, -s microrganismos ocupam lugar de desta/ue t ant o pelos
benef'cios como pelos malef'cios /ue proporcionam ao %omem# sendo
encont rados na nature*a em abund5ncia e )ariedade de formas, Para /ue
os mesmos seGam culti)ados artificialmente 6 necessrio con%ecer suas
exigncias nut ricionais e suas condi!es f'sicas de crescimento#
t rabal%ar com material esterili*ado e obdecer s normas de prtica
ass6ptica,
2ependendo da finalidade da opera+o# os microrganimos podem
ser culti)ados emK l5minas# placas# t ubos# bal!es# fernbac% ou
recipientes de maior capacidade, - culti)o em l5mina 6 utili*ado /uando
se deseGa acompan%ar microscopicamente o cresciment o e reprodu+o de
um microrganismo, $mprega-se o culti)o em placas /uando se /uer
isolar esp6cies microbianas distintas# de)ido extensa rea de superf'cie
/ue apresenta, Por6m# de)ido pe/uena /uantidade de meio em
exposi+o ao ar# com fre/uncia ocorre ressecament o e3ou apareciment o
de cont amina!es,
.ulti)ando os microrganismos em tubos# % facilidade de
manipula+o das culturas# al6m da )antagem de economi*ar meio e
espao f'sico, Para se obt er grandes )olumes de cultura# o
microrganismo 6 culti)ado inicialmente em bal!es# fernbac%# para depois
ser t ransferido para recipiente maior# cuGa capacidade 6 fun+o da
necessidade do t rabal%o,
NORMAS ! PRTICA ASS"PTICA
1, 0+o t rabal%ar em corrent e de ar# nem ambiente agitado pelo ac>mulo
de pessoasF
1, 0+o falar nem respirar em frente ao recipiente abert o cont endo
material de estudoF
<, Abrir o recipiente inclinado Gunto c%ama# onde o ar est rarefeito de
formas )i)asF
?, Retirar o t amp+o de algod+o com o dedo m'nimo e a palma da m+o
sem t ocar na boca do recipiente e sem encost ar o t amp+o em lugar
algumF
@, Llambar a boca do recipiente sempre /ue for iniciar uma inocula+o#
para /ue uma corrente de ar /uente seGa formada de dentro para foraF
J, (nt rodu*ir o mais rpido poss')el a ala ou pipeta sem t ocar nas
paredes do recipienteF
9, Ao t erminar a inocula+o# flambar a boca do recipiente e aGustar o
t amp+o# conser)ando o material ao abrigo da poeira e umidade,
9
PROCEDIMENTO PR3TICO
4impar a bancadaF
Marcar t odo material 7placa e t ubos8# especificando o tipo de meio e
a fonte da inocula+oF
Lundir dois meios de cultura diferentes 7por exemplo A0 e .M8F
2istribuir os meios em placas de Pet ri e t ubos 7inclinar8F
$sperar solidificarF
La*er inocula!es nas superf'cies dos meios distribu'dos em placasF-
(ncubar na t emperat ura ambiente por 1 a @ dias# n+o es/uecendo de
guardar placas sem inocular# uma de cada meio utili*ado para
controle da esterili*a+o e da eficcia da t 6cnica utili*ada,
#ON/$S: gua polu'da# ferment o de padaria# ar# garganta# m+os#
cabelo# suor etc,
DIFERENCIA1O MACROSCPICA DOS MICRORGANISMOS
-s microrganimos crescem e reprodu*em /uando culti)ados e
inoculados ade/uadamente, Podemos fa*er a)alia+o dos grupos aos
/uais eles pertencem# por obser)a!es das caracter'sticas das col=nias
nos meios em /ue eles foram culti)ados, - cresciment o em meio l'/uido
pode ser e)idenciado pela tur)a+o# pela forma+o de pe/uena massa de
c6lula /ue flotam 7)elo8 ou por sedimenta+o das c6lulas, $m placas de
Pet ri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio s"lido#
obser)ando-se o aparecimento de col=nias cuGos aspect os
macrosc"picos auxiliam na diferencia+o de grupos microbianos,
I) Desri*+o de ol0nias em )laas de Petri:
Ap"s o per'odo de incuba+o preestabelecido as col=nias de
microrganismos culti)ados em placas de Petri podem ser descritas de
acordo com os seguintes crit6riosK
a, forma:
circular ri*oide irregular filamentosa
8
(, quanto A dimens+o
puntiforme com menos de 1 mm de di5metro
, romogBnese
-cor do pigmento
-pigmento sol>)el ou insol>)el no meio
d, su)erf7ie

plana # ele)ada# con)exa# lisa# rugosa# seca# bril%ante# t ransl>cida#
opaca# pregueada# pul)erulenta
II) Desri*+o da ultura em aldo nutriente
- crescimento em caldo de cultura pode apresentar-se sob
diferentes formas,
a, tur(ide&: mais ou menos acentuada
(, forma da )el7ula: uma massa de c6lulas /ue flutua superf'cie do
caldo
, sedimento: dep"sito de c6lulas no fundo do t ubo,
-bser)a+oK ,
, As col=nias de fungos s+o geralmente grandes e filamentosas# algumas
)e*es ocupam t oda a placa onde est+o culti)adas,
, As col=nias de le)eduras s+o pe/uenas e leitosas# en/uanto as de
bact6rias s+o menores e bril%antes sendo algumas t +o pe/uenas /ue se
denominam puntiformes,
PRTICA N 3
O#$!TI%OS&
2istinguir os di)ersos componentes de um microsc"pio "tico
compost o
9
Locali*ar Bin )i)oNK c6lulas de le)eduras em suspens+o#
microrganismos 7algas# prot o*orios e bact6rias m")eis em gua8
COMPON!NT!S ! 'M MICROSC(PIO (TICO COMPOSTO
I - PARTE MEC4NICA&
C, 4ase ou )D - dispositi)o de taman%o e peso suficiente para assegurar
o e/uil'brio est)el do instrument o# e)itando trepida!esF
E, Cor)o; (ra*o ou oluna - %aste destinada a sustentar o tubo
microsc"pico e conter os mecanismos de mo)imentoF alguns apresentam
articula+o# facilitando a obser)a+o do pes/uisadorF
F,/u(o ou an%+o miros.)io - cilindro oco /ue ser)e de suporte
para os dois sistemas de lentes 7oculares e obGeti)as8F
G, -e'.l'er - pea girat "ria onde ficam fixadas as lentes obGeti)as#
permitindo /ue cada lente possa ser colocada em foco 7 uma de cada
)e*8#
isto 6# em coincidncia com o eixo "ticoF
H, Platina - plataforma %ori*ontal com uma abertura circular no cent ro
por onde passam os raios luminosos, $xistem platinas m")eisF
I, Pin*a ou )resil%as - alas flex')eis e aGust)eis# situadas na platina,
D+o utili*adas para fixar a l5minaF
J, KC%arriotL- dispositi)o facultati)o /ue permite a mo)imenta+o da
l5mina em dois sentidosK %ori*ontal e )ertical# pela manipula+o de dois
parafusosF
M, Sistema de remal%eira - pea munida de dentes# controlada pelos
parafusos macrom6t rico e microm6tricoF
a8 Macrom6trico - ocasiona diferentes aproxima!es ent re a obGeti)a e a
prepara+o# )ariando a dist5ncia )ertical de )rios cent'metros, Der)e
para t ra*er o obGeto ao foco aproximadoF
b8 Microm6trico - permite m'nimos deslocamentos )erticais da ordem de
cent6simos de mil'metros# sendo utili*ado na focali*a+o finalF
O(ser'a*+o: 0os microsc"pios mais modernos existe um >nico
parafuso /ue oferece o cont role destes dois mo)imentos,
II - PARTE TICA
C, #onte luminosa:
1:
C, C, Natural - lu* solar
C, E, Artifiial - l5mpada
C, E, C, Direta - /uando a l5mpada est fixada no eixo "tico
C, E, E, Indireta - /uando se utili*a fonte luminosa anexa ao
microsc"pio,

E, $s)el%o - girando em t orno de um eixo# 6 utili*ado para refletir os
raios luminososF pode ser c=nca)o ou plano# aumentando ou diminuindo
a intensidade da lu*# respecti)amenteF
F, Diafr8gma - controla a extens+o angular do feixe luminoso#
redu*indo o 5ngulo do cone de lu*# de modo /ue n+o exceda o di5metro
da obGeti)a ap"s at ra)essar o obGetoF

G, Condensador - conGunto de lentes con)ergentes /ue proG eta sobre a
prepara+o o feixe de lu* em forma de um amplo coneF por
deslocament os )erticais diminui ou concentra a lu* no obGet oF

H, "entes o(6eti'as - s+o as lentes /ue ficam pr"ximas ao obGet o#
formando na parte superior do t ubo microsc"pico uma imagem in)ertida
e ampliada do obGeto, Podem serK a8 a seco - /uando o meio ent re o
obGet o e a lente 6 o ar# podendo ser de pe/ueno# m6dio ou grande
aumentoF b8 de imers+o - /uando a lente fica mergul%ada numa camada
de l'/uidoF
I, Sistema de lentes oulares - apresenta um conGunt o de lentesK lente
de campo 7corret ora8 /ue corrige a esfericidade da imagem e a lente
ampliadora /ue at ua em conGunt o com o obser)ador como uma simples
lente de aumento# aumentando a imagem formada pela obGeti)a,
MANIPULA1O DO MICROSCPIO
C, Instala*+o do a)arel%o
Retirar o microsc"pio da caixa ou armrio pelo brao e coloc-lo
na mesa apropriada 7c%umbada e ni)elada8F a seguir ligar a fonte
luminosa e dispor a obGeti)a no re)"l)er e regular a altura do banco# de
maneira a permitir um t rabal%o confort )el,
E, Ilumina*+o de am)o
De a lu* utili*ada 6 uma lu* natural# usar a face plana do espel%o#
caso contrrio# a face c=nca)a, $m /ual/uer caso# a lu* de)e cobrir
completamente a superf'cie do espel%o e este de)e estar centrado de
maneira /ue o cone luminoso refletido at ra)esse completamente o
condensador 7/ue de)e estar completamente le)antado# com o diafragma
abert o8 bem como a abertura da platina# de t al sorte /ue o campo do
microsc"pio 7ist o 6# o espao da platina )isuali*ado com a ocular8 fi/ue
t ot almente iluminado,
11
F, Ada)ta*+o da )re)ara*+o
.olocar a l5mina cont endo a prepara+o sobre a platina e prend-
la# depois# com o aux'lio do .%arriot # deslocar o conGunt o de t al forma
/ue a prepara+o contida na l5mina# fi/ue sobre a abert ura da platina#
perfeitamente iluminada pelo cone luminoso,
G, $sol%a da o(6eti'a
a) )re)ara*<es a freso (KIn 'i'oL): t rabal%ar apenas com obGeti)as a
seco# comeando pela de menor aument oF
() )re)ara*<es oradas (KIn 'itroL):
- focali*ar inicialmente com a obGeti)a a seco de menor aument oF
- girar o re)"l)er de maneira /ue nen%uma das obGeti)as fi/uem em usoF
- colocar sobre a prepara+o uma pe/uena got a de "leo de imers+oF
- colocar no eixo "tico a obGeti)a de maior aument o 7imers+o8
H, Ilumina*+o da )re)ara*+o
Para as prepara!es coradas /ue d+o imagens por absor+o# usar
o mximo de ilumina+o com o condensador completamente ele)ado e o
diafragma t ot almente abert o, Para as prepara!es a fresco# /ue d+o
imagens por refra+o# iluminar menos a fim de /ue o fen=meno seGa mais
percept')el, .omear descendo o condensador# a uns dois teros da sua
abert ura# depois ol%ando pela ocular# regular o cone luminoso# fec%ando
aos poucos o diafrgma,
I, #oali&a*+o
A a opera+o /ue consiste em t ra*er o obGet o para o foco da
obGeti)a# formando a imagem /ue# ampliada pela ocular# ser )ista pelo
obse)ador, A focali*a+o consta das seguintes et apasK
a8 girar o re)"l)er colocando a obGeti)a de menor aument o no eixo
"ticoF
b8 aGustar a ilumina+o de campoF

c8 cent rali*ar a prepara+oF
d8 aproximar ao mximo a prepara+o# da obGeti)a de menor aument o#
por meio do mecanismo de mo)imento, 2urante este t rabal%o de)er ser
obser)ado a aproxima+o diretamente com a )ista# n+o de)endo ser
utili*ado a ocularF
11
e8 obser)ando ent+o pela ocular# imprimir mo)imento moderado de
afastamento ent re a prepara+o e a obGeti)a# at 6 /ue seGa distinguida a
imagem do obGet oF
f8 mo)imentar o microm6trico para focali*a+o finalF
g8 regular o diafragma e o condensador para )isuali*ar com mais
nitide*F
%8 para t rocar de obGeti)a basta o re)"l)er e em seguida aGustar o foco
imprimindo mo)imentos lent os no microm6t ricoF
i8 ao t6rmino da obser)a+o# girar o re)"l)er at6 a menor obGeti)a e
apagar a lu*, Retirar a l5mina e colocar num recipiente com detergente,

OBSERVAO: &uando o microsc"pio 6 binocular de)e-se aGust ar a
dist5ncia inter-ocular de t al forma /ue o obser)ador )isuali*e um s"
campo de lu*, Hrabal%ando com microsc"pio monocular# procurar
manter ambos os ol%os abert os# a fim de e)itar fadiga,
J, Causas de erro na o(ser'a*+o
a8 -bscuridade t ot al do campo - m cent rali*a+o do aparel%o de
ilumina+o
b8 -bscuridade parcial - re)"l)er mal cent rado# )erificar se o pont o em
/ue % resistncia n+o foi atingido ou foi ultrapassado,
c8 Lalta de nitide* da imagem
- prepara+o in)ertida ou com suGosF
- ocular suGa - )erificar se rodando-a# o suG o acompan%a o mo)imentoF
limpar a obGeti)aF
- obGeti)a suGa ou com arran%+o - limpar com mistura xilol-6terF
- aparel%o de ilumina+o - falta de cent rali*a+o# poeiras depositadas ou
obGet os est ran%os interpost os na marc%a dos raiosF
d8 2ificuldade subGeti)a
.orp>sculos de forma di)ersas /ue parecem deslocar-se no
campo, .om alguma prtica# )erifica-se /ue eles s+o independentes da
prepara+o# e pro)m do obser)adorF repousar um pouco e repetir a
opera+oF
e8 Mo)imento Crauniano
&uando os microrganismos deslocam-se num s" sentido de)ido
correntes l'/uidas formadas por e)apora+o da gua durante a
1<
obser)a+o nas prepara!es B(n )i)oN, Dalientando /ue o mo)imento
dos microrganismos 6 aleat "rio,
M, Conser'a*+o dos miros.)ios
- aparel%o de)e estar sempre prot egido# seGa com capa plstica#
seGa com caixa pr"pria e guardado em ambiente pro)ido de lu* artificial
para e)itar o crescimento de fungos, A cada utili*a+o o p" do
microsc"pio de)er ser remo)ido com um pano limpo,
$)itar a a+o de )apores cidos e cont at o com reati)osF s"
manuse-lo com m+os limpasF s" obser)ar prepara!es limpas e t er o
cuidado de n+o deixar escorrer nada sobre a platina ao adapt ar a
prepara+o, De ist o ocorrer# limpar imediatamente# se necessrio com
gua destilada# enxugando a seguir,
As oculares de)em ser limpas externamente com papel de seda e
internamente# por um t6cnico# s" /uando necessrio,
A obGeti)a de imers+o 6 limpa com papel de filtro ou algod+o
umedecido com uma mistura de xilol e 6ter na propor+o de 1K1# /ue
de)e ser imediatamente remo)ido com papel ou algod+o limpo,
A permanencia de xilol sobre a lente causa des)itrifica+o da
mesma,
0unca deixe ficar "leo na lente pois ali resinifica e depois para
limpar# exige excesso de dissol)ente# podendo este penet rar no sistema#
dissol)endo o blsamo /ue liga as di)ersas part es,
As obGeti)as a seco s+o limpas com um lin%o macio e
ocasionalmente# com papel umedecido com gua destilada,
A parte interior das obGeti)as n+o de)e ser limpa usualmente e
/uando 6 feito de)er ser praticada por pessoa %abilitada, 2e)e-se
remo)er a obGeti)a e passar sua)emente um pincel macio ou uma buc%a
de pano macio na ext remidade de uma %aste, 0+o se de)e assoprar para
e)itar a umidade, $sta opera+o de)er ser feita com muito cuidado
para n+o descentrali*ar as obGeti)as,
As lentes do aparel%o de ilumina+o s+o limpas como as demais#
com fre/uncia pois delas depende a boa ilumina+o fornecida,
A parte mec5nica 6 limpa e polida com uma flanela e a cremal%eira
com "leo detergente fino,
Para uma boa conser)a+o do microsc"pio o operador de)er
seguir uma rotina diria /ue )ai desde uma simples remo+o do p" at 6
uma lubrifica+o mensal de t odas as partes m")eis com um "leo fluido,
A cada t rimestre o aparel%o de)e ser en)iado a um t 6cnico especiali*ado
para uma inspe+o rigorosa# limpe*a e lubrifica+o geral,

1?
PRTICA N )
O#$!TI%OS&
Reali*ar colora+o simples
-bser)ar microrganismos diferentes sob obGeti)a de imers+o
2iferenciar le)eduras de bact6rias considerando o taman%o celular
O#S!R%A*+!S ,IN %I TRO-
-s microrganismos s+o usualment e t ransparentes# t ornando dif'cil o
estudo de det al%es morfol"gicos /uando s+o examinados em seu
estado natural# assim t orna-se necessrio a utili*a+o de t 6cnicas de
col ora+o,
As obser)a!es microsc"picas Bin )itroN s+o reali*adas com o
microrganismo pre)iamente fixado + l5mina, 0estas condi!es as c6lulas
microbianas s+o obser)adas mortas,
Ap"s a fixa+o# submete-se a prepara+o etapa de colora+o
pela adi+o de solu!es ade/uadas em fun+o da t 6cnica de colora+o
deseGada,
As t6cnicas de colora+o n+o s" facilitam a )isibilidade das
c6lulas microbianas# como t amb6m# propiciam a )isuali*a+o de
det erminadas estrut uras celulares em fun+o de afinidades espec'ficas
com det erminados corantes# e facilitam identifica+o de micorganismos
de)ido a comport ament o diferentes frente a+o de solu!es
diferenciadoras,
A menos /ue algum aspect o morfol"gico espec'fico# dependente
de idade da cultura# de)a ser demonstrado# o microbiologista de)e usar
sempre cultura no)a nas obser)a!es microsc"picas, As c6lulas com o
tempo de culti)o# modificam o metabolismo# alterando a afinidade com
muitos corantes, $xcluindo os organismos /ue tm um tempo de gera+o
especialmente grande# uma cultura com 1? %oras de culti)o dar sempre
bons resultados,
S'#ST.NCIAS CORANT!S
Degundo 4angeron# corantes s+o subst5ncias coradas /ue go*am
da propriedade de t ransmitir cor a out ros corpos,
Muitas s+o as subst5ncias corantes empregadas na rotina diria
dos laborat "rios# a maioria deri)ados da anilina# podendo ser
classificados em naturais e artificiais, $ntre os naturais destacam-seK o
carmim# a %emat oxilina, -s artificiais s+o agrupados em fun+o dos
grupos /u'micos presentes e da afinidade com estruturas celulares#
podendo serK
1@
a) 48sios ou nulearesK )ioleta de genciana# cristal )ioleta# )erde de
mala/uita# a*ul de metileno# fucsina bsica# a*ul de t oluidina# )erde de
metila et c,
() Nidos ou ito)lasm8tios K eosina# fluoresce'na# fucsina cida#
orange G# )ermel%o congo# cido picrico etc
) NeutrosK eosinato de a*ul de metileno e de a*ul AMOR# giensa et c,

PR!PARA*/O ! 0I1A*/O ! !S0R!2A*O
$m processos de colora+o de rotina# uma boa obser)a+o
microsc"pica depende tant o da prepara+o do esfregao como de sua
fixa+o l5mina,
T"CNICA
. Llambar a ala de platina 7Bem c'rculoN8 ao rubro# deixar esfriar#
conser)ando-a pr"xima c%amaF
. 2epositar com o aux'lio da ala# got as da suspens+o microbiana na
l5mina# se for o caso# suspender a amostra da cultura na pr"pria l5minaF
, $spal%ar bem o material na l5mina# empregando mo)imentos
rot acionais na ala de platina 7 do cent ro para a periferia8# a fim de se
obt er um esfregao de forma o)al# bem fino e uniformeF
, Decar a fina pel'cula do material 7esfregao8 ao ar ou pela passagem
na c%ama do bico de CunsenF
, Lixar o esfregao# passando o dorso da l5mina t rs )e*es ou mais na
c%ama# a fim de /ue o material fi/ue bem aderido l5minaF
, 2eixar a prepara+o esfriar ao ar e corar,
A fixa+o do esfregao com gua pode formar aeross"is
7part'culas proGetadas durante a fer)ura de l'/uidos8F e)ita-se
introdu*indo a l5mina no cone a*ul da c%ama 7parte redut ora# a mais
/uente8# permanecendo alguns instantes a fim de secar o material,
A prepara+o e fixa+o do esfregao re/uer cuidados e)itando-se
t rat ament os bruscos# para /ue as c6lulas da amostra a serem obser)adas
n+o fi/uem aglomeradas dificultando a obser)a+o# como tamb6m n+o
ten%am seus arranGos caracter'sticos dest ru'dos,
CO3ORA*/O SIMP3!S
2enomina-se de colora+o simples colora+o em /ue se adiciona
/ual/uer solu+o corant e ao esfregao fixado durante um det erminado
1J
tempo 7<:s a < min8 em fun+o do corant e utili*ado, 2epois la)a-se a
l5mina em gua corrent e# seca-se e obser)a-se usando a obGeti)a de
imers+o,
$ssa colora+o tem a finalidade de nos d uma )is+o da forma# do
taman%o e dos arranG os das c6lulas# bem como de out ros det al%es
estrut urais,
T"CNICA

1, Preparar e fixar o esfregaoF
1, .obrir com algumas gotas de uma solu+o corant e 7a*ul de metileno#
cristal )ioleta# fucsina# safranina8F
<, 2eixar o corant e agir por J:sF
?, 4a)ar em gua correnteF
@, Decar cuidadosamente na c%ama ou com papel absor)enteF
J, -bser)ar com a obGeti)a de imers+o 7n+o es/uecer de colocar 1 got a
de "leo de imers+o antes de adaptar a referida obGeti)a no eixo "tico8,
O4se5a67o& 0+o se de)e facilitar com os pap6is absor)entes usados#
especialmente se os microrganismos em estudo forem pat "genos,
PRTICA N 8
O#$!TI%OS&
Reali*ar colora+o 2iferencial de Gram
-bser)ar ao microsc"pio sob imers+o as prepara!es
in )itro
2iferenciar as formas de bact6rias 7cocos# bacilos8 e arranGos
celulares 7 em cadeia# t6t rades# c>bicos# em cac%os8,
COLORAES DIFERENCIAIS
As colora!es diferenciais distinguem grupos de microrganismos
entre si# de)ido diferenas /u'micas existentes entre as c6lulas
microbianas,
0esta t 6cnica de colora+o utili*a-se inicialmente solu!es de
corantes e mordentesF numa segunda etapa um agente diferenciadorF
para finalmente reali*ar out ra colora+o /ue cont rasta com a primeira,
COLORA1O DIFERENCIAL DE GRAM
$m 188?# .PR(DH(A0 GRAM descobriu um m6todo de
colora+o# baseado no fato de /ue# /uando cert as bact6rias s+o coradas
pelo cristal de )ioleta e depois t rat adas pelo iodo 7solu+o iodo-
iodetada# dita lugol8#forma-se um compost o de colora+o escura entre o
19
iodo e o corant e# o /ual 6 fortemente remo)ido pelo t rat ament o
subse/Qente com lcool 7diferenciador8, D+o as bact6rias Gram
positi)as# as /ue t omam o corante de Gram 7cristal )ioleta8, -ut ras
bact6rias# ditas Gram negati)as# deixam-se descorar facilmente pelo
lcool, Assim sendo# se ap"s a a+o do lcool# fi*ermos uma colora+o
de fundo pela safranina ou pela fucsina bsica# as bact6rias Gram
negati)as aparecer+o )ermel%as,
MECANISMO DA COLORA1O DE GRAM
As bact6rias Gram positi)as e Gram negati)as interagem com o
corante cristal )ioleta de)ido liga!es ir=nicas ent re os grupos bsicos
dos corantes e grupos cidos dos constituintes celulares, - iodo em
solu+o penet ra nos dois tipos de c6lulas e forma um precipitado com o
corante, - agente descorante 7lcool et'lico ou acet ona8 nas c6lulas
Gram negati)as passa facilmente atra)6s da membrana celular
dissol)endo o complexo corante-iodo# deixando a c6lula incolor, 0as
c6lulas Gram positi)as o lcool penetra com dificuldade e a dissolu+o
do complexo 6 lenta, A maior part e do complexo corante-iodo
permanece na c6lula /ue ret6m assim a sua colora+o, Pela adi+o do
cont ra-corant e 7safranina ou fucsina bsica8 as c6lulas Gram positi)as
permanecem )ioletas en/uant o as Gram negati)a interagem com o
mesmo# ficando )ermel%as,
As diferenas /u'micas entre os constituintes da parede celular
das bact6rias s+o respons)eis pela ret en+o ou n+o do cristal )ioleta,
Hodas as c6lulas despro)idas de parede celular 7cert os
prot o*orios8# bem como as c6lulas artificialmente despoGadas de parede
celular 7mesmo /ue seGam Gram positi)as8# comport am-se como Gram
negati)as,
As bact6rias Gram negati)as cont m uma concentra+o ele)ada de
lip'deos# e suas paredes s+o tamb6m mais delgadas com rela+o s
bact6rias Gram positi)as, - descorament o extrai os lip'deos aumentando
a porosidade ou permeabilidade da parede fa)orecendo a retirada do
complexo cristal )ioleta-iodo,
As paredes celulares das bact6rias Gram, positi)as em )irtude de
sua composi+o diferente 7menos conte>do lip'dico# presena de cido
teic"ico# maior /uantidade de pept oglicano 7mucocomplexo8 cuG os
aminocidos encont ram-se mais intercru*ados# deixando a parede mais
compacta8# t ornam-se desidratadas durante o t rat ament o com o
descorant eF a porosidade diminui# a permeabilidade se redu* e o
complexo cristal )ioleta-iodo n+o 6 ext ra'do,
- m6t odo de Gram 6 dentre os processos de colora+o para
bact6rias# o mais import ante,
Hodas as le)eduras /uando submetidas a esta colora+o
comport am-se como Gram positi)as# en/uant o os fungos filamentosos e
para os prot o*orios# geralmente n+o se aplica esta t6cnica por n+o ser
con)eniente,
18
-$!-AS !$-AIS DA CO"O-A=>O P$"O MO/ODO D$ !-AM
C - -s cocos# s+o geralmente Gram-positi)os# com exce+o dos
pert encentes ao gnero Neisseria 7Gonococos , Meningococos 8,
E - -s bacilos# s+o geralmente Gram-negati)os# excetuando-se os
pert encentes aos gnerosK Corynebacterium 7bacilo dift6rico8F Bacil lus
7B. subtil is 8# B. antracis 7do carb>nculo8 e Clostridium 7bacilo do
t6t ano
Cl , tetani F Cl. botul inum 7do bot ulismo8,
T5CNICA DA COLORA1O DE GRAM
1, Preparar um esfregaoF
1, 2epois de frio cobrir o esfregao com solu+o de cristal de )ioleta
71 minuto8F
<, .obrir com solu+o de lugol 7mordente8 - 1 minutoF
?, 4a)ar em gua corrent eF
@, 2escorar pelo lcool absoluto 7e)itar o descorament o deficiente ou
em excessoF
J, 4a)ar em gua corrent eF
9, .ont rastar# rapidamente com safranina 7<: segundos8F
8, 4a)ar em gua corrent eF
9, Decar com papel finoF
1:, $xaminar com obGeti)a de imers+o,
AMOSTRAS:
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes
Stah!lococcus aureus
Sarcina lutea
"icrococcus
PRTICA N 9
O#$!TI%OS&
Reali*ar colora+o $special de esporos
-bser)ar ao microsc"pio sob imers+o as prepara!es coradas
COLORA1O DE ESPOROS
-s esporos s+o c6lulas de resistncia# n+o sendo caract er'stica
predominante de t odos os microrganismos, Algumas bact6rias s+o
19
capa*es de formar esporos# como por exemploK bact6rias do gnero
Bacillus e #lostridium$
T5CNICA
1, Preparar o esfregao e fixarF
1, .obrir o esfregao com papel de filtroF
<, Adicionar o corante )erde mala/uitaF
?, A/uecer at 6 emiss+o de )aporesF
@, Repetir as opera!es < e ? por < minutosF
J, 4a)ar em gua correnteF
9, Adicionar safranina 7:# @ a 1 minuto8F
8, 4a)ar em gua correnteF
9, Decar e obser)ar em imers+o
RESULTADO: -s esporos coram-se em )erde e o rest o da c6lula em
)ermel%o,
PRTICA N :
O#$!TI%OS&
Preparar meios de cultura de usos em prticas microbiol"gicas
2istribuir con)enientemente# esterili*ar em aut ocla)e
PR!PARA*/O ! M!IOS ! C'3T'RA
Meios de cultura s+o associa!es de subst5ncias /ue permitem o
culti)o dos microrganismos fora do seu meio natural,
0as prepara!es dos meios de cultura t odos os nutrientes de)em
ser dissol)idos em gua para /ue possam ser absor)idos pelas c6lulas
microbianas,
0os laborat "rios geralmente utili*a-se gua destilada no preparo
destes meios# no entant o nas unidades industriais cost uma-se utili*ar
gua de rios ou poos, A gua de)e t er boa origem e composi+o
/u'mica constanteF /uando necessrio# de)e ser de)idamente t rat ada,
.omo constituintes bsicos dos meios de cultura# al6m da gua#
pode-se especificarK as fontes de carbono# as fontes de nitrognio# os
sais, $m meios de cultura solidificados# al6m destes componentes de)e-
se introdu*ir agar# gelatina ou s'lica gel com a fun+o espec'fica de
solificar esses meios,
NORMAS ! PR!PARA*/O
Pesagem dos om)onentes: os di)ersos componentes dos meios de
cultura podem ser pesados separadamente# ou consecuti)amente num
>nico recipiente 7C6/uer8, Para /uantidades inferiores a 1g utili*a-se
uma balana anal'tica 7semi-anal'tica8,
- agar-agar geralmente 6 pesado separadamente# sendo o )alor da
pesagem em fun+o da /uantidade do meio a ser distribu'do nos
1:
recipientes, Otili*a-se de 1: a 1:g deste agente solidificante em p" para
cada litro de solu+o nut riente,
Solu(ili&a*+o dos om)onentes: adicionar os nutrientes pre)iamente
pesados a um C6/uer cont endo gua destilada em /uantidade suficiente
para dissol)-los, -s ext rat os de carne e de le)eduras podem ser
a/uecidos ligeiramente para facilitar a solubili*a+o, 2e)e-se e)itar o
uso de fogo diret o e prolongado para n+o %a)er /ueima do material e
conse/uente escurecimento do meio,
- agar n+o 6 sol>)el a frio# de)endo se necessrio ser
solubili*ado em um ban%o-maria ou em aut ocla)e a )apor fluente,
A6uste do )P nos meios: de)e-se deixar resfriar ao mximo os meio
l'/uidos# antes de acert ar o pP, 0o caso dos meios solidificados aGustar
na menor temperatura em /ue n+o %aGa solidifica+o,
D+o empregadas para aGuste do pP solu!es de %idr"xido de
s"dio ou cido clor'drico a :# 1 0# conforme o caso, 0a maioria dos
casos pode-se )erificar o pP at ra)6s do uso de um papel de t ornassol,
$m meios solidificados# o pP cido s" de)er ser aGustado depois
da esterili*a+o para e)itar a %idr"li*e do agar /uando em temperatura
ele)ada, 0este caso o pP cido 6 aGustado com uma solu+o est6ril de
cido ltico,
Clarifia*+o: em alguns casos % necessidade de clarifica+o dos
meios /ue durante o preparo t ornam-se tur)os, A clarifi+o pode ser
feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de o)o#
a/uecendo em seguida at6 ebuli+o e filtrando-se em gase ou algod+o
%idr"filo,
Distri(ui*+o; esterili&a*+o e onser'a*+o: os meios de cultura
depois de preparados s+o distribu'dos em recipientes ade/uados 7tubos#
bal!es# $rlenmeReres8# especificando o respecti)o nome ou sigla e a
dat a do preparo dos mesmos, Herminada a distribui+o# os tubos# bal!es
ou $rlenmeRers s+o arrol%ados com algod+o ou t ampas metlicas
especiais# acondicionados em cestas e le)ados esterili*a+o em
aut ocla)e, A temperatura e o t empo de exposi+o neste e/uipamento
depende da composi+o e da /uantidade de meio de cultura recipiente
7)ide esterili*a+o8,
Ap"s a esterili*a+o# os meios s+o resfriados espera-se 91 %oras
antes de us-los ou est oc-los em geladeira# a fim de /ue se possa
det ectar algum tipo de cont amina+o# ou fal%a de esterili*a+o,
COMPOSI*/O ! M!IOS ! C'3T'RA
A!A- NU/-I/I@O
11
$xtrat o de carne, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
Pept ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
pP ; J# 8 - 9# :
#ATATA 23ICOS! A2AR ; #2A
Catat as descascadas e cort adas em fatias , , , , , <::g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
As batatas de)em ser manuseadas com o m'nimo de exposi+o ao ar,
A/uecer em @::ml de gua at 6 completamente co*idas, Liltrar at ra)6s
de gase# completar o )olume para 1:::ml e adicionarK
Agar , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1@# :g
Glicose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
pP ; J# 8 - 9# :
C<AP!C= >C<?
0a0-
<
7nitrat o de s"dio8, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
T
1
PP-
?
7fosfato monocido de potssio8, , , , , , 1# :g
MgD-
?
7sulfat o de magn6sio8, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , :# @g
T.l 7cloret o de potssio8, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , :# @g
LeD-
?
7sulfato ferroso8, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , :# :1g
Dacarose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <:# :g
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
pP ; J# J
CA3O 23ICOSAO
$xtrat o de carne, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
Pept ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
Glicose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
pP ; J# 8 - 9# :
CA3O 3ACTOSAO
Pept ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
$xtrat o de carne, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
4act ose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
pP ; J# 8 - 9# :
2OO@
11
Pept ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1# :g
.aldo-de-cana, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @::g
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1@g
Uuntar ao caldo-de-cana uma clara de o)o batida, A/uecer at 6
fer)ura# filtrar completando o )olume at6 1:::ml, Uuntar a pept ona e o
agar,
23ICOS! 3!%!'RA >23?
Pept ona , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
$xtrat o de carne, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
0a.l,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
$xtrat o de le)edura, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Glicose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 11-1@g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::m4
pP J# 9 -9# 1
$M4
Pept ona , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
4act ose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
Dacarose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
T
1
PP-
?
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1# :g
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 11-1@g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::m4
2i)idir em bal!es de 1@: m4# 1::m4 e 1::m4 de meio,
$st erili*ar a 11:
o
. por 1: minutos,
&uando for distribuir em placas para uso# fundir e adicionar
para cada 1:: m4 de meio# 1m4 de solu+o est6ril de eosina 7?E8 e
1m4 de solu+o est6ril de a*ul de metileno 7:# J@E8, As placas podem
ser guardadas por uma semana em refrigerador,
23ICOS! A2AR >2A?
$xtrat o de carne , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
Pept ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , @# :g
Glicose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :
Agar,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:::ml
pP ; J# 8 - 9# :
1<
SORO ! 3ARAN$A
Hript ona, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1:# :g
$xtrat o de le)eduras, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , <# :g
Glicose, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ?# :g
Losfato dipot ssico, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1@# :g
Doro de laranGa,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 1::# :ml
Sgua destilada, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 8::# :ml
Preparar o soro de laranGa a/uecendo 1 litro do suco rec6m-
extra'do# a aproximadamente 9<., Adicionar <:g de diat omcea e
misturar, Liltrar com suc+o at ra)6s de um funil de Cuc%ner usando
papel de filtro grosseiro recobert o com o aux'lio de filtra+o, Refiltrar
os primeiros mililitros, AGustar o pP a @# @ # distribuir em recipientes
ade/uados,
PRTICA N A
O#$!TI%OS&
(solar bact6rias# fungos filamentosos e le)eduras de ambientes
di)ersos
(dentificar morfologicamente as esp6cies isoladas
-s microrganismos em seus ambientes naturais 7gua# solo# ar etc8
existem como uma popula+o mista, Para /ue possamos estudar uma
det erminada esp6cie de microrganismo nas suas caract er'sticas
morfol"gicas e bio/u'micas indi)iduais 6 necessrio separ-la das
di)ersas esp6cies contidas nessa popula+o # obt endo uma cultura pura e
6 formada por microrganismso deri)ados de uma >nica c6lula original,
- isolamento de microrganismos re/uer t6cnicas ade/uadas de
inocula+o destes microrganismos em meios de cultura ade/uados /ue
possibilitem o seu rpido crescimento# li)re de cont amina!es,
Para o culti)o# em condi!es laborat oriais# de microrganismos 6
necessrio o con%ecimento de suas exigncias nut riti)as e das condi!es
f'sicas re/ueridas, $xtensas pes/uisas det erminaram exigncias
nutriti)as de muitas esp6cies de microrganismos e esta informa+o
resultou no desen)ol)imento de numerosos meios de cultura, Por causa
da grande )ariedade das necessidades nutriti)as dos microrganismos %#
tamb6m# grandes diferenas na composi+o dos meios utili*ados, 2o
mesmo modo# existem amplas )aria!es no /ue se refere ao ambiente
f'sico /ue fa)orece seu crescimento, Alguns microrganismos# por
exemplo crescem abaixo de :.F out ros exigem t emperat ura acima de
?@. e podem desen)ol)er-se at6 mesmo a 9:., certas bact6rias
necessitam do oxignio atmosf6ricoF out ras s+o indiferentes ou inibidas
pelo oxignio,
1?
M"TOO ! ISO3AM!NTO ! C'3T'RAS P'RAS
/Dnia de sementeira em su)erf7ie e de esgotamento do in.ulo:

- .om o uso de uma ala de platina# coloca-se uma por+o de
esp6cime na superf'cie de um meio de cultura com gar,
- $spal%ar a amostra de lado a lado# na superf'cie da placa #
t racando lin%as de acordo com as figuras 1 e 1 # de modo /ue as
bact6rias indi)iduais se separem umas das out ras,
- (ncubar as placas na temperatura ade/uada

- $xaminar as placas /ue apresentarem col=nias isoladas
- Delecionar uma col=nia caract er'stica da esp6cie estudada e
anotar seus aspect os macrosc"picos# t ais comoK taman%o# forma#
consistncia# cor da col=nia e de seu re)erso# se % pigment o sol>)el
et c,
- Hransferir com a aGuda de uma ala de platina# material da
col=nia escol%ida para um tubo cont endo meio inclinado e incubar
temperatura e tempo ade/uados,
- $xaminar as caract er'sticas do microganismo at ra)6s de
obser)a!es microsc"picas Bin )i)oN e Bin )itroN com colora!es
espec'ficas utili*ando para isso um microsc"pio "tico luminoso,
/Dnia da )laa derramada ()our-)late): - princ'pio da t6cnica 6
o da dilui+o do material em t ubos de agar li/uefeito,
- Hransfere-se uma ala de platina da suspens+o original para o
tubo A 7agar fundido8, - t ubo 6 rolado entre as m+os# permitindo a
mistura completa do in"culo com o meio, Hransferncias similares s+o
efetuadas do t ubo A para o C e# deste# para o .,
- -s cont e>dos de cada t ubo s+o derramados em placas separada
- (ncubar as placas na temperatura e per'odo de tempo ade/uados
- $xaminar as placas /ue apresentarem col=nias isoladas
1@
- Delecionar uma col=nia caract er'stica da esp6cie estudada e
anotar seus aspect os macrosc"picos# t ais comoK taman%o# forma#
consistncia# cor da col=nia e de seu re)erso# se % pigment o sol>)el
et c,
- Hransferir com a aGuda de uma ala de platina# material da
col=nia escol%ida para um tubo cont endo meio inclinado e incubar
temperatura e tempo ade/uados,
- $xaminar as caract er'sticas do microganismo at ra)6s de
obser)a!es microsc"picas Bin )i)oN e Bin )itroN com colora!es
espec'ficas utili*ando para isso um microsc"pio "tico luminoso,
/Dnia das dilui*<es suessi'as: se o microrganismo suspeito#
numa popula+o mista# est presente em n>mero maior do /ue out ros
germes# pode ser obtido em cultura pura por meio de uma s6rie de
dilui!es em meios apropriados,
- Hransfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um
$rlenmeRer A contendo 99ml de gua est6ril, Pomogeni*a-se
permitindo a mistura completa do in"culo com a gua, A partir da'#
t ransfere-se 1ml para um tubo C com 9ml de gua est6ril# agita-se e
repet e a opera+o para os tubos restant es 7.# 2# $8, -bt6m-se assim
uma s6rie de dilui!es decimais,

- 2e cada t ubo t ransferir para duas placas est6reis# amost ra de
1ml# depois adicionar a cada placa cerca de 1@ ml de meio fundido e
resfriado a ?@
o
.F
- (ncubar as placas na t emperat ura e per'odo de tempo
ade/uadosF
- $xaminar as placas /ue apresentarem col=nias isoladas,
Maiores det al%es sobre esta t 6cnica est+o no es/uema apresentado
na figura 1,
1J
L(GORA 1 - $s/uema de dilui+o da t 6cnica das dilui!es sucessi)as,
Visando facilitar o entendiment o e t reinar o alunos nas t6cnicas
de isolament o acima referidas# foram selecionadas de algumas t6cnicas
sobre bact6rias# bolores e le)eduras, $stas t 6cnicas de)eram ser
reali*adas em grupo de t rs alunos e reali*adas num per'odo de 1 a 1
semanas,
19
ISO3AM!NTO ! Stre*t+"6.e( (*. DO SOLO
MA/$-IA"
Amost ra de t erra seca
$rlenmeRer com 99 ml de gua est6ril
? tubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de gua est6ril
1 bal+o com meio de .*apecI 7.M8
Placas de Pet ri esterili*adas
Hubos de ensaio com meio .*
Placa com meio AVP
/OCNICA
1
o
2(A - Pesar um grama de terra e suspender no $rlenmeRer /ue
cont 6m gua est6ril, Agitar para obt er uma suspens+o dos
microrganismos existentes,
Hransferir com pipeta est6ril# 1 ml da suspens+o para um dos
tubos de gua est6rilF agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
t ransferir para out ro tubo com gua e assim sucessi)amente
sendo reali*ada uma s6rie de dilui!es 1:
- 1
# 1:
- <
# 1:
- ?
# 1:
- @
# 1:
- J
,
2e cada tubo t ransferir para duas placas est6reis# amostra de
1ml# depois adicionar a cada placa cerca de 1@ ml de meio de
.M fundido e resfriado a ?@
o
.,
Agitar para %omogeni*ar, $sperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos < minutos# in)erter as placas e
incubar t emperat ura ambiente durante @ a 9 dias,
1
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias t'picas
de Stretom!cesK pe/uenas# secas# de cores )ariadas, 0a
18
escol%a da col=nia de)em ser anot ados aspect os
macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com .M e
para uma placa com meio de .M e para uma placa com AVP#
fa*endo nesta >ltima uma est ria no cent ro com aux'lio de uma
ala em 4, (ncubar,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o no tubo de cultura, Hestar a ati)idade
anti-microbiana da cepa utili*ando a placa de AVP /ue
apresenta uma estria centralF inocular diferentes germes
7bact6rias# le)eduras8 fa*endo estrias perpendiculares est ria
cent ral# comeando a <: mm da est ria central e terminando
Gunto mesma, La*er placas t estemun%as inoculando apenas as
estrias de microrganismos-t estes, (ncubar as placas a <:
o
ou
<9
o
. dependendo da temperatura dos microrganismos-test es,
?
o
2(A - -bser)ar se %ou)er inibi+o e medir 7o %alo correspondente8 a
dist5ncia em mil'metros do crescimento do microrganismo-
test e at6 a estria de Streptomyces.
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
19
ISO3AM!NTO ! #ACI3OS !SPOR'3AOS O SO3O
MA/$-IA"
Amost ra de t erra seca
1 $rlenmeRer com 99 ml de gua est6ril
1 tubos de ensaio cont endo 1:ml de caldo glicosado
? tubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de gua est6ril
1 bal+o com meio de Agar 0utriti)o 7A08
Placas de Pet ri esterili*adas
Hubos de ensaio com meio A0
/OCNICA
1
o
2(A - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeRer /ue
cont 6m gua est6ril, Agitar para obt er uma suspens+o dos
microrganismos existentes,
Hransferir com pipeta est6ril# 1 ml da suspens+o para um t ubo
de caldo glicosado, (mergir o t ubo em gua fer)ente pelo
espao de t empo de @ minutos, Resfriar e t ransferir 1 ml do
caldo para um t ubo com 9ml de gua est6ril# agitar para
%omogeni*ar e repetir a opera+o para mais < tubos, -bt6m-se
assim uma s6rie de dilui!es decimais 1:
- ?
# 1:
- @
# 1:
- J
, 2e cada
dilui+o t ransferir para duas placas est6reis# amost ra de 1ml#
depois adicionar a cada placa cerca de 1@ ml de meio de A0
fundido e resfriado a ?@
o
.,
Agitar para %omogeni*ar, $sperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos < minutos# in)erter as placas e
incubar t emperat ura ambiente durante ?8 %oras,
1
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias t'picas
<:
de bacilos esporuladosK grandes# com bordos irregulares# de
superf'cie rugosa, 0a encol%a da col=nia de)em ser anot ados
aspect os macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma#
bordos# consistncia# bril%o# presena de pigment o sol>)el,
Hransferir com ala de platina part e da col=nia para um t ubo
com A0 e incubar temperatura ambiente,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o no tubo de cultura em A0, La*er
l5mina Wn )i)oN para obser)ar se % mo)imento, Reali*ar uma
colora+o de Gram e uma de esporos,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
<1
ISO3AM!NTO ! #ACT"RIAS M!SO0B3ICAS ! 2'A
MA/$-IA"
Amost ra de gua polu'da
1 $rlenmeRer com 99 ml de gua est6ril
? tubos de ensaio cont endo cada um 9 ml de gua est6ril
1 bal+o com meio de Agar 0utriti)o 7A08
Placas de Pet ri esterili*adas
Hubos de ensaio com meio A0
/OCNICA
1
o
2(A - Pesar um grama de terra e suspender no $rlenmeRer /ue
cont 6m gua est6ril, Agitar para obt er uma suspens+o dos
microrganismos existentes,
Hransferir com pipeta est6ril# 1 ml da suspens+o para um dos
tubos de gua est6rilF agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
t ransferir para out ro tubo com gua e assim sucessi)amente
sendo reali*ada uma s6rie de dilui!es 1:
- <
# 1:
- ?
# 1:
- @
# 1:
- J
, 2e
cada dilui+o t ransferir para duas placas est6reis# amost ra de
1ml# depois adicionar a cada placa cerca de 1@ ml de meio de
A0 fundido e resfriado a ?@
o
.,
Agitar para %omogeni*ar, $sperar o meio solidificar em
repouso por mais ou menos < minutos# in)erter as placas e
incubar t emperat ura ambiente durante ?8 %oras,
1
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias t'picas
de bact6rias, 0a escol%a da col=nia de)em ser anotados
<1
aspect os macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma#
bordos# consistncia# bril%o# presena de pigment o sol>)el,
Hransferir com ala de platina part e da col=nia para um t ubo
com A0 e incubar temperatura ambiente,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o no tubo de cultura em A0, La*er
l5mina Wn )i)oN para obser)ar se % mo)imento, Reali*ar uma
colora+o de Gram e uma de esporos,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
<<
ISO3AM!NTO ! #ACT"RIAS CO3I0ORM!S
MA/$-IA"
Amost ra de gua de ban%eiro# ou pedao de /ueiGo coal%o ou carne de
solF
Hubos com meio de )erde-bril%ante-lact ose-bile 7VC8
Hubos de ensaio contendo caldo lactosado
1 bal+o com meio de Agar 0utriti)o 7A08
Placas de Pet ri com meios diferenciais 7$MC ou $ndo ouHH.8
Hubos de ensaio com meio A0
/OCNICA
1
o
2(A - (nocular o tubo de Verde-bril%ante com o material a ser
pes/uisado# incubar a <@
o
. por ?8 %oras,
1
o
2(A - (nocular o tubo fermentado em placas de Pet ri com meio
diferencial seguindo um dos es/uemas abaixo,
(ncubar <@
o
. durante ?8 %oras,
<
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias t'picas
de coliformes, 0a escol%a da col=nia de)em ser anotados
<?
aspect os macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma#
bordos# consistncia# bril%o# presena de pigment o sol>)el,
Hransferir com ala de platina part e da col=nia para um t ubo
com A0 e para um t ubo com caldo lactosado 7.48 incubar
<@
o
.,
?
o
2(A - -bser)ar se o t ubo de caldo lact osado fermentou e ent+o se o
tubo ti)er dado resultado positi)o 7presena de bol%a de ar8
prosseguir a anlise com o t ubo de cultura com o meio de
agar-nut riti)o 7A08, Reali*ar uma colora+o de Gram e uma de
esporos, Anotar os resultados e comparar com a literat ura,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
<@
ISO3AM!NTO ! #ACT"RIAS O IO2'RT!
>La.t+7a. !! ,( e Stre*t+.+..,(?
MAT!RIA3
Oma amostra de (ogurt e natural
Placa de Petri com meio de Agar-glicose-le)edura 7G48
Hubos de ensaio com meio de leite desengordurado
Hubos de ensaio com meio de Agar-glicose-le)edura 7G48
/OCNICA
1
o
2(A - Lundir e resfriar o meio de culturaF em seguida distribuir em
placas de Pet ri, &uando o meio solidificar fa*er estrias com o
material pes/uisado na superf'cie de cada uma das placas,
.ada aluno de)er reali*ar a t 6cnica de esgot ament o utili*ando
apenas uma placa# segundo o desen%o abaixoK

ou ent+o# com uma ala em 4 fa*er est rias paralelas a partir da
got a depositada na primeira placa e continuando em mais duas
placas do mesmo meio# segundo o es/uema abaixoK
Agitar para %omogeni*ar, $sperar o meio solidificar em
<J
repouso por mais ou menos < minutos# in)erter as placas e
incubar em condi!es anaer"bicas ou sob tens+o de .-
1
7por
exemplo# utili*ando uma lata cuidadosamente no fundo da lata
e a seguir fec%ar bem# por um per'odo de ?8 a 91 %oras,
1
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias
distintas,
0a escol%a da col=nia de)em ser anot ados aspect os
macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um tubo com meio
de G4 e para um t ubo com meio de leite 7o /ual pode cont er
um corante indicador8, (ncubar,
<
o
2(A - -bser)ar o se % coagula+o no t ubo com meio de leite,
Verificar se % crescimento no t ubo de G4 e reali*ar uma
colora+o de Gram, (ncubar, .omparar com os dados obtidos
na prtica com os fornecidos pela literat ura,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
<9
ISO3AM!NTO ! #O3OR!S O SO3O
MAT!RIA3
Oma amostra de t erra seca
Om $rlenmeRer com 99 ml de gua est6ril
? tubos com 9 ml de gua est6ril
Om bal+o com meio de .*apecI 7.M8 fundido
8 placas de Pet ri est6reis
? tubos e /uat ro placas com meio de .*apecI
/OCNICA
1
o
2(A - Pesar um grama de terra e suspender no $rlenmeRer /ue
cont 6m gua est6ril, Agitar para obt er uma suspens+o dos
microrganismos existentes,
Hransferir com pipeta est6ril# 1 ml da suspens+o para um dos
tubos de gua est6rilF agitar bem e deste tubo retirar 1ml e
t ransferir para out ro tubo com gua e assim sucessi)amente
sendo reali*ada uma s6rie de dilui!es 1:
- 1
# 1:
- <
# 1:
- ?
# 1:
- @
# 1:
- J
,
2e cada tubo t ransferir para duas placas est6reis# amostra de
1ml# depois adicionar a cada placa cerca de 1@ ml de meio de
.M fundido e resfriado a ?@
o
.,
Agitar para %omogeni*ar e incubar temperatura ambiente
durante @ a 9 dias,
1
o
2(A - 7 @ a 9 dias depois8 -bser)ar as col=nias /ue cresceram e
escol%er col=nias t'picas de boloresK filamentosas# grandes# de
cores )ariadas,
0a escol%a da col=nia de)em ser anot ados aspect os
<8
macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com .M e
para uma placa com meio de .M, (ncubar,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o da col=nia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo# preparar um culti)o em c5mara
>mida, (ncubar
?
o
2(A - -bser)ar a l5mina ao microsc"pio para determinar tipos de
%ifas# tipo de esporos assexuados# e se poss')el a classe e o
gnero do fungo em estudo
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
<9
ISO3AM!NTO ! #O3OR!S O MAT!RIA3 MO0AO
MAT!RIA3
Oma amostra de p+o# /ueiGo# fruta ou out ro material mofado
Placa de Petri com meio de .*apecI 7.M8 e Catat a- glicose-agar 7CGA8
Hubos de ensaio com meio de .M e CGA
1
o
2(A - Lundir e resfriar os meios de CGA e .MF em seguida acidificar
com cido ltico a pP <# @, 2istribuir em placas de Pet ri,
$sperar solidificar, .om o aux'lio de uma ala em agul%a
incubar material mofado no centro de cada um dos meios
contidos em placas, (ncubar temperatura ambiente durante @
dias,
1
o
2(A - 7 @ a 9 dias depois8 -bser)ar as col=nias /ue cresceram e
escol%er col=nias t'picas de boloresK filamentosas# grandes# de
cores )ariadas,
0a encol%a da col=nia de)em ser anotados aspect os
macrosc"picos# t ais comoK taman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com .M e
para uma placa com meio de .M, (ncubar,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o da col=nia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo# preparar um culti)o em c5mara
>mida, (ncubar
?
o
2(A - -bser)ar a l5mina ao microsc"pio para determinar tipos de
%ifas# tipo de esporos assexuados# e se poss')el a classe e o
gnero do fungo em estudo
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
?:
ISO3AM!NTO ! 0'N2OS O A*CCAR CRISTA3
MAT!RIA3
A>car cristal
$rlenmeRer com 99 ml de gua est6ril
Cal+o com batat a- glicose-agar 7CGA8 acidificado a pP <# @
Cal+o com meio de .*apecI 7.M8
Placas de Pet ri est6reis
Hubos de ensaio com CGA e .M
T"CNICA
1
o
2(A - Pesar 11g de a>car e t ransferir para o $rlenmeRer com gua
est6ril# agitando bem para dissol)er,
Hransferir por!es de 1 e 1 ml para placas de Petri,
-s meios de cultura .M e CGA de)em ser fundidos# refriados
a ?@
o
. e em seguida acidificados com cido ltico a pP <# @,
Adicionar os meios de cultura s placas, 2eixar esfriar para
solidificar 71 a <minutos8 e incubar t emperat ura ambiente
durante @ a 9 dias,

1
o
2(A - 7@ a 9 dias depois8 -bser)ar as col=nias /ue cresceram e
escol%er col=nias t'picas de boloresK filamentosas# grandes#
de cores )ariadas,
0a encol%a da col=nia de)em ser anotados aspect os
macrosc"picos# tais comoK t aman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com .M e
para uma placa com meio de .M, (ncubar,
<
o
2(A - -bser)ar o cresciment o da col=nia gigante na placa e a partir
da cultura crescida no tubo# preparar um culti)o em c5mara
>mida, (ncubar
?
o
2(A - -bser)ar a l5mina ao microsc"pio para determinar tipos de
%ifas# tipo de esporos assexuados# e se poss')el a classe e o
?1
gnero do fungo em estudo,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
?1
ISO3AM!NTO ! 3!%!'RAS ! 0R'TA
MAT!RIA3
Lrut a 7u)a# ma+# abacaxi# mam+o# caG et c, 8
$rlenmeRer com @: ml de caldo glicosado 7.G8
Meio de glicose-agar 7GA8
Scido ltico
Placas de Pet ri est6reis
Hubos de ensaio est6reis
Hubos de ensaio para fermenta+o com caldo glicosado
T"CNICA
1
o
2(A - Acidificar o caldo glicosado com cido ltico a pP <# @,
.ort ar a fruta com casca e macerar com aGuda de uma faca,
Hranferir para o $rlenmeRer com o meio acidificado# agitar e
incubar t emperat ura ambiente# durante ?8 a 91 %oras,
1
o
2(A - Adicionar o meios de cultura s placas, 2eixar esfriar em
repouso para solidificar, .om uma ala de platina# depositar
uma gota do caldo na superf'cie do meio contido na placa de
Pet ri e fa*er estrias por esgot ament o seguindo o es/uema
abaixoK

ou ent+o# com uma ala em 4 fa*er est rias paralelas a partir
da got a depositada na primeira placa e continuando em mais
duas placas do mesmo meio# segundo o es/uema a seguirK
?<
(ncubar t emperat ura ambiente por ?8 %oras,
<
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias
t'picas de le)eduras,
0a encol%a da col=nia de)em ser anotados aspect os
macrosc"picos# tais comoK t aman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com GA e
para um t ubo com meio de .G, (ncubar,
?
o
2(A - Analisar o crescimento no t ubo com caldo glicosado e
obser)ar se a le)edura 6 fermentati)a, Reali*ar uma
obser)a+o Bin )i)oN e com colora+o simples, Anotar os
aspect os microsc"picos do microrganismo em estudo# tais
comoK tipo de reprodu+o 7fiss+o# gemula+o# esporula+o8#
presena de gr5nulos# de )ac>olos,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
I
??
ISO3AM!NTO ! 3!%!'RAS ! CA3O;!;CANA
MAT!RIA3
.aldo de cana fermentado 71?%oras8
Meio de glicose-agar 7GA8
? Placas de Petri est6reis
Hubos de ensaio est6reis
Hubos de ensaio para fermenta+o com caldo glicosado
T"CNICA
1
o
2(A - Adicionar o meios de cultura s placas, 2eixar esfriar em
repouso para solidificar, .om uma ala de platina# depositar
uma gota do caldo na superf'cie do meio contido na placa de
Pet ri e fa*er est rias por esgotament o seguindo um dos
es/uemas abaixoK
(ncubar t emperat ura ambiente por ?8 %oras,
?@
1
o
2(A - -bser)ar as col=nias /ue cresceram e escol%er col=nias
t'picas de le)eduras,
0a encol%a da col=nia de)em ser anotados aspect os
macrosc"picos# tais comoK t aman%o# cor# forma# bordos#
consistncia# bril%o# presena de pigmento sol>)el, Hransferir
com ala de platina parte da col=nia para um t ubo com GA e
para um t ubo com meio de .G, (ncubar,
<
o
2(A - Analisar o crescimento no t ubo com caldo glicosado e
obser)ar se a le)edura 6 fermentati)a, Reali*ar uma
obser)a+o Bin )i)oN e com colora+o simples, Anotar os
aspect os microsc"picos do microrganismo em estudo# tais
comoK tipo de reprodu+o 7fiss+o# gemula+o# esporula+o8#
presena de gr5nulos# de )ac>olos,
O#S!R%A*/O&
A prtica de)er ser encerrada mediante a ent rega
do relat "rio e do tubo de cultura isolada,
?J
PRTICA N D
O#$!TI%OS&
2eterminar a densidade celular por turbidimetria
-bter o n>mero de c6lulas por cont agem em placa
.onfeccionar uma cur)a de calibra+o de uma esp6cie microbiana
Om culti)o de bact6rias ou le)eduras em meio l'/uido# at ua como
uma suspens+o coloidal# refletindo ou pondo obstculos a passagem da
lu* at ra)6s do mesmo, At6 cert o pont o# a lu* /ue foi absor)ida ou
refletida 6 proporcional a concent ra+o de c6lulas presentes na
suspens+o, A tur)a+o /ue apresenta um tubo de ensaio contendo uma
cultura em cresciment o# 6 pro)ocada pela absor+o e reflex+o da lu*,
Port ant o# ao se medir a percentagem de absor+o da lu* 7t urbidimetria8
ou a reflex+o da lu* 7nefelometria8 se pode estimar a concentra+o de
c6lulas presentes, Licaremos restrit os ao primeiro caso,
Para as medidas t urbidim6ricas da massa celular# podem ser
utili*ados instrumentos como um espect rofot =met ro ou fot ocol or'metro,
0a turbidimetria# a capacidade do culti)o para deter a lu*# se
expressa como percentagem de lu* t ransmitida# sendo esta percentagem
in)ersamente proporcional concentra+o de c6lulas, A percentagem da
t ransmit5ncia 7H8 6 igual a (3(
:
# sendo (
:
# a intensidade da lu* incidente
e (# a intensidade da lu* t ransmitida,
Para )erificar a rela+o direta proporcional entre a concent ra+o
de c6lulas e a absorb5ncia da lu* 72ensidade Xtica# 2- ; log (
:
3(8#
)amos medir a turbide* de )rias dilui!es 7Ligura <8 de uma suspens+o
de uma cultura de E$ coli e proceder a contagem em placa destas
dilui!es,
Material
- MicrorganismosK

$s%eri%ia oli 7bact 6ria8
Sa%arom3es ere'isiae 7le)edura8
- Meios de culturaK
.aldo lact osado
.aldo glicosado
- $/uipamentosK

Agitador magn6tico
$spect rofot =met ro
- 2i)ersosK
?9
Hubos ou cubetas para o espectrofot =met ro
Pipetas de @ml esterili*adas
MDtodos
- La*er a dilui+o das culturas# conforme most ra a figura <,
- .alibrar o espectrofot =met ro# utili*ando lu* com comprimento de
onda )ariando entre @:: e J::nm, .olocar no aparel%o um tubo
cont endo @ml de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado est6ril,
.om este tubo 7BbrancoN8 o espectrofot =met ro 6 aGustado para 2, -,
igual a *ero# ou t ransmit5ncia igual a 1::EF
- retirar o BbrancoN do aparel%o e colocar o t ubo da cultura, La*er a
leitura da 2, -, e anot ar o resultado, (mediatamente proceder a
cont agem em placa# da cultura no t ubo /ue foi feita a leitura no
espect rofot =met ro,
- repetir o mesmo procedimento para os demais t ubos da cultura dilu'da#
aGustando sempre o espect rofot =met ro cont ra o BbrancoN# a cada leitura#
e agitando bastante o t ubo com a culturaF
- para a cont agem em placa# dos tubos contendo a cultura de E$ coli e S$
cerevisiae fa*er dilui!es at6 1x1:
- 9
e pla/uear em duplicata 1ml das
dilui!es de 1x 1:
- ?
a 1x1:
- 9
,
#I!U-A F, 2ilui+o da cultura para leitura no espect rofot =met ro

-esultados
?8
Anotar na t abela# os resultados das leituras das densidades "ticas
e das correspondentes cont agens em placas,
Ap"s obter o n>mero de c6lulas por cont agem em placa# das
dilui!es# relacionar num grfico# os )alores da 2, -, das di)ersas
dilui!es na ordenada# cont ra os n>meros de microrganismos
correspondentes /ue se determinou, Assim# obt emos uma cur)a de
calibra+o para o referido microrganismo nas condi!es do experimento,
Dilui*<es da ultura
(ml)
Densidade Qtia
(D, O)
Conentra*+o elular
(DlulasRml)
131
13?
138
131J
13<1
13J?
PRTICA N 1E
O#$!TI%OS&
-bter a concent ra+o de c6lulas de le)eduras pelo uso de c5mara
de cont agem 7c5mara de 0eubauer8
A contagem direta por microsc"pio# 6 a mais rpida# e 6 le)ada a
efeito com a cont agem de organismos num )olume con%ecido da cultura,
$st a enumera+o 6 feita com o aux'lio de l5minas espessas# con%ecidas
como c5maras de cont agem, As mais comuns s+o as de Pet roff-Pausser#
0eubauer e as de Pelber, estas c5maras apresentam uma rea reticulada#
com pe/uenos /uadrados de superf'cie con%ecida, La*endo part e do
conGunt o# existe uma lam'nula /ue recobre os pe/uenos /uadrados# de
modo /ue a altura destes lam'nula 6 con%ecida,
0o nosso experimento# as le)eduras ser+o cont adas numa c5mara
de 0eubauer# /ue apresenta uma rea di)idida em /uadrados com
13?::mm
1
F a c5mara 6 cobert a com uma lam'nula# deixando uma altura
de 131:mm# i, 6, # de cada /uadrado lam'nula, Assim sendo o )olume
/ue fica acima de cada /uadrado 6 de 13?::: mm
<
,
$st a cont agem inclui organismos )i)eis e mort os# sendo
denominada de cont agem t ot al de c6lulas,
$st e m6t odo de cont agem direta# tem a )antagem de fornecer um
resultado /uase imediato# no entant o t em a des)antagem de n+o se ter
a distin+o entre c6lulas )i)as e mort as,
?9
Material
- MicrorganismoK
.ultura de Sa%arom3es er'isiae
- ReagentesK
Dolu+o salina fisiol"gica 7:# 8@E 0a.l8
-$/uipamentosK
Microsc"pio "tico comum
.5mara de contagem de 0eubauer
Cico de Cunsen
- 2i)ersosK
Pipeta Pasteur
MDtodos
-Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar# uma gota da
suspens+o da cultura de le)edura sobre a rea reticulada da c5maraF
-colocar a lam'nula sobre a got a, Alternati)amente# pode-se
colocar primeiro a lam'nula# e deixar-se /ue a suspens+o do
microrganismo# /ue sai da pipeta# escorra por a+o capilar sob a
lam'nulaF
- esperar cerca de de* minutos# at6 /ue o material sedimenteF
- usando a obGeti)a de ?:-?@Y# cont ar as le)eduras em cerca de
1: /uadrados dispost os em BYN 7)er figura 18,
-esultados
- .alcular o n>mero de le)eduras3m4# contidas em uma suspens+o
utili*a-se a seguinte f"rmula
.oncentra+o .elular 7le)eduras3m48 ; n x 1@::: x dilui+o
onde n; n>mero de c6lulas dos /uadrados
$xemploK
n ; 1<1
dilui+o 1K1::
.oncentra+o celular ; 1<1 x 1@::: x 1:: ; @# 8 x 1:
8
c6lulas3m4
@:
PRTICA 11
O#$!TI%O& 2et erminar uma cur)a de calibra+o para a determina+o
da concentra+o da le)edura Saccharomyces cerevisiae a partir do
fermento prensado,
INTRO'*/O&
A partir do con%ecimento do teor de mat6ria seca em fermento
prensado comercial 6 poss')el preparar uma suspens+o padr+o de
le)eduras# de determinada concent ra+o# com bastante confiabilidade,
Atra)6s de uma s6rie de dilui!es con)enientes dessa suspens+o padr+o
s+o obtidas no)as suspens!es de concent ra!es con%ecidas, Linalmente#
a t urbide* pro)ocada no meio pelas diferentes suspens!es de le)eduras
6 medida atra)6s de um instrument o ade/uado e os )alores obtidos s+o
relacionados com as respecti)as concentra!es por interm6dio de uma
express+o matemtica,
As dilui!es ade/uadas s+o obtidas atra)6s de tentati)as de forma
a abranger um inter)alo de concent ra!es /ue atenda as seguintes
condi!esK
1
a
, 8 2e)e %a)er uma correla+o linear entre a concent ra+o e o
logaritmo da t rasmit5ncia eF
1
a
8 -s )alores das transmit5ncias obtidas de)em estar situadas na regi+o
de maior sensibilidade na escala do instrumento utili*ado,
T"CNICA&
1, $m um copo de C6/uer de @:ml pesar# em balana semi-anal'tica#
1g de ferment o prensado# anot ando o )alor exat o, 2iluir em um
pouco de gua e t ransferir# analiticamente# para um bal+o de 1:::ml,
.ompletar o )olume e %omogenei*arF
1, A partir da concent ra+o da suspens+o padr+o escol%er os )alores
para as concentra!es# de forma a cobrir uma determinada faixa de
concentra!esF
<, Reali*ar uma s6rie de dilui!es com um conGunto de pipetas e
bal!es )olum6tricos ade/uados, Otili*ar como sugest+o os )alores da
t abela abaixo,
Sus)ens+o
nSmero
Con, da
dilui*+o;
T (gRl)
#ator de
dilui*+o
Modo de
)re)aro
(ml da sus),
)adr+o)
1 :# 1 1:x 1@ at6 @::
1 :# 1 1:x 1@ at6 1@:
@1
< :# < J# J9x 1@ at6 1::
? :# ? @x 1: at6 1::
@ :# @ ?x @: at6 1::
J :# J <# <<x 1@ at 6 @:
9 :# 8 1# @x 1: at6 @:
8 1# 1 1# J9x 1@ at6 1@
?, Pomogenei*ar cada suspens+o e transferir para um t ubo de
espectrofot =met ro pre)iamente aGustado ao comprimento de onda de
J1: nm,
@, Reali*ar# pelo menos# duas leituras do )alor da absorb5ncia para
cada concent ra+o, - espectrofot =met ro 6 calibrado antes de cada
leitura# com um BbrancoN de gua destilada,
J, .onst ruir um grfico# colocando no eixo das ordenadas os )alores
da concent ra+o Y 7g3l8 e no eixo das abssissas os )alores da
absorb5ncia 72, -8,
9, La*er uma regress+o linear com o aux'lio de um programa de
computador ou utili*ando o m6todo dos m'nimos /uadrados,
8, .alcular o coeficiente de correla+o# r# e determinar o inter)alo
de concentra!es# Y
1
Y
1
# no /ual a express+o 6 )lida,
-bser)a+oK A cur)a de calibra+o obtida pelos pont os descritos 6
)lida apenas para o fermento prensado utili*ado na sua confec+o,
PRTICA 12
O#$!TI%OS&
A)aliar o cresciment o de um microrganismo em diferentes meios de
culti)oF
.onfeccionar a cur)as de crescimento celular# utili*ando o m6todo
t urbidim6tricoF
.alcular o t empo de gera+o 7G 8e a )elocidade espec'fica mxima
de crescimento 7
mx
8 e a produti)idade celular 7P8 em cada meio de
culti)o,
INTRO'*/O&
- cresciment o microbiano pode ser definido em t ermos# tant o da
massa# como t amb6m do n>mero de c6lulas, $m condi!es de
crescimento exponencial# massa celular e n>mero de c6lulas permanecem
proporcionais# embora a rela+o ent re estes dois )alores possa )ariar em
det erminadas condi!es de culti)o, - cresciment o de um microrganismo
em diferentes meios de culti)o# por exemplo# pode ser a)aliado pela
det ermina+o da massa celular /ue# por sua )e*# pode ser medida
indiretamente pela t ur)a+o de uma suspens+o,
@1
A e)olu+o do crescimento pode ser a)aliada utili*ando um
culti)o em batelada em condi!es de incuba+o controladas, .om
leituras da densidade "ptica 7absorb5ncia8 de uma s6rie de amostras
retiradas a inter)alos de t empo regulares# e com aux'lio da cur)a
padr+o de calibra+o# 6 poss')el confeccionar uma cur)a de
crescimento relacionando a concent ra+o celular 7ordenada8 com o
tempo de culti)o 7abcissa8, 0esta cur)a s+o# ent+o# identificadas as
diferentes fases do crescimento microbiano,
2urante a fase exponencial de crescimento pode-se ent+o
det erminar o tempo de gera+o 7G8 e a )elocidade espec'fica mxima
de crescimento 7
MSY,
8,
Pode-se ainda det erminar a produti)idade celular 7P8/ue 6 a
rela+o entre a )aria+o da concent ra+o celular pela )aria+o do
tempo de culti)o, $ste )alor de)er ser determinado pela seguinte
e/ua+oK
P; 7Y
f
- Y
o
83 7t
f
- t
o
8 8
-ndeK Y
o
; .oncentra+o celular inicial# 7g3l8
Y
f
; concentra+o celular final # 7g3l8
t
f
; tempo final# 7%8
t
o
; t empo inicial# 7%8

MAT!RI A3
- Microrganismo
Saccharom!ces cerevisiae
- Meios de cultura
.aldo nutriti)o suplementado com 1E de a>car 7glicose# frut ose e
sacarose8
- $/uipamentosK
$spect rofot =met ro
Mesa agitadora 7rumbeira8
Calana semi-anal'tica
- 2i)ersosK
.ubetas do espectrofot =met ro
Hubos de ensaio est6reis
< $rlenmeRers# 1:::ml
Pipetas# 1:ml

M"TOOS
1, Preparar 1# @ litros de caldo nutriti)o# distribuir @::ml em <
$rlenmeRers de 1:::ml de capacidade, Adicionar no primeiro @g de
glicose# no segundo @g de sacarose e no t erceiro @g de frut ose#
%omogenei*ar e esterili*ar a 111
o
. por 1@ minutos, 2eixar esfriarF
@<
1, Retirar uma amostra de @-1:ml de cada meio para ser)ir como um
brancoF
<, .olocar os $rlenmeRers na balana semi-anal'tica e inocular
esterilmente cerca de :# 1g a :# ?g do microrganismo Saccharomyces
cerevisiae 7ferment o prensado)F
?, Retirar <ml de amost ra com uma pipeta est6ril# imediatamente ap"s
a inocula+o# correspondente# port ant o# ao t empo *ero, $fetuar a
leitura da Absorb5ncia 7ou densidade "ptica8, Anotar o resultadoF
@, .olocar os $rlenmeRers na mesa agitadora# t endo o cuidado de fix-
los bem, 4igar a agita+o a 9::: rpm, 2eix-los sob agita+o
durante t odo o culti)oF
J, Retirar amost ras de <ml a inter)alos de 1 %ora# at6 /ue se obser)e
um m'nimo de trs )alores idnticos# ou muito pr"ximos# de
densidade "ptica 72-8, Anotar os resultadosF
9, .onst ruir um grfico para cada meio de culti)o# colocando no eixo
das ordenadas os )alores do t empo 7%8 e no eixo das abcissas
concent ra+o Y 7g3l8F
1, .alcular a )elocidade espec'fica mxima de crescimento 7
mx
8 o
t empo de gera+o 7G 8 e a produti)idade celular 7 Y3t 8 em cada
meio de culti)oF
1, .omparar os resultados obtidos e tirar conclus!es a respeito do meio
mais ade/uado ao crescimento,
Modelo de registro ta(ular
Meio de Culti'o:
/em)o
(%)
Densidade
Q)tia
(DO)
Conentra*+o
T(gRl)
:
1
1
<
?
@
J
9
8
@?