UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA






ISABELLA CANELLA MESQUITA








LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A
PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS










Niteri
2007
ii








ISABELLA CANELLA MESQUITA





LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A
PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS



Orientadoras
Professora Jussara Lagrota Cndido
Professora Thereza Quirico dos Santos





iii





Dissertao submetida coordenao do curso de
ps-graduao em Neuroimunologia do Instituto de
Biologia da Universidade Federal Fluminense, como
parte dos requisitos necessrios para obteno do
grau de Mestre em Neuroimunologia rea de
concentrao: Imunobiologia.












Banca examinadora:



Joseli Lannes Vieira (IOC-Fiocruz)


Mauricio Vercimo (UFF)


Elizabeth Giestal Arajo (UFF)


Vernica Figueiredo Amaral (Suplente e Revisora- UFF)



iv





































A parte experimental deste trabalho foi executada nos laboratrios
de Imunopatologia e Patologia Celular do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense (UFF) e no Laboratrio de Pesquisa em
Auto-imunidade e Imuno-regulao (Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz).







v








FICHA CATALOGRFICA




MESQUITA, Isabella Canella
Leso muscular induzida por bupivacana em linhagens de
camundongos predispostos a perfil distinto de citocinas Niteri: UFF,
2007.
102 f.

Dissertao Mestrado em Neuroimunologia
Universidade Federal Fluminense


1. leso muscular 2. inflamao 3. Msculo Esqueltico
4. citocinas



















vi

































Dedico esta tese



Deus, minha famlia, amigos, colegas de
trabalho e orientadoras pelo apoio, fora,
incentivo, companheirismo e amizade. Sem eles
nada disso seria possvel.








vii
AGRADECIMENTOS


A Deus por me amparar nos momentos difceis, me dar fora interior
para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e
me suprir em todas as minhas necessidades.

s minhas orientadoras e amigas Prof
as
Jussara Lagrota-Cndido e
Thereza Qurico dos Santos, por acreditarem em mim, me mostrarem o
caminho da cincia, fazerem parte da minha vida nos momentos bons e
ruins, por serem exemplos de profissional e de mulheres as quais
sempre faro parte da minha vida.

minha famlia, a qual amo muito, pelo carinho, pacincia e incentivo.

A Dr
a
. Joseli Lannes Vieira por sua ajuda nos momentos mais crticos,
por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento
profissional e por ser tambm um exemplo a ser seguido. Sua
participao foi fundamental para a realizao deste trabalho.

Aos amigos que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e
incentivando.

Aos meus colegas de trabalho Douglas, Rafael, Pedro e as tcnicas do
laboratrio Nina e Bartira que participaram diretamente deste trabalho e
me ajudaram em todos os momentos.
viii
Aos meus amigos de laboratrio Paulo Emlio, Gabriele, Cristiane,
Guilherme, Fernanda e Jardel que sempre estiveram do meu lado dando
fora e apoio.

As colegas do Laboratrio de Autoimunidade da Fiocruz, Jaline,
Valeska, Karina, Andra, Luzia, Mrcia, Diego, por me receberem to
bem, me ajudarem e participarem deste trabalho.

Aos tcnicos do Biotrio Central da Fiocruz e do NAL pelo apoio tcnico
excepcional.

A Dr
a
Andra Fontes do DUBC da Fiocruz pelo apoio e colaborao na
utilizao do citmetro de fluxo.

A todos os amigos do Instituto de Biologia pelo carinho e apoio.

A todos os colegas e professores da ps-graduao em
Neuroimunologia pelo convvio e aprendizado.


ix

EPGRAFE

















"Todo o futuro da nossa espcie, todo o governo das
sociedades, toda a prosperidade moral e material das naes
dependem da cincia, como a vida do homem depende do ar.
Ora, a cincia toda observao, toda exatido, toda verificao
experimental. Perceber os fenmenos, discernir as relaes,
comparar as analogias e as dessemelhanas, classificar as
realidades, e induzir as leis, eis a cincia; eis, portanto, o alvo que
a educao deve ter em mira. Espertar na inteligncia nascente
as faculdades cujo concurso se requer nesses processos de
descobrir e assimilar a verdade."


Rui Barbosa.

x

SUMRIO
Pgina
FICHA CATALOGRFICA...................................................................................v
DEDICATRIA.................................................................................................... vi
AGRADECIMENTOS..........................................................................................vii
EPGRAFE.......................................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xii
LISTA DE TABELAS..........................................................................................xiv
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................xv
RESUMO...........................................................................................................xvii
ABSTRACT.......................................................................................................xviii
1.0 - INTRODUO.......................................................................................... 1
1.1 - Tecido Muscular Esqueltico.....................................................................1
1.2 - Formao do Tecido Muscular.................................................................. 5
1.3 - Reparo do Tecido Muscular...................................................................... 6
1.4 - Progenitores Miognicos........................................................................... 9
1.4.1 - Clulas Satlites........................................................................................ 9
1.4.2 - Contribuio de Outras Clulas Miognicas no Reparo do Tecido
Muscular...................................................................................................13
1.5 - Participao da Inflamao no Reparo Tecidual .....................................16
1.6 - Metaloproteinases na Regenerao e Reparo de Tecido Muscular .......23
1.7 - Modelos Animais de Injuria Muscular.......................................................25
2.0 - OBJETIVOS.............................................................................................28
2.1 - Objetivo Geral..........................................................................................28
2.2 - Objetivos Especficos..............................................................................28
3.0 - MATERIAL E MTODOS.........................................................................29
3.1 - Animais.....................................................................................................29
3.2 - Induo da Leso.....................................................................................29
3.3 - Processamento Histolgico......................................................................30
3.4 - Imuno-histoqumica..................................................................................30
3.5 - Histomorfometria......................................................................................32
3.6 - Citometria de Fluxo..................................................................................32
3.7 - RT-PCR....................................................................................................33
xi
3.7.1 - Extrao de RNA Total ........................................................................... 33
3.7.2 - Eletroforese de RNA .............................................................................. 34
3.7.3 - Transcrio Reversa de RNA e PCR...................................................... 35
3.8 - Zimografia............................................................................................... 36
3.8.1 - Preparo do Extrato Tecidual.................................................................. 36
3.8.2 - Gel para Zimografia............................................................................... 36
3.9 - Anlise Estatstica................................................................................... 37
4.0 - RESULTADOS........................................................................................ 38
4.1 - Anlise Histolgica da Leso Muscular ................................................. 38
4.2 - Alteraes no Microambiente da Leso Muscular ...................................42
4.2.1- Colorao de Picrocrius .......................................... ..............................42
4.2.2 - Atividade das Metaloproteases no Msculo Lesionado ..........................47
4.3 - Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio..... ...............................................51
4.4 - Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem.......................... .....................53
4.5 - Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico.....................62
5. - DISCUSSO........................................................................................... 64
6. - CONCLUSES....................................................................................... 72
7. - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................ 73
















xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP Adenosina tri-fosfato
ATPASE Adenosina tri-fosfatase
B10 C57BL/10
B6 C57BL/6
BHLH Basic-helix-loop-helix
Ca
+
Clcio
CTX Cardiotoxina
DMD Distrofia muscular de Duchenne
DPI Dias aps inoculao
ECM Matriz extracelular
FGF Fator de crescimento de fibroblasto
GAPDH Gliceraldeido-3-fosfatase dehidrogenase
HGF fator de crescimento de hepatcito
HMGB1 Protena do tipo high mobility group box 1
IGF Fator de crescimento do tipo insulina
IL Interleucina
LAP Protena associada latncia
LPS Lipopolissacardeo
MDSC Clulas tronco derivadas de msculo
MHC Miosina de cadeia pesada
MMP Metaloprotease de matriz
MRF Fator de crescimento muscular
mRNA RNA mensageiro
NK Clula natural killer
NO xido Ntrico
NTX Notexina
PCNA Antgeno nuclear de proliferao celular
PCR Reao de polimerase em cadeia
PGE2 Prostaglandina E
PPARy Receptor de ativao proliferador de peroxossoma gama
xiii
RNAse Ribonuclease
Runx2 Fator de transcrio relacionado ao runt tipo 2
SCA-1 Antgeno de clula tronco do tipo 1
SDF Fator derivado de clula do estroma
SDS Dodecil sulfato de sdio
SP Side Population
TGF Fator de transformao do crescimento
TGF- Fator de Transformao do crescimento do tipo
TIMP Inibidor tecidual de metaloprotease
TLR Receptor do tipo toll
TNF Fator de necrose tumoral alfa
Zn
2+
Zinco





















xiv

LISTA DE TABELAS

Pgina
1. Relao de anticorpos utilizados na imuno-histoquimica....................... 31
2. Relao de anticorpos utilizados na citometria de fluxo......................... 33
3. Lista de oligonucleotdeos.......................................................................35






















xv
LISTA DE FIGURAS

Pgina
1. Estrutura do msculo esqueltico.................................................... 2
2. Estrutura da fibra muscular.............................................................. 3
3. Distribuio heterognea das fibras musculares
esquelticas.....................................................................................

4
4. Estgios de regenerao do tecido muscular.................................. 9
5. Regulao molecular da regenerao do tecido muscular.............. 11
6. Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites ...... 13
7. Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao
muscular...........................................................................................

15
8. Cintica da migrao celular nas fases da leso
tecidual...............................................................................................

17
9. Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual............ 23
10. Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas
linhagens de camundongo.................................................................

40
11. Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo
Giemsa...............................................................................................

41
12. Colorao de picrosrius da leso muscular...................................... 44
13. Histomorfometria da area da leso ocupada por colgeno............... 46
14. Atividade de metaloproteinases no msculo esqueltico.................. 49
15. Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esqueltico............ 50
16. Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatorio da leso
muscular induzida por bupivacana...................................................

52
17. Celularidade dos linfonodos de axilar e braquial...... 54
18. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes
nos linfonodos de drenagem em 4 dpi...............................................
49
55
19. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos t
presentes nos linfonodos de drenagem em 4dpi......

57
20. Perfis representatives de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas
clulas TCD4+ de camundondos BALB/c..........................................

58

xvi
21. Anlise por citometria de fluxo de expresso dos antgenos
CD62L, CD44, CD25 nas clulas CD4+............................................

59
22. Perfs representativos de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas
clulas CD8+ de camundongos C57BL6................ ..........................

60
23. Anlise pr citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L,
CD44, CD25 nas clulas CD8+.........................................................

61
24. Expresso de RNA mensageiro para TGF- no msculo
esqueltico
63


























xvii


RESUMO


Leses musculares so problemas freqentes na medicina esportiva e doenas
miodegenerativas. A fase inicial do processo de reparo caracterizada pela
necrose do tecido danificado e ativao da resposta inflamatria. O objetivo
deste trabalho foi analisar o reparo do tecido muscular aps a induo de leso
muscular em linhagens de camundongos com distintos padres de secreo de
citocinas. Foram includos pelo menos 3 animais em cada grupo de estudo com
padro de citocinas Th1 (C57BL/10, C57BL/6) e Th2 (BALB/c). A injria
muscular foi induzida pela inoculao de bupivacana no msculo Trceps
bachii. Os camundongos foram sacrificados aps 1, 4, 8 e 12 dias (dpi). As
linhagens com predomnio de citocinas Th1 apresentaram maior rea com
miofibras regenerando e macrfagos em 4 dpi em comparao com o
camundongo BALB/c. Os linfonodos regionais apresentaram aumento
significativo da celularidade com aumento percentual de linfcitos T CD3
+
CD4
+

somente nos camundongos BALB/c inoculados com bupivacana. Os
camundongos BALB/c mostraram um aumento da deposio de colgeno e
menores nveis de MMP-9 associados com maior quantidade de mRNA para
TGF-1. Este estudo sugere que o perfil imunolgico do camundongo pode
influenciar o processo de remodelagem no msculo esqueltico aps
inoculao de bupivacana promovendo regenerao muscular (citocinas Th1)
ou mionecrose e deposio de colgeno (citocinas Th2).










xviii



ABSTRACT

Muscular lesion is a frequent matter in sportive medicine and myodegenerative
diseases. Necrosis of the damaged tissue and activation of inflammatory
response characterize the initial phase of muscle repair. This work aimed to
analyze the tissue repair after induction of lesion in skeletal muscle from mouse
lineages with distinct cytokine secretion patterns. It was included at least 3 mice
per group with distinct cytokine pattern: Th1 (C57BL/10, C57BL/6) and Th2
(BALB/c). Muscular injury was performed by injection of bupivacaine (Bp) in the
(T. brachii) skeletal muscle. Mice were sacrificed at 1, 4, 8 and 12 days post-
injection (dpi). Both Th1-dominant strains presented more areas with
regenerating myofibers and macrophages at 4 dpi. Regional lymph nodes
showed significant increase of cellularity and relative numbers of CD3
+
CD4
+
in
bupivacaine-inoculated BALB/c mice compared to non-inoculated matched mice
at 4 dpi. BALB/c mice showed increased collagen expression and decrease of
MMP-9 activity associated with more mRNA for TGF-b1. This study shows that
the immune background of the mouse may affect the remodelling processes in
skeletal muscles that occur in response to bupivacaine injection promoting
muscle regeneration (Th1 cytokines) or myonecrosis and collagen deposition
(Th2 cytokines).

1

1. INTRODUO


1.1 TECIDO MUSCULAR ESQUELTICO

O msculo estriado esqueltico responsvel pela sustentao e
movimentao corporal devido a sua capacidade de contrao e de gerar uma
fora que aplicada sobre ossos e articulaes. Na maioria das vezes essa
contrao voluntria via estmulo nervoso. O msculo esqueltico formado
por clulas cilndricas alongadas e que possuem estriaes transversais. As
clulas musculares apresentam caractersticas especficas e por isto seus
componentes receberam nomes especiais. O citoplasma chamado de
sarcoplasma, o retculo endoplsmtico de retculo sarcoplasmtico e a
membrana citoplasmtica de sarcolema. Os ncleos de uma fibra muscular
esto todos localizados na periferia da fibra em contato com o sarcolema (Kerr,
2000).
Os msculos so formados por um conjunto de clulas que se originam
da fuso de mioblastos e se organizam em feixes cilndricos e multinucleados
com at 30 cm. Cada fibra muscular revestida por uma camada de tecido
conjuntivo chamada endomsio. Tais fibras so ento agrupadas em feixes
mantidos juntos por outra camada de tecido conjuntivo, denominada perimsio.
Esse grupo revestido ou feixe de fibras denominado fascculo. Os grupos de
fascculos com feixes de fibras, cada qual com vasos sangneos e tecido
nervoso associados, so mantidos bem unidos por outra camada de tecido
conjuntivo denominada epimsio. Os fascculos circundados por epimsio, que
percorrem todo o comprimento do msculo esqueltico, so ento
2
completamente circundados por um tecido conjuntivo denominado fscia (figura
1). A fscia um tecido conjuntivo denso e resistente que recobre todo o
msculo e, estende-se alm do msculo formando o tendo fibroso, cuja
funo fixar o msculo ao osso. Esta disposio do tecido conjuntivo mantm
a organizao das fibras musculares, permitindo que a fora de contrao seja
transmitida a outras estruturas como tendes e ligamentos e tambm influencia
na distribuio dos vasos sanguneos, linfticos e inervao (Junqueira &
Carneiro, 2004).


Figura 1: Estrutura do msculo esqueltico.
http://training.seer.cancer.gov/module_anatomy/unit4_2_muscle_structure.htm (acessado em
20/12/2006)

No interior de uma fibra muscular existe um nmero razovel de
unidades estruturais orientadas longitudinalmente chamadas de miofibrilas
formadas por filamentos de actina e miosina, as duas principais protenas
contrteis do msculo. As miofibrilas so cilndricas, com dimetro entre 1 e 2
m, podendo ser vistas ao microscpio ptico como estriaes transversais
sanguneo
Fibra muscular
fascculo
endomsio epimsio
tendo
osso
perimsio
3
com faixas claras e escuras (Kerr, 2000). A banda I (isotrpica), apresenta-se
mais clara porque a luz polarizada atravessa facilmente os finos filamentos de
actina que a constituem. A banda A (anisotrpica), apresenta-se mais escura
por ser composta por actina e filamentos espessos de miosina, o que dificulta a
passagem da luz. No centro de cada banda I aparece uma linha transversal
escura, a linha Z. O sarcmero, unidade estrutural do msculo, definido como
a regio da miofibra compreendida entre as duas linhas Z. No centro de cada
banda A existe uma rea mais clara chamada de banda H, exclusivamente
constituda de miosina (figura 2). Ao microscpio eletrnico podemos ver
filamentos finos de actina que partem da linha Z at o bordo externo da banda
H (Junqueira & Carneiro, 2004).











Figura 2 Estrutura da fibra muscular
www.adesnivel.pt/treino/musculo.htm (acessado em 16/02/2007)
ncleo
Banda I
Banda A
Disco Z
Mitocndria
Miofibra
Sarcoplasma
Sarcolema
Triad
Cisterna terminal
Tbulo transversal
Retculo
sarcoplasmtico
4

As miofibras so heterogneas no tamanho, metabolismo e funo
contrtil, o que permite uma grande variedade de funes de acordo com a
composio das fibras. Inicialmente as fibras foram classificadas como sendo
rpidas e lentas baseadas na velocidade de contrao. Esta diviso tambm
corresponde a diferenas morfolgicas, com os msculos rpidos sendo
brancos em algumas espcies como aves, e os msculos lentos de cor
vermelha. O maior contedo de mioglobina e capilares nos msculos
vermelhos contribui para a maior capacidade oxidativa dos msculos
vermelhos comparados com os brancos. Atualmente, as fibras musculares so
classificadas por trs diferentes mtodos: anlise histoqumica para ATPase,
identificao da isoforma de miosina e identificao bioqumica de enzimas
metablicas (Scott et al., 2001) ver figura 3.

Figura 3: Distribuio heterognea das fibras musculares esquelticas.
Anlise do tipo de fibra de sees transversais do msculo soleus de camundongos coradas
por hematoxilina-eosina (a), colorao metacromtica da ATPase mostrando fibras tipo I
(coradas em azul) e tipo IIA (azul claro), e em (c) imuno-histoqumica usando anticorpo
monoclonal que reconhece miosina do tipo I (Bassel-Duby & Olson, 2006).
5
1.2 FORMAO DO TECIDO MUSCULAR


O msculo esqueltico de vertebrados formado a partir do mesoderma
paraxial, o qual se segmenta em somitos em cada lado da notocorda e do tubo
neural (Christ & Ordahl, 1995). A poro dorsal do somito originar os
msculos dos membros e do corpo, enquanto alguns msculos da cabea so
originados da poro anterior no segmentada, mesoderma paraxial e
mesoderma pr-cordal (Buckingham et al., 2003).
A miognese um processo que envolve uma cascata complexa de
eventos incluindo especificao e a diferenciao das clulas precursoras ou
mioblastos, que se fusionam para formar os miotubos primrios e secundrios
e a subseqente maturao. Todos esses eventos se do sob um controle
gentico restrito e envolve a migrao de clulas precursoras (Muntoni et al.,
2002). Genes da famlia Pax, caracterizados pela presena de um homeobox e
um paired box, esto implicados na proliferao de vrias linhagens de
precursores (Pownall et al., 2002; Chen & Goldhamer, 2003; Charge &
Rudnicki, 2004). Pax-3 e Pax-7 possuem um papel importante durante o
desenvolvimento do msculo esqueltico (Hawke & Garry, 2001; Chen &
Goldhamer, 2003; Charge & Rudnicki, 2004). Famlias de fatores de
transcrio, como MRF (fatores regulatrios miognicos) que pertencem
superfamlia de fatores de transcrio bHLH (basic helix-loop-helix), esto
implicados na formao do msculo esqueltico (Charge & Rudnicki, 2004). A
famlia MRF consiste de MyoD (Myf-3), Myf-5, miogenina (Myf-1) e MRF4 (Myf-
6/Herculin) (Sabourin & Rudnicki, 2000). MyoD e o Myf-5 so os fatores
primrios e agem na determinao miognica, enquanto a miogenina e o MRF4
so fatores de diferenciao (Sabourin & Rudnicki, 2000). Camundongos duplo
6
nocaute para Myf-5 e MyoD no conseguem formar msculo esqueltico
devido a ausncia de precursores de mioblastos (Rudnicki et al., 1993). Clulas
miognicas com proliferao positiva para MyoD e /ou Myf5 formam mioblastos
que proliferam e saem do ciclo celular para se tornarem micitos diferenciados.
Estes expressam as MRFs, miogenina e MRF4, e subseqentemente genes
musculares especficos como a cadeia pesada de miosina (MHC) e creatina
quinase muscular (MCK) (Charge & Rudnicki, 2004). Durante o
desenvolvimento muscular, uma populao de mioblastos no se diferencia,
permanecendo associada superfcie da fibra em desenvolvimento como
clulas satlites musculares quiescentes (Charge & Rudnicki, 2004).

1.3 REPARO DO TECIDO MUSCULAR
O msculo esqueltico de mamferos tem a capacidade de realizar
regenerao rpida e extensa em resposta a injria grave devido a defeitos
genticos e atividade fsica intensa. A regenerao muscular caracterizada
por trs fases: degenerao, reparo e remodelagem (Jarvinen et al., 2005). O
evento inicial da degenerao muscular a necrose das fibras musculares.
Esse evento iniciado geralmente pela ruptura do sarcolema resultando em
aumento da permeabilidade da miofibra. A ruptura da miofibra se reflete pelo
aumento dos nveis sricos da protena muscular creatina kinase. A
permeabilidade aumentada da fibra muscular a corantes de baixo peso
molecular como azul de Evans uma indicao da leso do sarcolema
associada a exerccios extensos e doenas degenerativas. Na leso muscular
alm de necrose, degenerao e infiltrado de clulas inflamatrias tambm
evidente o extravasamento sangneo com formao de hematoma (Charge &
7
Rudnicki, 2004). Esse processo seguido por uma fase de reparo onde ocorre
a fagocitose do tecido lesionado, regenerao das miofibras, formao do
tecido cicatricial e revascularizao. Durante a fase seguinte, a fase de
remodelagem, ocorre contrao e reorganizao do tecido cicatricial e a
recuperao da capacidade funcional do msculo (Peng & Huard, 2004).
Na fase inicial da leso muscular geralmente ocorre ativao de clulas
mononucleares, principalmente clulas inflamatrias e clulas miognicas. No
perodo ps-leso as principais alteraes histolgicas no stio de leso so:
necrose da miofibra e aumento do nmero de clulas mononucleares de
origem no muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Estudos recentes sugerem
que fatores liberados por msculos lesionados ativam as clulas inflamatrias
residentes que em troca produzem sinais quimiotticos para as clulas
inflamatrias circulantes (Warren et al., 2004).
Aps leso muscular induzida por exerccios ou por miotoxinas, os neutrfilos
so as primeiras clulas inflamatrias a invadir o msculo lesionado, com
aumento numrico nas primeiras 6 horas. Os macrfagos se tornam o tipo
celular predominante aps 48h. Macrfagos fagocitam restos celulares e
podem afetar outros aspectos da regenerao muscular ativando clulas
miognicas (Tidball, 2005).
Experimentos de marcao nuclear mostraram a contribuio das
clulas satlites como uma fonte importante de novos mioncleos na
regenerao de miofibras (revisado em Zammit et al., 2006)). Aps a fase de
proliferao miognica, as novas fibras musculares formadas, como na
miognese embrionria, sofrem diferenciao e se fusionam a fibras lesionadas
j existentes ou formam novas miofibras (figura 4A). As miofibras recm-
8
formadas so basoflicas, apresentam calibre pequeno, nucleao central
(figura 4B) e expressam formas de MHC embrionrio. Em sees longitudinais
e em fibras isoladas a nucleao central observada em pores discretas na
rea de regenerao ou ao longo de toda a fibra sugerindo que durante a
regenerao a fuso celular no difusa, mas focal ao local da leso. Aps a
completa fuso das clulas miognicas, as fibras aumentam de tamanho e o
mioncleo se move para a periferia da fibra. Sob condies normais o msculo
regenerado no pode ser diferenciado morfologicamente nem funcionalmente
(Figura 4C) (Charge & Rudnicki, 2004).
9

Figura 4: Estgios de regenerao do tecido muscular.
A Representao grfica dos estgios de uma cintica de regenerao incluindo ativao de
clulas satlites (2 horas aps a injria), proliferao de clulas satlites, diferenciao
(caracterizado pelas miofibras centronucleadas) e maturao. B - Corte histolgico de msculo
corado por HE 5 dias aps inoculao de cardiolipina (cabea de seta - fibras
centronucleadas). Aps 2 semanas (C ) as fibras j restauraram a citoarquitetura e apresentam
nucleao perifrica (cabea de seta) (Shi & Garry, 2006)


1.4 PROGENITORES MIOGNICOS
1.4.1 Clulas Satlites:
As clulas satlites foram primeiramente descritas em 1961 por Alexander
Mauro como mioblastos adormecidos, localizados entre a lmina basal
muscular e o sarcolema da fibra muscular, que no sofreram total
desenvolvimento embrionrio e que so capazes de retomar esse programa de
miognese em resposta a uma leso muscular (Mauro, 1961). As clulas
Maturao
Diferenciao
Proliferao
Ativao
Dias aps injria
10
satlites ainda so encontradas em abundncia logo aps o nascimento,
correspondendo em camundongos a 30% dos ncleos musculares
sublaminares (Cardasis & Cooper, 1975; Chen & Goldhamer, 2003). Contudo,
aps o nascimento, essa proporo diminui para menos de 5% no camundongo
adulto e continua a cair lentamente aps a puberdade (Chen & Goldhamer,
2003; Charge & Rudnicki, 2004).
No msculo normal clulas satlites so normalmente quiescentes e
expressam marcadores como Pax-7+, CD34 e M-caderina (revisado em
Zammit et al., 2006). Inicialmente, achava-se que Pax-7 era essencial para
especificao de clulas satlites, porque camundongos mutantes nocaute
para Pax-7 pareciam no possuir clulas satlites porm possuam
comprometimento da regenerao muscular. Contudo clulas satlites podem
ser detectadas na ausncia de Pax-7, porm sua manuteno e proliferao
parece ser defeituosa, sugerindo que Pax-7 possua um importante papel anti-
apopttico (Relaix et al., 2006).
Clulas satlites quiescentes no expressam nveis detectveis de
nenhum dos MRFs. Aps a injria e/ou ativao, a expresso de MyoD
induzida em 12 horas, antes mesmo da expresso de PCNA (antgeno nuclear
de proliferao celular), um marcador para proliferao celular. A expresso de
miogenina ocorre tardiamente durante a fuso e diferenciao (Figura 5).
Anlise da expresso gnica de clulas satlites individuais ativadas, mostrou
inicialmente a expresso de Myf-5 ou MyoD, seguida da coexpresso desses
marcadores durante a fase proliferativa e de miogenina e MRF-4 na fase de
diferenciao terminal (Cornelison & Wold, 1997; Charge & Rudnicki, 2004).
Clulas satlites que mantm a expresso de Pax e diminuem expresso de
11
Myo-D, reconstituem o compartimento de clulas satlites (figura 5) (Zammit et
al., 2006).










Figura 5: Regulao molecular da regenerao do tecido muscular .
Durante o crescimento ps-natal e regenerao do msculo adulto, clulas satlites
quiescentes tornam-se ativadas, proliferam e se diferenciam em novas fibras musculares ou
retornam ao estado de clulas satlites. Este ciclo orquestrado por fatores miognicos como
indicado. Na ausncia de Pax-7, as clulas satlites morrem. Modificado a partir de
Buckingham, 2006

As clulas satlites miognicas, apesar de serem mais diferenciadas que as
clulas tronco ainda apresentam plasticidade. Experimentos in vitro mostraram
a capacidade de linhagens mioblsticas expressarem em diferentes condies
de cultivo, marcadores caractersticos da diferenciao de tecido sseo e
adiposo (Runx2 e PPARy, respectivamente), com diminuio da expresso de
MyoD. Isto no s mostra o seu carter plstico, mas a importncia do
microambiente para a remodelagem do tecido muscular lesionado (Chen &
Goldhamer, 2003).
Mioncleo
Fibra
muscular
Lmina
basal Clula satlite
12
A ativao e regenerao do tecido muscular so influenciadas por
interaes intercelulares, com a matriz extracelular e fatores secretados. A
prpria injria muscular induz a liberao no espao extracelular (Figura 6) de
mediadores da resposta inflamatria e outras molculas biologicamente ativas.
Estudos in vitro tem evidenciado vrios fatores trficos: membros da famlia
FGF (fator de crescimento de fibroblastos), IGFs (fator de crescimento do tipo
insulina), HGF (fator de crescimento de hepatcitos, neurotrofinas e citocinas
como por exemplo TGF (fator de transformao de crescimento) e Interleucina-
6 (Hawke & Garry, 2001; Charge & Rudnicki, 2004).
13











Figura 6- Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites (Hawke & Garry,
2001)
EGF - Fator de crescimento para endotlio, FGF - Fator de crescimento para fibroblasto, HGF
Fator de crescimento de hepatcito, IGF-I - Fator de crescimento tipo insulina 1, IGF-II - Fator
de crescimento tipo insulina 2, IL-6 - Interleucina-6, LIF - Fator de inibio da migrao
macrfago, NO - xido Ntrico, PDGF - Fator de crescimento derivado de plaqueta, TGF- -
Fator de crescimento de transformao-.


1.4.2 Contribuio de outras clulas miognicas no reparo do tecido
muscular
Nos ltimos anos, vrios trabalhos tm mostrado que outras populaes
celulares podem participar da regenerao muscular. Os experimentos de
Ferrari e colaboradores mostraram que aps um transplante de medula ssea,
clulas derivadas do doador so capazes de participar da regenerao do
Macrfagos
Neutrfilos
Linfcitos T
Plaquetas
Resposta imune
LIF
IL-6
PDGF
Citocinas
IGF-I
IGF-II
FGF
TGF-
HGF
Outros fatores Neurnio motor
Testosterona
NO
Neurotransmissores
Fatores neurotrficos
Vasculatura Fatores autcrinos
IGF-I
IGF-II
TGF-
HGF
FGF
EGF
PDGF
IGF-I
IGF-II
EGF
HGF
Clula
satlite
14
tecido muscular (Ferrari et al., 1998). Apesar das clulas derivadas da medula
ssea contribuir bem menos que as clulas satlites, este experimento criou
enorme interesse no potencial de diferenciao plstico e na possibilidade de
novas estratgias teraputicas. Essas populaes residem no msculo
esqueltico ou podem ser recrutadas de compartimentos no musculares em
resposta injria e regenerao (figura 7).
As SP (side population), caracterizadas pela expresso de Sca-1
high
e
CD45
low
,constituem uma populao de clulas progenitoras residentes nos
tecidos adultos (medula ssea; msculo esqueltico). Estas clulas aumentam
em nmero aps a injria e participam na regenerao (Meeson et al., 2004).
MDSC (muscle-derived stem cells) so outra populao de clulas tronco com
potencial miognico isoladas do msculo esqueltico adulto expressando os
marcadores Sca-1 e CD34 (revisado em Shi & Garry, 2006).
15













Figura 7: Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao muscular.
A maioria das clulas satlites (Pax3+/Pax7+) derivada do somito. Clulas progenitoras que
tambm contribuem para o pool de clulas satlites e regenerao muscular incluem: clulas
intersticiais (muscle derived stem cells ou MDSC, SP, CD45+/Sca-1+, Sca-1+, CD34+); clulas
de medula ssea (clulas tronco hematopoticas, clulas tronco mesenquimais, clulas
progenitoras adultas multipotentes) e progenitores vasculares (Shi & Garry, 2006)


Existe evidncia experimental que progenitores associados a vasos
derivados da aorta dorsal apresentam potencial miognico e so capazes de
participar da regenerao muscular. Outros componentes vasculares como
progenitores endoteliais e pericitos tambm apresentam potencial miognico
(Shi & Garry, 2006). As MDSCs residentes no msculo esto intimamente
associadas a vasculatura, especificamente aos capilares ao redor da fibra,
apesar de tambm serem encontradas sob a lmina basal das miofibras, um
Miofibra
Clula satlite
Clulas
intersticiais
Progenitores
vasculares
Mioncleo
Miofibra
Cls de m. ssea
16
stio preferencial das clulas satlites. Tanto as clulas endoteliais como 60%
das MDSCs so CD34
+
Sca1
+
sugerindo serem subpopulaes de clulas
endoteliais. Essas clulas se diferenciariam em clulas do endotlio vascular e
fibras do msculo esqueltico aps serem implantadas no msculo (Peng &
Huard, 2004).
As clulas precursoras miognicas no somente contribuem para
regenerar miofibras no msculo lesionado, mas tambm so capazes de
reconstituir o compartimento de clulas satlites. Contudo, a freqncia muito
baixa (mesmo na injria) comparando-se com o nmero de mioblastos
derivados de clulas satlites. O aumento do recrutamento dessas clulas para
a leso atravs do aumento da expresso local de IGF-1 ou SDF-1 no
aumentou o nmero de mioncleos originados do doador (Askari et al., 2003;
Musaro et al., 2004). Por isto, importante investigar os mecanismos e sinais
envolvidos na fuso ou transdiferenciao a fim de propor novas estratgias
para aumentar a eficincia da converso de outras clulas precursoras (Long et
al., 2005).

1.5 PARTICIPAO DA INFLAMAO NO REPARO TECIDUAL
O dano tecidual inicia uma invaso rpida e seqencial de clulas
inflamatrias que persistem por dias ou meses, enquanto ocorre a regenerao
e/ou reparo do tecido (figura 8). A participao da inflamao no reparo um
fenmeno complexo e nem sempre benfico para o tecido. Mesher e Neff
propuseram que a evoluo do sistema imune de mamferos gerou interaes
celulares inflamatrias nos stios de injria proporcionando maior defesa contra
microorganismos e facilitao do reparo tecidual, embora prejudicando a
17
capacidade regenerativa do tecido. A leso normalmente est associada
formao de tecido cicatricial e fibrose, sendo este fenmeno um resultado
direto das interaes inflamatrias do sistema imune e fibroblastos no stio da
injria (Mescher & Neff, 2005).

Figura 8 - Cintica da migrao celular nas fases da leso tecidual (Witte & Barbul, 1997)

Os macrfagos e neutrfilos possuem papel importante na injria, pela sua
atividade microbicida e fagoctica de modo a garantir no s a destruio de
agentes infecciosos, mas promovendo a remoo de debris celulares que
possam amplificar a inflamao e atrapalhar o processo de reparo do tecido.
Entretanto, em modelos de leso muscular j foi mostrado que neutrfilos
podem promover dano muscular atravs da produo de molculas citotxicas
e citolticas (Tidball, 2005). Alm da atividade fagoctica, os macrfagos
secretam citocinas, fatores de crescimento e xido ntrico (NO), agentes que
Coagulao
Inflamao
Migrao/proliferao
Remodelagem
Nmero de
. clulas
Fibroblastos
Linfcitos
Dias aps ferida
Plaquetas
Neutrfilos
Macrfagos
18
esto envolvidos em diversos processos necessrios para o reparo em
diferentes tecidos como por exemplo: pele, tecido muscular, fgado, endotlio e
pulmo (Shi et al., 1997; Cowin et al., 1998; Oliveira et al., 2000; Sandler et al.,
2003; Park & Barbul, 2004).
Citocinas e fatores de crescimento regulam a quimiotaxia e proliferao
de fibroblastos, a sntese de colgeno e a angiognese (Granstein et al., 1987;
Gillery et al., 1992; Park & Barbul, 2004). A liberao de NO regula a formao
de colgeno, a proliferao celular e a contrao da leso em modelos animais
de reparo tecidual (Hesse et al., 2001; Witte & Barbul, 2002; Park & Barbul,
2004). No msculo esqueltico j foi mostrado que macrfagos so essenciais
para desencadear o processo de regenerao aps transplante de mioblastos
(Lescaudron et al., 1999). Alm disso, meio condicionado de cultura de
macrfagos peritoneais pode aumentar a proliferao de mioblastos in vitro
bem como o nmero de clulas expressando Myo-D. Entretanto os
mecanismos envolvidos nesses processos no so claros (Tidball, 2005).
Clulas do sistema imune inato possuem mecanismos para integrar a
resposta imune e reparo tecidual, incluindo uma variedade de receptores de
superfcie como Toll (TLRs) que reconhecem todas as classes de
microorganismos invasores como tambm protenas de choque trmico que
so liberadas do tecido necrosado ou danificado. A ligao a tais receptores
ativa a sntese de citocinas que amplificam a inflamao, aumentando a
resposta a microorganismos e promovendo o reparo tecidual. Receptores Toll
foram primeiramente descritos em drosfilas controlando o padro dorso-
ventral nos embries em desenvolvimento porm TLR de vertebrados possui
efeitos alm do reconhecimento imune (Mescher & Neff, 2005), isto porque a
19
via TLR de clulas imunes induz a expresso de muitos genes diretamente
envolvidos no reparo tecidual, incluindometaloproteases, citocinas e fatores
angiognicos (Li et al., 2001).
O papel dos linfcitos na inflamao e reparo tecidual complexo e
ainda pouco compreendido. No existem evidncias claras da participao
direta de linfcitos B no reparo tecidual contudo imunoglobulinas reativas
facilitam na remoo do tecido lesionado facilitando a fagocitose e/ou
citotoxicidade por macrfagos (Casadevall & Pirofski, 2003; Park & Barbul,
2004). Os linfcitos T podem participar do processo de reparo, tanto
propiciando a melhora tecidual como amplificando a leso, direcionando o
processo para uma remodelagem no funcional, que peculiar a cada tipo de
tecido (Kovacs & DiPietro, 1994; Sandler et al., 2003). Ablao do timo em
ratos aumenta a maturao de feridas e a produo de um colgeno mais
fibroso com alto grau de hidroxilao (Barbul et al., 1982). Esse efeito inibido
por enxerto de timo na cavidade peritoneal. Camundongos nude atmicos,
independentemente da linhagem de origem, produzem cicatrizes mais finas,
quase indistinguveis do tecido normal adjacente, associadas com a diminuio
de clulas T CD8
+
das leses (Gawronska-Kozak et al., 2006). Neste sentido,
Morrison e colaboradores mostraram que o acmulo de colgeno intramuscular
no camundongo mdx, modelo murino de distrofia muscular, muito
influenciado pela presena de linfcitos T (Morrison et al., 2000).
A contribuio de clulas T CD4
+
no reparo tecidual seria principalmente
pela secreo de citocinas. Durante a inflamao ou infeco, linfcitos T so
polarizados em clulas efetoras Th1 e Th2 com perfis distintos de produo de
citocinas. As chamadas citocinas Th1 incluem IFN-, IL-2, IL-12, IL-18 e
20
produzem imunidade celular por ativar clulas T citotxicas, NK e macrfagos.
Citocinas Th2, notadamente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 estimulam uma resposta
imune humoral. Vrios autores sugerem que citocinas Th1 promovem
regenerao da arquitetura do tecido normal, enquanto citocinas Th2
favorecem a ativao de fibroblastos, produo de colgeno e fibrognese
(Sime & O'Reilly, 2001; Azouz et al., 2004). Essas citocinas podem ser
produzidas tambm por outras clulas incluindo fibroblastos, macrfagos e
mastcitos (Sime & O'Reilly, 2001). A influncia do perfil de citocinas na
induo de fibrose evidente no modelo de leso heptica, onde
camundongos BALB/c com padro Th2 apresentam intensa fibrose aps leso
heptica ao contrrio dos camundongos C57BL6 com padro tpico Th1, que
apresentam menos fibrose. O envolvimento das citocinas na induo de fibrose
foi mostrado pelo tratamento destes animais com anticorpos neutralizantes
para IL-4 ou com IFN- exgeno resultando na atenuao da fibrose (Shi et al.,
1997). IFN- um potente inibidor da proliferao de fibroblastos e da sntese
de colgeno e tambm um regulador positivo da ao dos macrfagos (Shffer
& Barbul, 1998). IFN- inibe a sinalizao do TGF-1 que um estimulador de
fibrose, sendo assim, reduz a formao de fibrose e aumenta a cicatrizao.
Recentemente foi mostrado que a inoculao de IFN- reduz a fibrose e
melhora o reparo do tecido muscular no modelo de leso muscular lacerante
(Foster et al., 2003). A remodelagem tecidual associada com padro Th2 induz
um aumento na produo de colgeno por vrios mecanismos, contudo IL-13
parece ser o mediador crucial atravs da estimulao da produo de TGF-1
por macrfagos. Outro mecanismo provvel de ao de Th1 no reparo
21
atravs da induo da expresso de iNOS em macrfagos, uma vez que regula
a produo de colgeno (Hesse et al., 2001).
TGF-, citocina produzida principalmente por fibroblastos, algumas
clulas epiteliais, macrfagos e linfcitos T indiscutivelmente, o regulador de
fibrose mais intensivamente estudado (Mescher & Neff, 2005). In vitro, o TGF-
um potente quimioatraente para fibroblasto que estimula a sntese de
colgeno e fibronectina (Shffer & Barbul, 1998). Existem 3 isoformas de TGF-
em mamferos TGF-1, -2 e -3. A fibrose tecidual principalmente
atribuda a isoforma 1. TGF-1 uma citocina armazenada na forma inativa,
como um homodmero que no covalentemente acoplado a uma protena
associada latncia (LAP). A ligao da citocina aos seus receptores requer a
dissociao do LAP, um processo catalisado por vrios agentes, entre eles
plasminognio, trombospondina e MMPs (metaloproteases). Alm da induo
da produo de TGF-1 latente, a IL-13 ativa TGF- ao regular a expresso de
MMPs que clivam o complexo TGF/LAP. No msculo, a cascata fibrognica
tambm iniciada por TGF-1 e recentemente foi mostrado que este induz
clulas precursoras miognicas a se diferenciarem em miofibroblastos no
msculo lesado (Li et al., 2004). Sabe-se que o TGF- inibe a diferenciao
das clulas miognicas e impede a expresso do MyoD (Tidball, 2005). O
processo de fibrose uma das etapas patolgicas mais importantes da
regenerao muscular. Acredita-se que a fibrose ocorra em resposta ao
estmulo de mediadores inflamatrios como o TGF-, que acelera a deposio
e sntese da matriz extracelular mas inibe a sua degradao (Li et al., 2004). O
aumento da expresso de TGF-1 acarreta na diferenciao de mioblastos em
clulas fibrticas mas o tratamento com decorina, um inibidor do TGF-1, evita
22
esse processo (Li et al., 2004). O papel do TNF- na leso muscular e
regenerao pode variar com o tipo, a gravidade, localizao e estgio da
leso.(Tidball, 2005). J foi visto que TNF- capaz de inibir a sntese de
colgeno e fibronectina pelos fibroblastos e diminuir a proliferao das clulas
endoteliais (Shffer & Barbul, 1998). TNF- tambm aumenta a proliferao e
a agregao de mioblastos. Em contraste o TNF inibe a expresso dos fatores
de transcrio MyoD e miogenina, que regulam a atividade de genes
especficos como genes de protenas de miofilamentos, e bloqueia a sntese de
mRNAs de marcadores de diferenciao miognicos como -actina (Szalay et
al., 1997).
Fibroblastos e outras clulas estruturais expressam o receptor de
superfcie CD40 e so por isto capazes de receber ativao adicional por
CD40L na superfcie de linfcitos T helper, mastcitos, basfilos eosinfilos e
plaquetas. A sinalizao via CD40 em fibroblastos ativa o fator de transcrio
NF-b que em fibroblastos estimula a sntese de citocinas adicionais,
componentes da matriz extracelular (ECM) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). COX-
2 em fibroblastos induz a produo de PGE2 (protraglandina E2). PGE2 alm
de estimular vrios aspectos da inflamao como dor e febre tambm estimula
a produo de citocinas Th2 promovendo a fibrose (revisado em Mescher &
Neff, 2005) - ver Figura 9.


23

Figura 9 Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual. (Sime & O'Reilly,
2001)


1.6 METALOPROTEASES NA REGENERAO E REPARO DO TECIDO
MUSCULAR
Durante a degenerao e regenerao do msculo esqueltico ocorre
uma remodelagem da ECM. Esse processo coordenado
pelasmetaloproteases (MMP) e serino-proteases endopeptidases dependentes
de ons Zn
+2
e/ou Ca
+2
com estrutura molecular composta por pelo menos de
trs domnios: um peptdeo sinal de aproximadamente 20 aminocidos; um pro-
peptdeo que mantm a latncia da protena por possuir uma conformao
especfica entre cistenas e um on Zn
+2
contendo aproximadamente 80
aminocidos e um stio cataltico de aproximadamente 170 aminocidos
Injria e inflamao
Tipo I
Tipo II
Resoluo
normal
Fibrose e acmulo de miofibroblastos
Deposio de ECM
Destruio da citoarquitetura
Alterao de funo
Fibrose

24
(Goldman et al., 2003). A expresso e atividade das MMPs so reguladas tanto
ao nvel de transcrio pelas citocinas e fatores de crescimento e a nvel ps-
traduo, pela secreo dessas enzimas em formas latentes (pr-pr-MMP) e
ativao de zimognios (pr-MMP) por integrinas e proteases presentes tanto
no meio extracelular como as associadas membrana celular (Lafreniere et al.,
2004). Existe um balano delicado entre a produo endgena de inibidores
teciduais TIMPs (inibidores de MMP no tecido) e a produo de MMP no
microambiente determinando a remodelagem fisiolgica ou destruio
patolgica do tecido (Nagase et al., 2006).
Existem cinco famlias demetaloproteases: as gelatinases, as
colagenases, as estromelisinas, as metaloelastases e asmetaloproteases de
membrana que so protenas integrais de membrana. Sua ativao se d em
duas etapas. Primeiramente ocorre uma clivagem inicial por ativadores como
citocinas, hormnios, fatores de crescimento e NO desestabilizando a
coordenao entre o Zn
+2
e as cistenas, e em seguida ocorre uma clivagem
final geralmente por outra MMP liberando o radical amino terminal da enzima
madura (Johnson et al., 1998).
Durante o processo inflamatrio as MMPs so produzidas por quase
todas as populaes recrutadas, alm estarem aumentadas nas clulas
residentes como miofibras prximas a uma leso e em progenitores como as
clulas satlites (Kherif et al., 1999). As MMPs participam do processo
inflamatrio regulando a atividade das citocinas e quimiocinas e modulando a
sua biodisponibilidade, uma vez que estas esto aderidas a matriz extracelular
(Roach et al., 2002). Como exemplo podemos citar a MMP-2, que capaz de
clivar a quimiocina CCL7. A quimiocina clivada ainda capaz de se ligar aos
25
seus receptores, porm perde sua capacidade quimiottica e atua como
antagonista de todas quimiocinas que se ligam aos mesmos receptores que a
CCL7. Por outro lado a MMP-8 quando cliva a quimiocina CXCL5 gera diversos
peptdeos com ao quimiottica para neutrfilos (Parks et al., 2004).
As MMP-9 (gelatinase A) e MMP-2 (gelatinase B) constituem as
principaismetaloproteases envolvidas no reparo do tecido muscular (Kherif et
al., 1999; Carmeli et al., 2004). A MMP-9 est associada com a migrao de
clulas inflamatrias e possivelmente ativao de clulas satlites, enquanto
a MMP-2 constitutiva do tecido muscular, mas est aumentada durante o
processo de regenerao muscular (Kherif et al., 1999). Em camundongos
C57BL10 com leso muscular induzida por cardiotoxina, a MMP-9 est muito
aumentada durante o auge da inflamao com predomnio de macrfagos e
neutrfilos (Kherif et al., 1999). A partir da segunda semana, os nveis de MMP-
9 diminuem e a MMP-2 atinge o mximo. A expresso de MMP-2, presente de
forma constitutiva no tecido muscular, regula a integridade e composio da
composio da ECM, e tambm a proliferao e diferenciao de mioblastos
(revisado em (Carmeli et al., 2004). A participao de MMP-2 durante a fuso
de mioblastos deve-se em parte degradao de colgeno tipo IV como
tambm outros componentes da membrana basal como a entactina (Kherif et
al., 1999).


1.7 MODELOS ANIMAIS DE INJRIA MUSCULAR
Os modelos animais de injria muscular (mecnicos, fsicos ou
qumicos) tm sido utilizados com o intuito de trazer uma melhor compreenso
26
na dinmica da leso e reparo do tecido muscular (Hawke & Garry, 2001). O
modelo de leso muscular pelo esmagamento muito utilizado para estudar
fatores que influenciam a fibrose. Outros modelos tambm muito utilizados so
a denervao (Mussuni et al., 1987) e induo de leso por congelamento
(Creuzet et al., 1998). Para estudar o processo de regenerao muscular de
forma controlada e reproduzvel utilizam-se as miotoxinas, entre elas a
cardiotoxina (CTX), notexina (NTX) e bupivacana. Essas toxinas tm uma
ampla gama de atividades biolgicas, que no so completamente conhecidas.
A cardiotoxina um peptdeo extrado do veneno de cobra que induz a
desorganizao do sarcolema. NTX uma fosfatase A2 neurotxica tambm
retirado do veneno de cobra que bloqueia a transmisso neuromuscular
inibindo a liberao da acetilcolina. CTX induz uma forma bastante reproduzvel
de leso muscular, porm ainda no so conhecidos os efeitos dessa toxina
sobre os vrios tipos de clulas musculares, incluindo as miognicas
progenitoras (Charge & Rudnicki, 2004).
Bupivacana, um anestsico muito utilizado em obstetrcia, induz um
processo de regenerao muscular com etapas bem definidas de mionecrose e
inflamao seguida de regenerao do tecido muscular. Neste modelo
normalmente aps 10 dias de induo da injria ocorre estabilizao da
arquitetura tecidual (Hawke & Garry, 2001; Sandri, 2001; Charge & Rudnicki,
2004). A regenerao rpida neste modelo devido preservao das clulas
satlites, do suprimento sanguneo e da inervao (Nonaka et al., 1983). A
bupivacaina induz necrose, e em menor extenso, apoptose das miofibras pelo
aumento de clcio intracelular (Zink & Graf, 2004). As clulas satlites parecem
27
mais resistentes ao lesiva da bupivacana do que as clulas musculares
maduras (Nonaka et al., 1983).
Modelos de animais de laboratrio com degenerao anormal devido a
desregulao espontnea ou artificial de genes especficos tambm so de
grande interesse. Por exemplo, o camundongo mdx comumente usado como
modelo animal da distrofia muscular de Duchenne (DMD) e como um modelo
alternativo de degenerao para estudo do reparo muscular. Esses animais
apresentam uma mutao no cromossoma X o que determina a no expresso
de distrofina, uma protena localizada internamente no sarcolema associada ao
citoesqueleto, essencial para manter a integridade da fibra muscular. Os
camundongos mdx apresentam miopatia inflamatria com ciclos de mionecrose
e regenerao do tecido muscular (De la Porte et al., 1999). Ao contrrio dos
camundongos mdx, a doena fatal nos humanos, sendo este modelo animal
muito utilizado para estudar os fatores que influenciam a regenerao do tecido
muscular. Existem ainda outros modelos com particularidades genticas, onde
se estuda a regenerao em camundongos deficientes de genes miognicos
como Pax7 e MyoD e transgnicos para fatores sistmicos com influncia no
crescimento muscular como IGF-1 (Charge & Rudnicki, 2004).
28
2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL
Analisar a influncia do microambiente no processo de regenerao muscular
em linhagens de camundongos com padro de citocinas Th1 ou Th2 utilizando
o modelo de induo de leso muscular da bupivacana.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Comparar as alteraes histolgicas na rea da leso induzidas por
bupivacana entre as linhagens de camundongos BALB/c e C57.
Analisar a expresso de colgeno na leso atravs da colorao
especial de picrosirius
Caracterizar por imuno-histoqumica as clulas mononucleares do
infiltrado celular presente na leso.
Caracterizar por citometria de fluxo os subtipos de linfcitos nos
linfonodos de drenagem do tecido muscular lesionado
Analisar a atividade das metaloproteases MMP-2 e MMP-9 no
msculo lesionado pela tcnica de zimografia
Analisar a expresso do mRNA para citocina TGF- no msculo
lesionado atravs da tcnica de RT-PCR.
29

3. MATERIAL & MTODOS

3.1 Animais
Nos experimentos foram utilizados camundongos machos isognicos na
idade de 5 a 6 semanas das linhagens C57BL10, C57BL6, BALB/c. Os animais
foram mantidos em ambiente refrigerado (20 C) e aclimatado com ciclo de
iluminao 12:12 horas, no Biotrio da Fundao Oswaldo Cruz e no Biotrio
de Patologia Celular do Instituto de Biologia da UFF. Os animais foram
mantidos em gaiolas de prolipropileno forradas com maravalha peneirada e
autoclavada recebendo rao Nuvital (Curitiba, Brasil), suplementao
alimentar (farelo de trigo e semente de girassol) e vitamnica (Vitagold), gua
filtrada ad libitum.

3.2 Induo da leso muscular
A leso muscular foi induzida nos animais saudveis pela inoculao de
34l de cloridato de bupivacana a 0,5% diludo em salina estril (Mussuni et
al., 1987) no msculo Triceps brachii de ambos os membros. A inoculao foi
realizada com seringa Hamilton de 100L acoplada a dosador mecnico. Os
grupos controle e sham foram submetidos s mesmas condies experimentais
porm inoculados com PBS. Os animais foram sacrificados com vapor de CO
2
1, 4 , 8 e 12 dias aps a induo de leso. O msculo T.brachii foi processado
adequadamente para realizao das tcnicas de histologia, imuno-
30
histoqumica, zimografia, PCR e western blot e os linfonodos braquial e axilar
para citometria de fluxo.

3.3 Processamento histolgico
Para o processamento histolgico os msculos foram fixados durante 24
horas em formol tamponado Milloning a 10% pH 7,2. Os tecidos foram
desidratados em solues com concentrao crescente de lcool etlico (70%,
80%, 90%) num perodo de 60 minutos cada, passados 3 vezes em lcool
absoluto e 3 vezes em Xilol (Reagen). A impregnao e incluso em parafina
(paraplast, Sigma, USA) foi efetuada em duas incubaes durante 1 hora a 60
C. Os msculos foram clivados e includos transversalmente com as pores
centrais do fragmento posicionadas mais externamente no bloco. Foram feitos
em mdia 10 cortes de 5m de espessura no micrtomo Spencer 820
(American Optical, EUA) aps chegar no nvel da leso muscular. Os cortes
foram colocados em lminas de microscopia desengorduradas e previamente
filmadas com soluo de glicerol-albumina (0,5%), mantidos em estufa a 37C
durante 12 horas e submetidos s coloraes histolgicas de hematoxilia-
eosina (HE), Picrosrius e Giemsa.

3.4 Imuno-histoqumica
O msculo T. brachii foi cuidadosamente removido, congelado em
nitrognio lquido e includo em OCT (Sakura, EUA). Cortes de 5 m de
espessura foram colocados em lminas desengorduradas e previamente
filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chem. Co, Mo, EUA). Aps a fixao por 10
31
minutos em acetona a -20C, os cortes foram mergulhados em soluo de
salina-fosfato tamponada (PBS pH 7,2) por 5 minutos. A inibio da peroxidase
endgena foi feita com 3% perxido de hidrognio (Merck do Brasil) por 30
minutos. Os cortes foram hidratados com PBS por 5 minutos e, posteriormente
feito o bloqueio de antgenos inespecficos incubando com PBS contendo 2%
de albumina bovina (BSA frao V, Sigma Chem. Co., EUA) durante 30
minutos a 37C. A seguir os cortes foram incubados com os anticorpos
primrios diludos em PBS (30l) por 1 hora a 37C (ver tabela 1). Aps trs
lavagens sucessivas de 5 minutos com PBS, os cortes foram incubados em
cmara mida com anticorpo secundrio apropriado diludo em PBS (30l) por
uma hora temperatura ambiente. Aps novas lavagens com tampo PBS, a
revelao da peroxidase foi feita com aminoetilcarbazol (AEC, Sigma Chem.
Co., EUA) na presena de 3% de perxido de hidrognio (Merck do Brasil).
Todos os cortes foram contra-corados suavemente com hematoxilina de Mayer
por 2 minutos e montados em meio de montagem a base de gelatina.

Tabela 1: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na imuno-histoqumica.
Anti-CD4.biotina rato Caltag 1/80
Anti-CD8.biotina rato Caltag 1/80
Anti-F4-80 rato Serotec 1/40
Anti-Mac-1.biotina rato Pharmingen 1/30
Anticorpos monoclonais Origem Fonte Diluio

32
3.5 Histomorfometria
Nas lminas com colorao para Picrosrius foi realizada a quantificao do
percentual de rea de depsito de colgeno por rea de leso com o programa
Analisys (Soft Image System, Alemanha). Foram escolhidos 3 campos
aleatrios em cada anlise.

3.6 Citometria de fluxo
Os linfonodos braquiais e axilares dos camundongos controles, sham e
inoculados foram cuidadosamente retirados e dissociados com o auxlio de
pinas finas e tamiz de nylon em meio de cultivo RPMI 1640 (Sigma Chem.
Co., EUA) contendo 2% de soro bovino fetal (Cultilab, So Paulo, Brasil). Aps
a determinao da celularidade atravs de contagem em cmara de Neubauer,
10
6
clulas foram incubadas com PBS contendo 10% de soro normal de
camundongo e 2% de soro bovino fetal durante 10 minutos para evitar ligaes
no especficas. A tripla marcao foi feita pela incubao das clulas com os
anticorpos monoclonais na diluio apropriada previamente determinada
(Tabela 2) durante 20 minutos a 4C. As clulas foram ento lavadas duas
vezes em PBS contendo 2% de soro bovino fetal, recolhidas em tubos e
fixadas em PBS contendo formol 1% e azida sdica 0,05% e analisadas num
FACScalibur (Becton Dicknson, San Diego , EUA). A regio de clulas vivas
foi determinada usando os parmetros de foward versus side scatter e foram
coletados 10000 eventos em cada amostra. Para a anlise dos dados foi
utilizado o software Winiwind verso 2,8 (Scion Corporation, EUA).

33


Tabela 2: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na citometria de fluxo.
Anticorpos monoclonais Fluorocromo Fonte Diluio
Anti-CD3 Fitc Pharmingen 1/300
Anti-B220 Fitc Pharmingen 1/400
Anti-CD4 Pe Pharmingen 1/300
Anti-CD8 Spectral red Southern 1/600
Anti-CD25 Fitc Sigma 1/5
Anti-CD62L Fitc Pharmingen 1/100
Anti-CD44 Fitc Pharmingen 1/50

3.7 RT-PCR
3.7.1 Extrao de RNA total
O RNA total foi isolado pelo mtodo de TRIzol Reagent (Invitrogen,
CA, EUA). Os msculos foram homogeneizados na proporo de 50mg de
tecido para 1000l de Trizol e centrifugados a 12.000 xg por 10 minutos a 4C
para remover o fragmento de tecido no dissolvido. Os sobrenadantes foram
congelados a -20C at o momento de uso. Aps serem descongelados, foi
adicionado 200l de uma soluo de clorofrmio/ lcool isoamlico na
proporo 24:1 (v:v) seguindo-se nova homogeneizao. Aps 10 minutos no
gelo, a mistura foi centrifugada a 12.000 xg por 15 minutos a 4C. A fase
aquosa foi coletada e transferida para outro tubo contendo o mesmo volume de
isopropanol (Merck do Brasil). As solues foram agitadas at a
homogeneizao, armazenadas a -20C por no mnimo 3 0 minutos e
34
centrifugadas novamente a 14.000 xg por 20 minutos a 4C. O pellet foi lavado
com 600l de etanol gelado a 70% e submetido nova centrifugao de 14.000
xg por 15 minutos a 4C. O RNA foi dissolvido em 15 l de H
2
O livre de RNAse
e estocado a -70C.

3.7.2 Eletroforese de RNA
Aps a extrao do RNA total, a sua integridade foi verificada em gel
desnaturante de agarose-formaldedo 1,2%. A amostra de RNA (5l) foi diluda
em 10l de formamida (Merck do Brasil), 4l de tampo MOPS 5X (Invitrogen,
Brasil), 1,3l de 37% formaldedo (Merck do Brasil), 1l de (1l/ml) brometo de
etdio (Sigma Chem. Co., EUA) e 1l de azul de bromofenol (Merck do Brasil),
seguido de incubao por 10 minutos a 65C. A mistu ra foi mantida no gelo at
sua aplicao no gel. A corrida de eletroforese foi feita a 75V por 1 hora em
cuba horizontal (Kodak, EUA). A integridade do RNA foi avaliada no
transiluminador de luz ultravioleta observando-se a integridade das bandas de
RNA ribossomal de 17 e 28S. A pureza e a concentrao do RNA extrado foi
determinada atravs de leitura em espectrofotmetro em comprimento de onda
260 e 280nm. Considerando-se que 1 unidade de DO
260
equivale a 40 g/mL
de RNA, foi realizado o clculo da razo entre a DO em 260 e 280nm para
estimar o grau de pureza do RNA total. Somente foi utilizado RNA com a razo
entre 1,6 e 2,0.

35
3.7.3 Transcrio reversa do RNA e PCR
Foi utilizado o kit SuperScrip One-Step com Platinum Taq (Gibco-BRL
Life Tecnologies, NY, EUA), onde se realiza a produo do cDNA e o PCR
concomitantemente. Em um tubo contendo 1g de RNA foi adicionado 25 l do
Mix de reao 2x, 0,4 l de MgSO
4
a 50 mM, 1 l da seqncia de
oligonucleotdeos (primer) sense, 1 l do primer anti-sense, 1 l de
RT/Platinum Taq Mix e completado o volume para 50 l de gua livre de
RNAse (RF). As amostras foram colocadas no termociclador (Amersham,
Inglaterra) a 50C por 30min para sntese do cDNA e a 94C por 2 min para
ativao da Taq e desnaturao do RNA/ cDNA. As amplificaes foram
realizadas em 30 ciclos: desnaturao 94C por 15 s , anelamento 60C por 30s
e sntese em 72C por 3 min. A extenso final foi f eita em 1 ciclo a 72C por 10
min. As amostras foram analisadas em gel de agarose 1,7% contendo 1 g/ml
de brometo de etdio e visualizadas no transiluminador, e o resultado expresso
como razo TGF-/gene constitutivo GAPDH.

. Tabela 3: Lista de oligonucleotdeos:
Sense Antisense
TGF- CAAGGAGACGGAATACAGGGCT CGCACACAGCAGTTCTTCTCTGT
GAPDH GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA TGTTAGTGGGGTCTCGCTCCTG


36
3.8 Zimografia
3.8.1 Preparo do extrato tecidual
Os msculos inoculados e controles foram coletados e imediatamente
congelados e preservados em nitrognio lquido (-165
o
C). Os msculos foram
pesados e homogeneizados (1/10, p/v) em tampo de extrao (100 mM Tris-
HCl, pH 7,6, 200mM NaCl, 100mM CaCl
2
e 1% Triton X-100) 4
o
C. Aps a
centrifugao (15.000 xg), o sobrenadante foi dividido em alquotas de 100 l, e
a concentrao protica determinada utilizando-se uma curva padro de
albumina pelo mtodo de Lowry (Lowry et al., 1951). A mesma quantidade de
protena total foi usada para zimografia (60 g/poo).

3.8.2 Gel para zimografia
As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente
descrito (Heussen & Dowdle, 1980) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a
7,5% contendo gelatina do tipo A de pele suna (Sigma Chem. Co, St. Louis,
Mo. EUA) na concentrao de 2 mg/mL e os gis de entrada poliacrilamida 5%
(w/v). A eletroforese foi realizada com a concentrao de 60g de protena para
cada uma das amostras aplicadas nos gis a 165 Volts por um tempo mdio de
60 minutos (Power Pac 200 Bio-Rad, EUA). Aps a eletroforese os gis
foram lavados duas vezes em 2.5% Triton X-100 para total remoo do SDS
seguido de incubao a 37C em tampo contendo o substrato (10 mM Tris
HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl
2
, ZnCl
2
1M ) por 24 horas. SDS o agente
responsvel pela ativao das metaloproteases mesmo na forma inativa sem
clivagem proteoltica (Talhouk et al., 1991). Os gis foram corados pelo
37
Coomassie blue R250 (Sigma Chem. Co, EUA) e descorados em soluo
descorante contendo 50% metanol, 10% cido actico e 40% qsp de H
2
O. A
atividade da gelatinase foi visualizada por bandas no marcadas em um fundo
azul representando reas de protelise no substrato de protena. As
metaloproteases so secretadas na forma latente e necessitam da clivagem do
terminal peptdico NH
2
para ativao. A anlise semiquantitativa foi feita
usando o programa de anlise de imagem (Scion Program National Institutes of
Health, Image Program, EUA).

3.9 Anlise estatstica
Microsoft Excel software (Microsoft, EUA) foi usado para calcular
mdias e desvios padres. O teste t de Students foi aplicado para acessar o
nvel de significncia estatstica das amostras.



38
4. RESULTADOS


4.1 Anlise histolgica da leso muscular

Os animais foram sacrificados 4, 8 e 12 dias aps inoculao (dpi) de
bupivacana. Os msculos Triceps brachii foram processados e emblocados
em parafina, posteriormente foram feitos cortes de 5 m de espessura no
micrtomo manual. Como coloraes de estudo foram escolhidas o H-E pois
permite evidenciar mais claramente a citoarquitetura e a nucleao da
miofibra, e o Giemsa por evidenciar mais claramente as miofibras
regenerando e o infiltrado inflamatrio. Para cada grupo foram utilizados no
mnimo 3 animais.
A anlise histolgica do msculo esqueltico dos camundongos
BALB/c sacrificados no quarto dia aps a inoculao (4dpi), mostrou
grandes reas de leso com predomnio de clulas mononucleares no
infiltrado inflamatrio, mionecrose e perda da citoarquitetura normal da
miofibra (Figura 10D). Os camundongos C57BL6 apresentaram infiltrado
inflamatrio mais intenso e menor alterao da citoarquitetura (Figura 10A).
Pela colorao de Giemsa, podemos observar um grande nmero de
miofibras regenerando evidenciadas pelo citoplasma basoflico e nucleao
central principalmente nos camundongos C57BL6. Inclusive, pode-se
evidenciar nestes animais mioblastos se fusionando para formao de
novas miofibras (Figura 11A). Em 8 dpi (Figura 10E e 11E) camundongos
BALB/c apresentaram miofibras regenerando mas ainda com reas de
infiltrado inflamatrio intenso, contudo em camundongos C57BL6 era
39
restrito. Em 12 dpi ambas as linhagens de camundongos apresentaram
miofibras regenerando com nucleao central (Figura 10C, 10F, 11C, 11F).

40




Figura 10 : Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas linhagens de
camundongo
Painel com fotomicrografias da leso muscular corada por H-E em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F)
dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F).
Infiltrado inflamatrio (seta), clulas musculares regenerando (setas largas). dpi (dias aps
inoculao)

A
Balb/c B6
4 dpi
8 dpi
12 dpi
D
B
C
A
E
F
0,05mm
0,1mm
0,1mm 0,1mm
0,1mm
0,05mm
41





Figura 11 : Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo Giemsa
Fotomicrografias da leso muscular em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F) dias aps inoculao de
bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F). Infiltrado inflamatrio
(seta fina), clulas musculares regenerando (asterisco). Setas grossas indicam mioblastos com
citoplasma basoflico circundando fibras musculares.
BALB/c
B6
4 dpi
8 dpi
12 dpi
0,05mm
D
B
C
0,05mm
*
A
E
F
*
*
*
0,1mm
0,1mm
0,1mm
*
*
*
*
0,1mm
42
4.2 Alteraes no microambiente da leso muscular
4.2.1 Colorao de picrosrius

Confirmadas as diferenas entre as leses musculares nas diferentes
linhagens passamos para um estudo mais minucioso das alteraes
observadas. Esse estudo essencial para sabermos os possveis
mecanismos contribuindo para regenerao muscular. O primeiro fator
abordado foi alterao do microambiente quanto produo de colgeno.
Este componente da matriz extracelular exerce papel importante durante o
processo de reparo, influenciando na migrao de leuccitos e no curso da
regenerao, para uma resoluo cicatricial ou mais fisiolgica. Para
visualizao do colgeno escolhemos a colorao de picrosirius que marca
em vermelho as fibras colgenas.
A leso muscular em 1dpi com bupivacana mostrou uma expresso
discreta de colgeno entre as fibras musculares tanto na linhagem C57BL6
(Figura 12A) como BALB/c (Figura 12E), porm intenso depsito de
colgeno prximo aos vasos no camundongo BALB/c (Figura 12E). Aps 4
dias de inoculao com bupivacana essa diferena era bem evidente.
Enquanto os camundongos C57BL6 (Figura 12B) apresentavam maior
regenerao, com vrias fibras com nucleao central e discreta deposio
de colgeno, os camundongos BALB/c (Figura 12F) apresentavam grandes
reas com mionecrose e aumento na deposio de colgeno em relao ao
ponto anterior.
43
Em 8 (Figuras 12C e G) e 12 dpi (Figuras 12D e 12H) no foi
encontrada diferena na expresso de colgeno entre as miofibras em duas
linhagens
A quantificao do colgeno utilizado o programa Analysis foi realizada
somente dentro das reas de leso, evitando quantificar vasos e as fcias
musculares. Os resultados apresentados na figura 13 mostram que em 1 dpi
no existe diferena na mdia da expresso de colgeno. Contudo, 4dpi aps
inoculao (Figura 13B) foi observado que o percentual da rea de leso
ocupada por colgeno no BALB/c era 5,2 vezes maior do que no camundongo
C57BL6 (p<0,05).
44

BALB/c
B6
1 dpi
4 dpi
8 dpi
B
A E
F
C
D H
G
12 dpi
0,1mm
0,1mm
0,1mm 0,1mm
0,1mm
0,1mm
0,1mm
0,1mm
45

Figura 12- Colorao de picrosrius da leso muscular
Fotomicrografias de Trceps brachii coradas com picrosrius em 1 (A, E), 4 (B, F), 8 (C, G) e 12
(D, H) dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C, D) e BALB/c
(E, F, G, H). As setas indicam expresso de colgeno na leso e em torno dos vasos prximos
a rea de leso. Barra = 0,1 mm; dpi: dias aps inoculao.



























46

















Figura 13: Histomorfometria da rea da leso ocupada por colgeno.
Representao grfica da quantificao de colgeno pelo programa Analysis na leso em 1 dpi
(A) e 4 dpi (B). As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram
includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo
* p < 0,05.





0
2
4
6
8
10
12
C57BL/06 BALB/C
*
A
B
%

r
e
a

0
2
4
6
8
10
12
C57BL/06 BALB/C
47
4.2.2 Atividade de metaloproteases no msculo lesionado

Utilizamos a tcnica de zimografia a fim de investigar a atividade da
MMP-9 (100 kDa), pr-pr-MMP-2 (66 kDa), pro-MMP-2 (60 kDa) e a forma
ativa da MMP-2 (55kDa). Foram coletados os msculos Triceps brachii
inoculados com bupivacana de camundongos C57BL6, C57BL10 e Balb/c
aps 1, 4 e 12 dpi. Semelhantemente ao encontrado anteriormente (Kheriff,
1999), os animais controles de ambas as linhagens apresentaram atividade
da pr-pr MMP-2 (MMP-2PP) e da pr-MMP-2 e nenhuma atividade da
MMP-9. A forma ativa da MMP-2 no foi encontrada nas amostras de
msculo dos animais controles e inoculados com bupivacana, mas foi
evidenciada em amostras de msculo de camundongo distrfico mdx
utilizado como controle positivo (Figura 14A).
A atividade da MMP-9, normalmente associada com processo
inflamatrio, somente foi evidenciada nas leses musculares em 1 dpi (figura
14). Quando a atividade da MMP-9 foi comparada entre as linhagens
verificou-se que C57BL10 apresentava um aumento de 3,8 vezes em relao
ao BALB/c. A linhagem C57BL6 tambm apresentou nveis mais altos (2,5
vezes) que o BALB/c, porm esta diferena no foi significativa (figura 15A).
A anlise da atividade da pro-MMP2 mostrou atividade prxima a
encontrada no grupo controle e sem diferena significativa entre as linhagens
em 1 dpi, apesar de ser encontrado nveis mais altos no camundongo
C57BL10. Aps 4 dias de inoculao da bupivacana, foi evidenciada maior
atividade da MMP-2 pro em todas as linhagens em relao a 1 dpi, apesar da
forma ativa no ter sido detectada (figura 15B). O estudo comparativo entre
48
as linhagens mostrou que os camundongos BALB/c apresentavam atividade
1,1 vez menor que C57BL10. Entretanto foi observada uma diferena
significativa entre as duas linhagens de C57, onde C57BL6 apresentava 1,6
vezes (p<0.05) menos pr-MMP-2. Aps 12 dias de induzida a leso
muscular, os nveis da pr-MMP2 diminuram aproximando dos valores do
camundongo controle. Entretanto os camundongos C57BL10 e C57BL6
mantiveram nveis mais altos quando comparados com o BALB/c, apesar
desta diferena no ser estatisticamente significativa (figura 15C).

49













Figura 14- Atividade de metaloproteases no msculo esqueltico.
Zimografia de msculo esqueltico de camundongos controles e aps 1 (A), 4 (B) e 12 (C) dias
aps inoculao de bupivacana. B6 = C57BL6, B10 = C57BL10, BA = BALB/c, c = controle, i=
inoculado com bupivacana, mdx = camundongo distrfico.







C
MMP-2 PP
MMP-2 Pro
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
B6i B6i B6i B6 i B10i B10i B10i BAi BAi
Vaso


100 kDa




66 kDa
60 kDa
66 kDa
60 kDa
B6c B6i B10i B10i B10i BAi BAi BAc mdx
100 kDa
A
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
MMP 2 ativa
MMP-9
100 kDa
66 kDa
60 kDa
B BAi BAi BAi BAi B10i B10i B10i B10i B6i B6i
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
50




























Figura 15: Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esqueltico
Representao grfica da quantificao da atividade das MMPs pelo programa Scion em 1 (A),
4 (B) e 12 (C) dias aps inoculao de bupivacana. As barras representam a mdia e seu
respectivo desvio padro. Coluna vinho (C57BL6), amarela (C57BL10) e lils (BALB/c). Foram
includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo
significativo valores * p < 0,05. UA = unidade arbitrria.

0
10000
20000
30000
40000
B6 B10 Ba
MMP-2 pro
A
C
0
10000
20000
30000
40000
B6 B10 BALB/c
MMP-2 pro
*
B
0
10000
20000
30000
40000
MMP9
0
10000
20000
30000
40000
MMP2pro
MMP-9 MMP-2 pro
* *
UA
UA
UA
51
4.3 Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio


As clulas presentes no infiltrado inflamatrio foram caracterizadas pela
tcnica de imuno-histoqumica. Utilizamos anticorpos monoclonais especficos
para Mac-1 para evidenciar clulas mononucleares, F4-80 para macrfagos,
CD4 e CD8 para os linfcitos T. Foram coletados os msculos Triceps brachii
de camundongos C57BL6 e BALB/c inoculado com bupivacana em 4 dpi por
ser o ponto de maior infiltrado inflamatrio. Foram realizados cortes de 5m de
espessura de msculos congelados e emblocados em substncia
criopreservante OCT.
Em 4 dias ps-inoculao no encontramos diferenas quanto aos tipos
celulares presentes no infiltrado inflamatrio entre as linhagens estudadas
(Figura 16). A grande maioria das clulas presentes no infiltrado inflamatrio
expressou intensa marcao para Mac-1, um timo marcador de inflamao,
expresso em nveis variados em vrios tipos celulares como: macrfagos,
neutrfilos e clulas dendrticas (Flotte et al, 1983, Springer et al, 1979). A
marcao foi muito similar quando utilizamos o anticorpo F4-80 que
especfico para macrfagos. Isto indica que macrfagos representam a maioria
das clulas do infiltrado inflamatrio nestes animais. Camundongos BALB/c
apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que
os camundongos C57BL6 (figura 16). Em contrapartida no observamos uma
marcao expressiva para linfcitos T, tanto CD4+ quanto CD8+. Um dado j
esperado porque esta uma fase inicial e possivelmente essas clulas ainda
no foram ativadas.

52

Figura 16: Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatrio da leso muscular induzida
por bupivacana.
Imuno-histoqumica para os antgenos Mac-1, F4-80, CD4 e CD8 na leso muscular nos
camundongos C57BL6 (A) e BALB/c (B). As setas evidenciam as clulas com imunomarcao
positiva.



Mac-1
CD4
F4-80
Mac-1 F4-80
CD8
CD4 CD8
0,1mm
0,05mm 0,05mm
0,1mm
0,05mm 0,05mm
A
B
0,1mm 0,1mm
53
4.4 Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem


Nesta etapa decidimos investigar se mesmo em um perodo inicial da
leso muscular ocorreria alguma interferncia nos rgos linfides de
drenagem muscular. Para isso coletamos os linfonodos axilar e braquial que
fazem a drenagem do msculo Triceps brachii inoculado com bupivacana e
realizamos pela tcnica de citometria de fluxo, a marcao para linfcitos B
(B220), linfcitos T CD4+ e linfcitos T CD8+. Alm disto analisamos a
expresso dos antgenos CD62L, CD44 e CD25 nas subpopulaes de
linfcitos T.
Os camundongos C57BL6 apresentaram celularidade significativamente
maior que os camundongos C57BL10 e BALB/c (p<0,001 e 0,05
respectivamente). Entretanto os animais BALB/c foram os nicos que
apresentaram um aumento (1,9 vezes) significativo (p<0,05) entre os grupos
sham e inoculados (Figura 17).
Com a finalidade de quantificar os subtipos de linfcitos T e B utilizamos
a marcao com anticorpos especficos para B220 e CD3 respectivamente
(Figura 18A). No observamos diferena significativa no percentual de clulas
marcadas entre os camundongos controle, sham e inoculados. Os
camundongos BALB/c foram os nicos que apresentaram um aumento
significativo do nmero absoluto de clulas B220+ e CD3+ talvez devido a
maior celuraridade do linfonodo .





54






Figura 17: Celularidade dos linfonodos axilar e braquial
As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por
linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05, **p<0,001.

Sham Bupivacana
0
10
20
30
40
50
BALB/c B6 B10
n
o

d
e

c

l
u
l
a
s

x

1
0
6
**
*
*
*
Controle
55































Figura 18: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes nos
linfonodos de drenagem em 4 dpi.
Em A mostramos um histograma com perfil representativo da marcao para B220 e CD3 num
camundongo C57BL6 inoculado com bupivacana.
Os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de B220 e CD3 so mostrados
nos painis B e C respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio
padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de
Student sendo * p < 0,05.


CD3
0
25
50
75
100
BALB/c B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
B220
0
25
50
75
100
BALB/c B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
B220
0
5
10
15
20
25
30
BALB/c B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
CD3
0
5
10
15
20
25
30
BALB/c B6 B10
*
*
Bupivacana Sham
A
Controle
B
C
56


Camundongos BALB/c inoculados com bupivacana (Figura 19B)
apresentaram aumento significativo (p<0,05) do percentual de linfcitos T
CD4+. Camundongos sham inoculados tambm apresentaram um aumento no
nmero relativo de linfcitos T CD4+. No foi observada diferena significativa
no nmero percentual de linfcitos T CD8+ entre o grupo dos animais
inoculados e no inoculados em ambas as linhagens estudadas.

Dentre os subtipos de linfcitos T CD4+ verificamos quais deles seriam
CD62L+, CD44+ e CD25+ (Figuras 20 e 21). O antgeno CD62 uma L-
selectina, presente principalmente em clulas virgens, CD25 um receptor de
alta afinidade de IL-2 e marcador de clulas ativadas e/ou regulatrias e CD44
receptor de cido araquidnico, um dos marcadores de clulas de memria.
No foi encontrada diferena significativa nos percentuais das clulas CD62L+
entre os grupos controle e inoculados (Figura 21). Entretanto o nmero
absoluto de CD62L+ foi 1,4 vezes maior nos camundongos BALB/c inoculados
com bupivacana do que no controle no inoculado sugerindo um maior influxo
de clulas virgens para o linfonodo dos camundongos BALB/c (Figura 21). Foi
observado uma diminuio significativa (p<0,05) nos nmeros relativos nas
subpopulaes de clulas CD44+ e CD25+ entre os grupos inoculados e no
inoculados da linhagem BALB/c (Figura 21). Com relao s clulas CD8+ os
nicos resultados que apresentaram um aumento significativo (p<0,05) foram
para os linfcitos T CD8+CD62L+ dos camundongos BALB/c inoculados em
relao ao grupo sham (Figuras 22 e 23).


57






















Figura 19: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos T presentes nos
linfonodos de drenagem em 4 dpi.
A- mostra um perfil representativo da marcao para CD4 e CD8 dentro da populao total no
camundongo BALB/c inoculado (i) e controle no inoculado (c)
Em B e C mostramos os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de CD4 e CD8
respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3
animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As
colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e em amarelo os
animais inoculados com bupivacana.
CD4
0
20
40
60
80
100
BALB B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
CD8
0
20
40
60
80
100
BALB B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
A
*
CD4
0
5
10
15
20
BALB B6 B10
n

d
e

c

l
s

x

1
0
6
CD8
0
5
10
15
20
BALB B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
B
C
*
58



















Figura 20: Perfis representativos da expresso de CD44 (A), CD25 (B) e CD62L (C)
nas clulas T CD4+ de camundongos BALB/c.
C= controle no inoculado I = inoculado
B
C
A
59



Figura 21: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L,
CD44 e CD25 nas clulas CD4+.
So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44
(B) e CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram
includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de
Student sendo * p < 0,05. As colunas azuis representam os animais controles, vinho
os animais sham inoculados e as amarelas os animais inoculados com bupivacana.
ND = no determinado.

CD44
0
10
20
30
40
Balb B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
CD25
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
CD62
0
10
20
30
40
Balb B6 B10
c
e
l
s

x

1
0
6
CD25
0
2
4
6
8
10
Balb B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
*
*
CD62
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
CD44
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
60





Figura 22: Perfis representativos da expresso de CD62L, CD44 e CD25 nas
clulas T CD8+ de camundongos C57BL6.
C= controle no inoculado I = inoculado
A
B
C
61








































Figura 23: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L, CD44 e
CD25 nas clulas CD8+.
So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44 (B) e
CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3
animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05.
As colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e as
amarelas os animais inoculados com bupivacana. ND = no determinado.

CD62
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e

n
t
u
a
l
CD62
0
10
20
30
40
Balb B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
CD44
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
CD44
0
10
20
30
40
Balb B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
6
CD25
0
25
50
75
100
Balb B6 B10
p
e
r
c
e
n
t
u
a
l
CD25
0
10
20
30
40
Balb B6 B10
n

c

l
s

x

1
0
-
6
62

4.5 Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico


Devido s alteraes com relao a expresso de colgeno entre as
linhagens resolvemos verificar a expresso de TGF- pelo seu importante
papel durante a fase de inflamao e reparo. Para isso coletamos com 1 dia
aps inoculao com bupivacana os msculos Triceps brachii de
camundongos das linhagens C57BL6 e BALB/c. Cada grupo foi formado por no
mnimo trs animais. A expresso do RNAm para TGF- foi detectada por RT-
PCR e sua expresso foi calculada em relao expresso de protena
constitutiva GAPDH.
Nossos resultados mostraram que em 1 dpi os camundongos C57BL10
e C57BL6 apresentaram expresso de RNAm para TGF- similar aos
camundongos controles (figura 24). Com a quantificao (Figura 24C)
observamos que os camundongos BALB/c, de perfil Th2 apresentavam uma
expresso muito maior (2 vezes em relao ao controle pareado) aps a
inoculao de bupivacana. Em 4 dpi, no encontramos a presena de RNAm
para TGF- (Figura 24B).






63





































Figura 24: Expresso de RNA mensageiro para TGF- no msculo esqueltico.
Na poro superior mostrado um gel representativo da expresso de RNAm para TGF- (T) e
para o gene constitutivo GAPDH (G) no msculo esqueltico aps 1 (A) e 4 (B) dias da
inoculao da bupivacana. TGF- = 260bp e GAPDH = 245bp.
Em C, grfico representativo da razo da expresso de TGF-/GAPDH nos msculos
inoculados com bupivacana e nos msculos controles no inoculados. As barras representam
a mdia de trs animais e seu respectivo desvio padro.

200bp
G T G T G T


B6 B10 BALB/c
200bp
G T G T G T
A
B
TGF-b
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
B6 B10 BALB/c
R
a
z
a
o

T
G
F
/
G
A
P
D
H
controle inoculado
C
G T G T
200bp
B6 BALB/c
64

5. DISCUSSO

O reparo tecidual orquestrado por uma seqncia de eventos bioqumicos e
celulares organizados de forma a restaurar a integridade tecidual aps a leso.
A participao do sistema imune no reparo de feridas tem sido questionada
pela seqncia de migrao de neutrfilos, macrfagos e linfcitos (Park &
Barbul, 2004). O estudo em camundongos imunodeficientes tem mostrado que
a participao dos componentes do sistema imune vai alm da proteo dos
tecidos lesionados contra possveis infeces, reforando sua participao na
manuteno e reparo pela secreo de citocinas e fatores de crescimento
(Park & Barbul, 2004; Gawronska-Kozak et al., 2006). Este trabalho teve como
objetivo estudar a leso muscular induzida pela bupivacana em camundongos
apresentando padro divergente (Th1, Th2) de produo de citocinas. O
modelo de leso muscular induzida pela bupivacana muito utilizado para se
estudar as diferentes fases do reparo muscular, porque a leso autolimitada e
permite a regenerao do tecido muscular (Sandri, 2001; Charge & Rudnicki,
2004).
A imunidade inata no especfica um mecanismo imediato importante
caracterizado pela participao de leuccitos (tais como neutrfilos,
macrfagos, moncitos, plaquetas) e seus mediadores. A resposta imune
adaptativa mais especfica e duradoura podendo ser classificada em perfil
Th1 e Th2, baseada na secreo de citocinas (Mosmann et al., 1986). Nas
clulas do tipo Th2 predominam as interleucinas 4, 5 e 13, que favorecem a
produo de anticorpos pelos linfcitos B e a sntese de colgeno pelos
65
fibroblastos. Em contrapartida as clulas do tipo Th1 secretam grandes
quantidades de interferon e ativam produo de citocinas com atividade pr-
inflamatria. Os dois tipos de resposta no agem isoladamente, o equilbrio na
produo das citocinas do tipo Th1 e Th2 influenciado pelo padro gentico
do indivduo e tambm pelo microambiente, de modo que alteraes nas
respostas Th1 e Th2 contribuem para a patognese de diversas infeces,
respostas alrgicas e doenas autoimunes (Wynn, 2004).
Camundongos C57BL6 e BALB/c, com padro gentico imune distinto
quanto produo de citocinas Th1 ou Th2, apresentam fentipo de resistncia
ou suscetibilidade infeco e uma cintica de remodelagem tecidual diferente
(Hsieh et al., 1995; Mills et al., 2000; Yu et al., 2006). Os linfcitos T dos
camundongos C57BL6 produzem preferencialmente citocinas do tipo Th1 com
mais interferon- e pouco interleucina 4 enquanto no BALB/c ocorre uma maior
produo de citocinas do perfil Th2 (Yu et al., 2006). Neste trabalho, na
colorao por HE e no Giemsa, as leses se apresentaram de forma distintas
entre as duas linhagens, sobretudo no quarto dia ps-inoculao.
Camundongos da linhagem BALB/c (padro Th2) apresentaram leses com
maior predomnio de mionecrose do que camundongos C57BL6 e C57BL10
(padro Th1). Fatores do microambiente poderiam estar protegendo da
necrose muscular intensa nos camundongos C57BL10, talvez devido
presena in situ de fatores trficos controlando tambm o estresse oxidativo.
Neste sentido foi relatado que um paciente com distrofia muscular de Becker e
artrite apresentava diminuio da enzima creatina quinase associada com o
aumento da produo de citocinas inflamatrias durante as crises de
agudizao da artrite (Maegaki et al., 1999). Em outros modelos de reparo
66
tecidual, como no sistema nervoso, tem sido mostrado que citocinas
produzidas por linfcitos so capazes de induzir proteo da degenerao
secundria de neurnios durante a fase do desenvolvimento e aps induo de
leso (Otten & Gadient, 1995; Schwartz & Moalem, 2001; Barouch & Schwartz,
2002). Uma outra possibilidade est relacionada ao fato que a capacidade de
gerar respostas Th1 ou Th2 no somente dependente de linfcitos T (Mills et
al., 2000). Neste sentido, foi visto que aps estimulo com LPS, macrfagos dos
camundongos C57BL6 produzem maiores nveis de TNF- e interleucina 12 do
que os de camundongos BALB/c. A maior produo de IL-12 aumenta os nveis
de IFN- e diminui a produo de IL-13 por linfcitos T CD4+. Alm disso,
macrfagos de C57BL6 produzem mais enzimas lisossomais e xido ntrico
(Watanabe et al., 2004).
A anlise das alteraes no microambiente mostrou que os
camundongos BALB/c apresentaram maior deposio de colgeno em todas as
fases analisadas. No quarto dia ps-inoculao, o percentual da rea de leso
ocupada por colgeno era 5,2 vezes maior no camundongo BALB/c em relao
ao camundongo C57BL6. A influncia do perfil de citocinas na induo de
fibrose evidente no modelo de leso heptica, onde camundongos BALB/c
com padro Th2 apresentam intensa fibrose ao contrrio dos camundongos
C57BL6 com padro tpico Th1, que apresentam menos fibrose. O
envolvimento das citocinas na induo de fibrose foi mostrado pelo tratamento
destes animais com anticorpos neutralizantes para IL-4 ou com IFN- exgeno
resultando na atenuao da fibrose (Shi et al., 1997). Recentemente, foi
mostrado que a remodelagem do msculo cardaco em resposta a hipertenso
67
tambm est relacionado com camundongos predispostos ao padro Th1 ou
Th2 (Yu et al., 2006).
Os principais produtores de componentes estruturais da matriz
extracelular so os fibroblastos, atualmente reconhecidos como os maiores
reguladores da inflamao. Existem trs mecanismos principais envolvidos no
controle da atividade local dos fibroblastos durante a inflamao e
regenerao. As citocinas produzidas pelos subtipos de linfcito Th auxiliar
tambm podem ser sintetizadas por fibroblastos, macrfagos e mastcitos no
stio da leso. Os prprios fibroblastos so alvo de vrios fatores e a natureza
das citocinas vai definir a proporo entre reparo e fibrose. As citocinas do tipo
Th1 geralmente promovem regenerao normal do tecido enquanto as do tipo
Th2 levam a ativao de fibroblastos, produo de colgeno e fibrose (Mescher
& Neff, 2005). Dentre as citocinas secretadas durante a resposta do tipo Th2 as
IL-4, IL-13 e o TGF- so as maiores responsveis pela fibrognese (Wynn,
2004). As alteraes no microambiente da leso muscular nas linhagens
C57BL6 e BALB/c foram condizentes com o perfil de citocinas produzidos por
estas linhagens bem como pela expresso duas vezes maior de RNAm para
TGF- nos camundongos BALB/c. A atividade de TGF-1 tambm pode ser
regulada pela liberao de TGF ativo da forma latente por vrios fatores como:
plasminognio, trombospondina e metaloproteases (Wynn, 2004). Sabendo-se
que o TGF- inibe a diferenciao das clulas miognicas, acelera a deposio
e sntese da matriz extracelular (ECM) e inibe a degradao da mesma (Li et
al., 2004; Tidball, 2005), podemos sugerir que TGF- possua participao
fundamental nas alteraes observadas nos camundongos BALB/c. TGF-1
68
est aumentado em vrios tecidos lesionados sendo liberado principalmente
por linfcitos, clulas do parnquima local e miofibroblastos (Li et al., 2004).
A remodelagem da ECM durante a degenerao e regenerao do
msculo esqueltico sugere uma alta regulao da atividade de degradao da
matriz durante a regenerao muscular (Carmeli et al., 2004). Nos
camundongos C57BL10 com leso muscular induzida por cardiotoxina, a MMP-
9 est muito aumentada durante os primeiros trs dias aps a inoculao,
correspondendo ao pico da inflamao, causada em parte pela presena de
macrfagos e neutrfilos (Kherif et al., 1999). As clulas satlites ativadas
presentes na periferia do stio de injria so outra possvel fonte de MMP-9
(Roach et al., 2002). Neste trabalho mostramos que na fase mais aguda da
inflamao, os camundongos com perfil Th1 (C57) apresentaram maior
expresso de MMP9, associada maior degradao de componentes da
matriz, facilitando o trnsito de componentes inflamatrios e limpeza dos
debris. Isto est condizente com o maior infiltrado inflamatrio e menor
deposio de colgeno evidenciado na histologia nos camundongos C57BL6 e
C57BL10. Aps o quarto dia da inoculao de bupivacana, os nveis de MMP-
9 diminuram e a pr-MMP-2 atingiu o auge de sua expresso, talvez pela
necessidade da degradao do colgeno tipo IV e outros componentes da
membrana basal e a estimulao de clulas satlites, via fatores de
crescimento que so liberados durante o processo (Kherif et al., 1999).
Camundongos mdx, modelo murino da distrofia muscular de Duchenne,
expressam nveis basais da MMP-9 de forma constante, e a MMP-2 est
regulada positivamente tanto na sua forma latente (60kDa) e ativa (55kDa). A
presena da forma ativa da MMP-2 sugere um desequilbrio entre a produo
69
demetaloprotease e seu inibidor (Kherif et al., 1999). A MMP-2 ativa no foi
encontrada no modelo de leso muscular por bupivacana possivelmente pelo
tamanho reduzido da leso.
A resposta inflamatria e imunolgica alm de ajudar na eliminao dos
tecidos danificados essencial para iniciar o reparo tecidual, inclusive
favorecendo o transplante de mioblastos (Shffer & Barbul, 1998; Sicard, 2002;
Henry & Garner, 2003; Prisk & Huard, 2003). Devido a isto, foram realizadas
marcaes por imuno-histoqumica para a caracterizao das clulas do
infiltrado inflamatrio. Em ambas as linhagens de camundongos estudadas a
presena de linfcitos T foi muito escassa na rea de leso muscular. A grande
maioria das clulas foram macrfagos, entretanto camundongos BALB/c
apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que
os camundongos C57BL6. A regenerao muscular mais lenta em animais
mais velhos coincidindo com a diminuio de clulas fagocticas e inflamatrias
como tambm em linhagens com menor proporo de fagocitose e remoo de
debris celulares (Tidball, 2005). Tratamento de cobaias com soro anti-
macrfagos e esterides para total retirada de moncitos circulantes causou
piora na cicatrizao (Park & Barbul, 2004). A resposta imune inata difere entre
linhagens de camundongos com resposta imune dominante Th1 e Th2.
Macrfagos de camundongos BALB/c apresentam menor atividade bactericida
e menor produo de citocinas como IL-12 em relao ao C57BL6 (Watanabe
et al., 2004).
O papel dos macrfagos durante a leso e a remodelagem complexo,
por serem ricas fontes de diversos fatores de crescimento e citocinas, grandes
produtores de espcies reativas de oxignio. Eles tambm so clulas
70
apresentadoras de antgenos por isso tambm regulam a resposta imune
celular. A depleo de macrfagos em camundongos distrficos mdx resulta
em uma diminuio de 80% na lise da membrana muscular in vivo (Tidball,
2005). A ablao de macrfagos e moncitos pela irradiao tambm prejudica
a regenerao muscular ps transplante de clulas miognicas. Macrfagos
fagocitam e removem debris tissulares e clulas mortas, inclusive neutrfilos
presentes inicialmente na leso, preparando o ambiente para a formao de
uma nova ECM. Ao mesmo tempo essas clulas tambm secretam citocinas
com atividade mitognica e angiognica promovendo o reparo do tecido. Meio
condicionado de macrfagos peritoneais induz proliferao de mioblasto in vitro
assim como a maior expresso de MyoD. Alm disto, xido ntrico (NO) pode
ser um importante regulador da inflamao e leso causada por clulas
inflamatrias, reduzindo a lise de clulas musculares, a concentrao de
superxido no meio e a expresso de molculas de adeso no endotlio
vascular (Mills et al., 2000).
Camundongos BALB/c apresentaram um aumento da celularidade nos
linfonodos de drenagem e um aumento do percentual de clulas T CD4+
expressando CD62L sugerindo aumento do influxo de clulas do tipo virgem,
possivelmente por maior ativao das HEV. Diferenas nas respostas
imunolgicas e inflamatrias entre reparo e regenerao parece direcionar o
curso da resoluo de uma injria tecidual. Linfcitos T, principalmente CD8+
esto associados com fibrose e formao de cicatriz hipertrfica (Castagnoli et
al., 1997; Morrison et al., 2000). Alm disso, camundongos nude,
independentemente do seu padro gentico, apresentam uma capacidade
71
aumentada de reparo com cicatrizes mais finas e quase indistinguveis dos
tecidos adjacentes (Gawronska-Kozak et al., 2006).

72
6. CONCLUSES

A compreenso dos processos regulatrios que medeiam a remodelagem
muscular pode contribuir para o surgimento de estratgias adequadas nas
leses musculares. Em conjunto este trabalho mostra que:

A induo de leso muscular pelo modelo da bupivacana causou nos
camundongos C57 com perfil de citocinas Th1 uma leso muscular com
predomnio de miofibras regenerando e macrfagos enquanto
camundongos BALB/c (perfil Th2) apresentaram reas extensas com
mionecrose.

Camundongos BALB/c apresentaram maior deposio de colgeno na
leso muscular associado com menor atividade de MMP-9 em relao aos
camundongos C57BL10 e C57BL6. A produo de RNAm para TGF-
tambm estava aumentada nos camundongos BALB/c sugerindo maior
induo de fibrose nestes animais.

Este trabalho mostra que camundongos com distinto padro imune de
citocinas Th1 e Th2 apresentam diferentes remodelagens do tecido
muscular esqueltico aps inoculao de bupivacana. Neste contexto,
camundongos C57BL6 e BALB/c so bons modelos respectivamente para o
estudo da regenerao e fibrose do msculo esqueltico.

73
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Askari, A. T., Unzek, S., Popovic, Z. B., Goldman, C. K., Forudi, F., Kiedrowski,
M., Rovner, A., Ellis, S. G., Thomas, J. D., DiCorleto, P. E., Topol, E. J. &
Penn, M. S. (2003). "Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell
homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy." Lancet
362(9385): 697-703.
Azouz, A., Razzaque, M. S., El-Hallak, M. & Taguchi, T. (2004).
"Immunoinflammatory responses and fibrogenesis." Med Electron
Microsc 37(3): 141-8.
Barbul, A., Sisto, D., Rettura, G., Levenson, S. M., Seifter, E. & Efron, G.
(1982). "Thymic inhibition of wound healing: abrogation by adult
thymectomy." J Surg Res 32(4): 338-42.
Barouch, R. & Schwartz, M. (2002). "Autoreactive T cells induce neurotrophin
production by immune and neural cells in injured rat optic nerve:
implications for protective autoimmunity." Faseb J 16(10): 1304-6.
Bassel-Duby, R. & Olson, E. N. (2006). "Signaling pathways in skeletal muscle
remodeling." Annu Rev Biochem 75: 19-37.
Buckingham, M. (2006). "Myogenic progenitor cells and skeletal myogenesis in
vertebrates." Curr Opin Genet Dev 16(5): 525-32.
74
Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S.,
Montarras, D., Rocancourt, D. & Relaix, F. (2003). "The formation of
skeletal muscle: from somite to limb." J Anat 202(1): 59-68.
Cardasis, C. A. & Cooper, G. W. (1975). "An analysis of nuclear numbers in
individual muscle fibers during differentiation and growth: a satellite cell-
muscle fiber growth unit." J Exp Zool 191(3): 347-58.
Carmeli, E., Moas, M., Reznick, A. Z. & Coleman, R. (2004). "Matrix
metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review." Muscle Nerve
29(2): 191-7.
Casadevall, A. & Pirofski, L. A. (2003). "Antibody-mediated regulation of
cellular immunity and the inflammatory response." Trends Immunol
24(9): 474-8.
Castagnoli, C., Trombotto, C., Ondei, S., Stella, M., Calcagni, M., Magliacani,
G. & Alasia, S. T. (1997). "Characterization of T-cell subsets infiltrating
post-burn hypertrophic scar tissues." Burns 23(7-8): 565-72.
Charge, S. B. & Rudnicki, M. A. (2004). "Cellular and molecular regulation of
muscle regeneration." Physiol Rev 84(1): 209-38.
Chen, J. C. & Goldhamer, D. J. (2003). "Skeletal muscle stem cells." Reprod
Biol Endocrinol 1: 101.
Christ, B. & Ordahl, C. P. (1995). "Early stages of chick somite development."
Anat Embryol (Berl) 191(5): 381-96.
75
Cornelison, D. D. W. & Wold, B. J. (1997). "Single-cell analysis of regulatory
gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle
satellite cells." Develop. Biol. 191: 270-283.
Cowin, A. J., Brosnan, M. P., Holmes, T. M. & Ferguson, M. W. (1998).
"Endogenous inflammatory response to dermal wound healing in the fetal
and adult mouse." Dev Dyn 212(3): 385-93.
De la Porte, S., Morin, S. & Koenig, J. (1999). "Characteristics of skeletal
muscle in mdx mutant mice." Int Rev Cytol 191: 99-148.
Ferrari, G., Cusella-De Angelis, G., Coletta, M., Paolucci, E., Stornaiuolo, A.,
Cossu, G. & mavilio, F. (1998). "Muscle regeneration by bone marrow-
derived myogenic progenitors." Science 279: 1528-1530.
Foster, W., Li, Y., Usas, A., Somogyi, G. & Huard, J. (2003). "Gamma
interferon as an antifibrosis agent in skeletal muscle." J Orthop Res
21(5): 798-804.
Gawronska-Kozak, B., Bogacki, M., Rim, J. S., Monroe, W. T. & Manuel, J. A.
(2006). "Scarless skin repair in immunodeficient mice." Wound Repair
Regen 14(3): 265-76.
Gillery, P., Serpier, H., Polette, M., Bellon, G., Clavel, C., Wegrowski, Y.,
Birembaut, P., Kalis, B., Cariou, R. & Maquart, F. X. (1992). "Gamma-
interferon inhibits extracellular matrix synthesis and remodeling in
collagen lattice cultures of normal and scleroderma skin fibroblasts." Eur
J Cell Biol 57(2): 244-53.
76
Goldman, S., Weiss, A., Eyali, V. & Shalev, E. (2003). "Differential activity of
the gelatinases (matrix metalloproteinases 2 and 9) in the fetal
membranes and decidua, associated with labour." Mol Hum Reprod 9(6):
367-73.
Granstein, R. D., Murphy, G. F., Margolis, R. J., Byrne, M. H. & Amento, E. P.
(1987). "Gamma-interferon inhibits collagen synthesis in vivo in the
mouse." J Clin Invest 79(4): 1254-8.
Hawke, T. J. & Garry, D. J. (2001). "Myogenic satellite cells: physiology to
molecular biology." J Appl Physiol 91(2): 534-51.
Henry, G. & Garner, W. L. (2003). "Inflammatory mediators in wound healing."
Surg Clin North Am 83(3): 483-507.
Hesse, M., Modolell, M., La Flamme, A. C., Schito, M., Fuentes, J. M., Cheever,
A. W., Pearce, E. J. & Wynn, T. A. (2001). "Differential regulation of
nitric oxide synthase-2 and arginase-1 by type 1/type 2 cytokines in vivo:
granulomatous pathology is shaped by the pattern of L-arginine
metabolism." J Immunol 167(11): 6533-44.
Heussen, C. & Dowdle, E. B. (1980). "Electrophoretic analysis of plasminogen
activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and
copolymerized substrates." Anal Biochem 102(1): 196-202.
Hsieh, C. S., Macatonia, S. E., O'Garra, A. & Murphy, K. M. (1995). "T cell
genetic background determines default T helper phenotype development
in vitro." J Exp Med 181(2): 713-21.
77
Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H. & Jarvinen, M.
(2005). "Muscle injuries: biology and treatment." Am J Sports Med 33(5):
745-64.
Johnson, B. J., Halstead, N., White, M. E., Hathaway, M. R., Dicostanzo, A. &
Dayton, W. R. (1998). "Activation state of muscle stellite cells isolated
from steers implanted with a combined trenbolone acetate and estradiol
implant." J. Anim. Sci. 76: 2779-2786.
Junqueira, L. C. & Carneiro, J. (2004). Histologia Bsica, Guanabara Koogan.
Kerr, J. B. (2000). Atlas de Histologia Funcional, Artes Mdicas.
Kherif, S., Lafuma, C., Dehaupas, M., Lachkar, S., Fournier, J. G., Verdiere-
Sahuque, M., Fardeau, M. & Alameddine, H. S. (1999). "Expression of
matrix metalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a
study in experimentally injured and mdx muscles." Dev Biol 205(1): 158-
70.
Kovacs, E. J. & DiPietro, L. A. (1994). "Fibrogenic cytokines and connective
tissue production." Faseb J 8(11): 854-61.
Lafreniere, J. F., Mills, P., Tremblay, J. P. & El Fahime, E. (2004). "Growth
factors improve the in vivo migration of human skeletal myoblasts by
modulating their endogenous proteolytic activity." Transplantation 77(11):
1741-7.
Lescaudron, L., Peltekian, E., Fontaine-Perus, J., Paulin, D., Zampieri, M.,
Garcia, L. & Parrish, E. (1999). "Blood borne macrophages are essential
78
for the triggering of muscle regeneration following muscle transplant."
Neuromuscul Disord 9(2): 72-80.
Li, M., Carpio, D. F., Zheng, Y., Bruzzo, P., Singh, V., Ouaaz, F., Medzhitov, R.
M. & Beg, A. A. (2001). "An essential role of the NF-kappa B/Toll-like
receptor pathway in induction of inflammatory and tissue-repair gene
expression by necrotic cells." J Immunol 166(12): 7128-35.
Li, Y., Foster, W., Deasy, B. M., Chan, Y., Prisk, V., Tang, Y., Cummins, J. &
Huard, J. (2004). "Transforming growth factor-beta1 induces the
differentiation of myogenic cells into fibrotic cells in injured skeletal
muscle: a key event in muscle fibrogenesis." Am J Pathol 164(3): 1007-
19.
Long, M. A., Corbel, S. Y. & Rossi, F. M. (2005). "Circulating myogenic
progenitors and muscle repair." Semin Cell Dev Biol 16(4-5): 632-40.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951). "Protein
measurement with the Folin phenol reagent." J Biol Chem 193(1): 265-
75.
Maegaki, Y., Ogura, K., Maeoka, Y. & Takeshita, K. (1999). "Normalization of
creatine kinase level during arthritis in a patient with Becker muscular
dystrophy." Neurology 52(1): 172-174.
Mauro, A. (1961). "Satellite cell of skeletal muscle fibers." J Biophys Biochem
Cytol 9: 493-5.
79
Meeson, A. P., Hawke, T. J., Graham, S., Jiang, N., Elterman, J., Hutcheson,
K., Dimaio, J. M., Gallardo, T. D. & Garry, D. J. (2004). "Cellular and
molecular regulation of skeletal muscle side population cells." Stem Cells
22(7): 1305-20.
Mescher, A. L. & Neff, A. W. (2005). "Regenerative capacity and the
developing immune system." Adv Biochem Eng Biotechnol 93: 39-66.
Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J. & Hill, A. M. (2000). "M-1/M-2
macrophages and the Th1/Th2 paradigm." J Immunol 164(12): 6166-73.
Morrison, J., Lu, Q. L., Pastoret, C., Partridge, T. & Bou-Guarious, G. (2000).
"T-cell-dependent fibrosis in the mdx dystrophic mouse." Lab. Invest.
80(6): 881-891.
Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A. & Coffman, R. L.
(1986). "Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according
to profiles of lymphokine activities and secreted proteins." J Immunol
136(7): 2348-57.
Muntoni, F., Fisher, I., Morgan, J. E. & Abraham, D. (2002). "Steroids in
Duchenne muscular dystrophy: from clinical trials to genomic research."
Neuromuscul Disord 12 Suppl 1: S162-5.
Musaro, A., Giacinti, C., Borsellino, G., Dobrowolny, G., Pelosi, L., Cairns, L.,
Ottolenghi, S., Cossu, G., Bernardi, G., Battistini, L., Molinaro, M. &
Rosenthal, N. (2004). "Stem cell-mediated muscle regeneration is
enhanced by local isoform of insulin-like growth factor 1." Proc Natl Acad
Sci U S A 101(5): 1206-10.
80
Mussuni, M. D., Favaro, D. & Carraro, U. (1987). "Maturation, dystrophic
changes and the continuous production of fibers in skeletal muscle
regeneration in the absence of nerve." J. NeuroPathol. And Exp. Neurol.
46(3): 315-331.
Nagase, H., Visse, R. & Murphy, G. (2006). "Structure and function of matrix
metalloproteinases and TIMPs." Cardiovasc Res 69(3): 562-73.
Nonaka, I., Takagi, A., Ishiura, S., Nakase, H. & Sugita, H. (1983).
"Pathophysiology of muscle fiber necrosis induced by bupivacaine
hydrochloride (Marcaine)." Acta Neuropathol (Berl) 60(3-4): 167-74.
Oliveira, V. R., El-Cheikh, M. C., Aguiar, A. M., Balduino, A., Pinho, M. F. B.,
Reis, F. L. & Borojevic, R. (2000). "Schistosoma mansoni egg-induced
hepatic granuloma in mice dificient for the interferon-gamma receptor
have altered population of macrophages, lymphocytes and connective
tissue cells." Microbes Infect. 2: 1817-1826.
Otten, U. & Gadient, R. A. (1995). "Neurotrophins and cytokines--
intermediaries between the immune and nervous systems." Int J Dev
Neurosci 13(3-4): 147-51.
Park, J. E. & Barbul, A. (2004). "Understanding the role of immune regulation in
wound healing." Am J Surg 187(5A): 11S-16S.
Parks, W. C., Wilson, C. L. & Lopez-Boado, Y. S. (2004). "Matrix
metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity."
Nat Rev Immunol 4(8): 617-29.
81
Peng, H. & Huard, J. (2004). "Muscle-derived stem cells for musculoskeletal
tissue regeneration and repair." Transpl Immunol 12(3-4): 311-9.
Pownall, M. E., Gustafsson, M. K. & Emerson, C. P., Jr. (2002). "Myogenic
regulatory factors and the specification of muscle progenitors in
vertebrate embryos." Annu Rev Cell Dev Biol 18: 747-83.
Prisk, V. & Huard, J. (2003). "Muscle injuries and repair: the role of
prostaglandins and inflammation." Histol Histopathol 18(4): 1243-56.
Relaix, F., Montarras, D., Zaffran, S., Gayraud-Morel, B., Rocancourt, D.,
Tajbakhsh, S., Mansouri, A., Cumano, A. & Buckingham, M. (2006).
"Pax3 and Pax7 have distinct and overlapping functions in adult muscle
progenitor cells." J Cell Biol 172(1): 91-102.
Roach, D. M., Fitridge, R. A., Laws, P. E., Millard, S. H., Varelias, A. & Cowled,
P. A. (2002). "Up-regulation of MMP-2 and MMP-9 leads to degradation
of type IV collagen during skeletal muscle reperfusion injury; protection
by the MMP inhibitor, doxycycline." Eur J Vasc Endovasc Surg 23(3):
260-9.
Rudnicki, M. A., Schnegelsberg, P. N., Stead, R. H., Braun, T., Arnold, H. H. &
Jaenisch, R. (1993). "MyoD or Myf-5 is required for the formation of
skeletal muscle." Cell 75(7): 1351-9.
Sabourin, L. A. & Rudnicki, M. A. (2000). "The molecular regulation of
myogenesis." Clin. Genet. 57: 16-25.
82
Sandler, N. G., Mentink-Kane, M. M., Cheever, A. W. & Wynn, T. A. (2003).
"Global gene expression profiles during acute pathogen-induced
pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and Th2
responses in tissue repair." J Immunol 171(7): 3655-67.
Sandri, M., Sandri, C., Brun, B., Giurisato, E., Cantini, M., Rossini, K., Destro,
C., Arslan, P., Carraro, U. (2001). "Inhibition of FasL sustains phagocytic
cells and delays
myogenesis in regenerating muscle fibers." J. Leuk. Biol. 69: 482-489.
Schwartz, M. & Moalem, G. (2001). "Beneficial immune activity after CNS
injury: prospects for vaccination." J Neuroimmunol 113(2): 185-92.
Scott, W., Stevens, J. & Binder-Macleod, S. A. (2001). "Human skeletal muscle
fiber type classifications." Phys Ther 81(11): 1810-6.
Shffer, M. & Barbul, A. (1998). "Lymphocyte function in wound healing and
following injury." British Journal of Surgery 85: 444-460.
Shi, X. & Garry, D. J. (2006). "Muscle stem cells in development, regeneration,
and disease." Genes Dev 20(13): 1692-708.
Shi, Z., Wakil, A. E. & Rockey, D. C. (1997). "Strain-specific differences in
mouse hepatic wound healing are mediated by divergent T helper
cytokine responses." Proc Natl Acad Sci U S A 94(20): 10663-8.
Sicard, R. E. (2002). "Differential inflammatory and immunological responses in
tissue regeneration and repair." Ann N Y Acad Sci 961: 368-71.
83
Sime, P. J. & O'Reilly, K. M. (2001). "Fibrosis of the lung and other tissues:
new concepts in pathogenesis and treatment." Clin Immunol 99(3): 308-
19.
Szalay, K., Razga, Z. & Duda, E. (1997). "TNF inhibits myogenesis and
downregulates the expression of myogenic regulatory factors myoD and
myogenin." Eur J Cell Biol 74(4): 391-8.
Talhouk, R. S., Chin, J. R., Unemori, E. N., Werb, Z. & Bissell, M. J. (1991).
"Proteinases of the mammary gland: developmental regulation in vivo
and vectorial secretion in culture." Development 112(2): 439-49.
Tidball, J. G. (2005). "Inflammatory processes in muscle injury and repair." Am
J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288(2): R345-53.
Warren, G. L., O'Farrell, L., Summan, M., Hulderman, T., Mishra, D., Luster, M.
I., Kuziel, W. A. & Simeonova, P. P. (2004). "Role of CC chemokines in
skeletal muscle functional restoration after injury." Am J Physiol Cell
Physiol 286(5): C1031-1036.
Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K. & Matsukawa, A. (2004). "Innate
immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains." Shock
22(5): 460-6.
Witte, M. B. & Barbul, A. (1997). "General principles of wound healing." Surg
Clin North Am 77(3): 509-28.
Witte, M. B. & Barbul, A. (2002). "Role of nitric oxide in wound repair." Am J
Surg 183(4): 406-12.
84
Wynn, T. A. (2004). "Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm." Nat Rev
Immunol 4(8): 583-94.
Yu, Q., Horak, K. & Larson, D. F. (2006). "Role of T lymphocytes in
hypertension-induced cardiac extracellular matrix remodeling."
Hypertension 48(1): 98-104.
Zammit, P. S., Partridge, T. A. & Yablonka-Reuveni, Z. (2006). "The skeletal
muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold." J
Histochem Cytochem 54(11): 1177-91.
Zink, W. & Graf, B. M. (2004). "Local anesthetic myotoxicity." Reg Anesth Pain
Med 29(4): 333-40.