Para fazer clulas competentes para eletroporao (XL1-Blue)

1 dia
1- Fazer 1,5 ml de tetraciclina 5mg/ml;
2- Fazer meio LB slido e adicionar tetraciclina (20ml de meio para 20l de tet) e
plaquear;
3- Plaquear a bactria XL1-bule e deixar crescer por 16 horas 37 oC;
OBS: Se for fazer outra cepa de E. Coli consultar se h resistncia cromossomal
2 dia
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Marcar o uso da centrfuga para o turno da tarde do 3o dia;

Marcar o fluxo de 13:00 s 17:00 para o 3o dia;
Fazer 50ml glicerol 10% e autoclavar (sero utilizados 22ml aprox.);
Autoclavar 2,5L de gua mili-Q em erlenmeyers de 2,0L;
Autoclavar tubos abertos (tampa separada do tubo) para uso na centrfuga;
Autoclavar uma proveta de 500ml e uma de 10ml;
Fazer 1L de meio LB com um quarto da quantidade de sal (2,5g), distribuir 250ml de
meio em 4 erlenmeyers de 1L e autoclavar;
11- Colocar os tubos de centrfuga, a gua, o glicerol 10% e as provetas na geladeira;
12- Palitar a colnia e adicionar o palito com a colnia em 10ml de meio LB+10l de
tetraciclina (5mg/ml ) em um tubo falcon de 50 ml e deixar crescer por 16 horas 37 oC,
em agitao de 180;
OBS: Se for fazer outra cepa de E. Coli consultar se h resistncia cromossomal
3 dia
13- Ligar a centrfuga para refrigerar e colocar o rotor uma hora antes de usar(s12:00);
14- Retirar 1ml de meio LB autoclavado (no fluxo) e colocar em uma cuveta limpa para
leitura do Branco. Marcar o erlenmeyer que foi retirado o Branco; (no fluxo)
15- Adicionar 250l de tetraciclina 5mg/ml e 2,5ml de pr inoculo em cada erlenmeyer.
Deixar crescer por 3 horas 37oC. A cada hora fazer a leitura da OD, at alcanar o
valor de 0.7; (no fluxo)
16- Transferir o contedo dos erlenmeyers para os tubos da centrfuga, balancear e
centrifugar por 20 minutos 4800 RPM; (no fluxo)
17- Descartar o meio (preservar o pellet) e repetir a centrifugao com a outra metade do
meio; (no fluxo)
18- Descartar o sobrenadante, completar o volume do tubo com gua gelada e
ressuspender o pellet no gelo, levemente ou faa um spin com o pellet virado para
dentro, caso o rotor seja fixo. (no fluxo)
19- Balancear os tubos e centrifugar 4800 RPM por 20 minutos;
20- Descartar o sobrenadante, e repetir o passo 18; (no fluxo)
21- Juntar o contedo dos tubos trs a trs, balancear os dois tubos e centrifugar 4800,
RPM por 20 minutos; (no fluxo)
22- Repetir o passo 21; (no fluxo)
23- Descartar o sobrenadante, adicionar 10ml de glicerol 10% gelado em cada tubo, e
ressuspender o pellet, no gelo, levemente ou faa um spin com o pellet virado para
dentro, caso o rotor seja fixo. (no fluxo)
24- Balancear os tubos e centrifugar na centrfuga para tubos falcon 4500rpm por 20min;
25- Descartar o sobrenadante, adicional 1ml (ou menos dependendo do objetivo) de
glicerol 10% em cada tubo (2tubos) e ressuspender no gelo, levemente; (no fluxo)
26- Aliquotar 40ul de clulas em tubos epp de 1,5ml e colocar imediatamente em N lquido;
27- Armazenar os tubos -80oC.