UNIVERDIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS II
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

ATIVIDADE DA PEROXIDASE NA POLPA DE AÇAÍ (Euterpe oleracea)

ADRIANO DE FIGUREIDO MARÇAL

08091001001

BELÉM/PA – 2009
 UNIVERDIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE TECNOLOGIA
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS II
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

ATIVIDADE DA PEROXIDASE NA POLPA DE AÇAÍ (Euterpe oleracea)

Trabalho apresentado à disciplina de

Bioquímica de Alimentos II,
ministrada pelo Prof. Hervé Rogez,
como quesito avaliativo para
obtenção de nota.

BELÉM/PA - 2009
1. INTRODUÇÃO
 O Brasil, possuidor de uma fruticultura diversificada, é considerado o
terceiro maior produtor de frutas frescas, com cerca de 38 milhões de
toneladas anuais, atrás da China e Índia (BEZERRA, 2004). Dentre esses
frutos, o açaí (Euterpe oleracea, Mart.), típico da Amazônia, teve uma produção
no país de aproximadamente 740 mil toneladas de 1999 até 2004 (MONTEIRO,
2006).
Dentre as frutas da Amazônia, o açaí é uma das mais nutritivas. Contém
alta concentração de fibras (que contribuem para o bom funcionamento do
aparelho digestivo), de antocianinas (compostos fenólicos também encontrados
no vinho tinto com propriedades antioxidantes), de minerais cálcio é potássio,
além de vitamina E (MESSIAS, 2009).
A peroxidase é uma enzima associada a reações de deterioração
oxidativa em frutas e vegetais in natura e produtos processados (HAMMER,
1993). Na reação enzimática o peróxido de hidrogênio ou outro peróxido
orgânico, como o peróxido de metila ou o etil hidrogênio, é reduzido, enquanto
que um doador de elétrons é oxidado. O doador de elétrons pode ser
ascorbato, fenóis, aminas ou outros compostos orgânicos (ROBINSON, 1991).
Em muitos casos o produto da oxidação é colorido e serve como base para a
determinação colorimétrica da atividade da peroxidase (VÁMOS-VIGYÁZÓ,
1981).
A peroxidase pode causar mudanças indesejáveis no aroma, gosto, cor,
textura e também a perda de nutrientes (HAARD, 1977). A peroxidase pode
participar da destruição de vitamina C, catalizar o branqueamento dos
carotenóides na ausência de ácidos graxos insaturados e a descoloração de
antocianinas. Catalisa a reação de degradação de ácidos graxos insaturados,
produzindo voláteis que alteram o sabor (RICHARDSON et al, 1985) .
No açaí, em que enzimas naturais termorresistentes estão presentes, há
limitação na temperatura máxima que pode ser atingida no processo. Este
máximo ocorre devido o processo térmico fornecer suficiente letalidade para os
microrganismos, mas insuficientes para a inativação da enzima. Isto é uma
conseqüência da diferença de degradação microbiana e enzimática à
temperatura (D e Z). (MAGALHÃES, 1992).

2. MATERIAL E MÉTODO
2.1. MATERIAL
• Polpa de açaí;
• Soluções tampão pH 3, 4, 5, 6 e 7;
• Água destilada;
• Tubos inoxidáveis;
• Recipientes de vidro;
• Papel alumínio;
• Papel filtro;
• Pipetas;
• Béqueres;
• Balões volumétricos;
• Tubos eppendorf;
• Tubos de ensaios;
• Cubetas;
• Reagentes:
○ Ácido acético
○ Ácido cítrico;
○ Acetato;
○ Hidróxido de sódio (NaOH);
○ Parafenilenodiamina (p-pda);
○ Fosfato dibásico (KH2PO4)
○ Fosfato monobásico (K2HPO4).
• Equipamentos:
○ Ultrassom (UltraSonic Clear);
○ Banho-maria (Quimis Q-215 M2);
○ Balança analítica;
○ Balança-semi-analitica;
○ Medidor de pH;
○ Espectrofotômetro (BioPharma Ultrospec 200);

1.1. MÉTODO
1.1.1.Método I – Preparo das soluções Tampão
Na aula prática do dia 18 de Semtebro, realizou-se o preparo de 5 soluções
tampão com o intuito de utiliza-las em aulas futuras. Definiu-se que seriam
preparadas soluções com valores de pHs 3, 4, 5, 6 e 7. Para o preparo da
solução pH 3 utilizou-se ácido cítrico e pKa 3,13, para as soluções pH 4 e 5
utilizou-se ácido acético e pKa 4,75 e as outras soluções, pH 6 e 7, utilizaram-
se os fosfatos e pKa 6,86. Nos cálculos para o preparo das soluções
considerou-se a concentração por meio de relação matemática, densidade e
volume, para assim obter o volume de ácido e concentração de base
necessária.
Para calcular a massa de reagente sólidos utilizou-se a equação a
seguir:
M= mM.mol x V

Obteve-se a concentração utilizando a seguinte equação:

pH=pKa+logbaseácido

O volume da solução foi calculado em razão da densidade por meio da

equação:
v=mρ

1.1.2.Método II - Determinação de pH ótimo da peroxidase e

determinação de KM e VMÁX.
Na prática realizada no dia 22 de Outubro o principal objetivo foi avaliar
e quantificar a atividade enzimática da peroxidase na polpa do açaí. Para isso
pesou-se 0,2 g de p-pda em seguida colocou-se a substância pesada em um
balão volumétrico de 10 mL, envolvo em papel alumínio (com o intuito de evitar
a degradação do substrato pela ação da luz), após isso aferiu-se os mesmos
com as soluções tampão. Para acelerar o processo de dissolução do p-pda nas
soluções, levou-se as amostras para um banho ultrassom e lá permaneceram
até que todo o material sólido fosse completamente dissolvido. Após a
dissolução os tubos foram transferidos para recipientes eppendorf, já envoltos
em papel alumínio, e armazenados sob refrigeração e ao abrigo da luz.
Para o preparo da solução de peróxido de hidrogênio (H 2O2) a 30%
colocou-se, com o auxílio de uma micropipeta, 76,5 μL de H2O2 em balões
volumétricos de 50 mL, que continham soluções tampão de pH 3, 4, 5, 6 e 7,
em seguida armazenou-se em um isopor ao abrigo da luz e sob refrigeração.
Pesou-se 7 amostras de 1 g de polpa de açaí, e diluídas seguindo a
proporção 1:9, para reter possíveis partículas sólidas que poderiam mascarar a
real absorbância da polpa, realizou-se uma filtragem. A amostra filtrada foi
novamente diluída seguindo um fator de 3,33. Em seguida foram colocadas em
cubetas de 3000 μL 2700 μL de tampão, 100 μL H2O2 e 100 μL da polpa de
açaí diluído, em seu respectivo tampão, em 100 μL de p-pda a 2 %.
Para determinar o pH ótimo, levou-se as cubetas, previamente
homogeneizadas, para o espectrofotômetro, e verificou-se a absorbância das
amostras em diferentes tampões.
Após a verificação fez-se a determinação de KM e VMÁX, através das
quantidades de solução tampão, H2O2, açaí e p-pda (Tabela 1).

Tabela 1 - Quantidade de soluções adicionadas nas cubetas.

Solução p-pda 2 %
Cubeta H2O2 (µL) Açaí (µL)
tampão (µL) (µL)
1 2790 100 0 10
2 2790 100 100 10
3 2780 100 100 20
4* 2750 100 100 50
5 2700 100 100 100
6 2600 100 100 200
7 2400 100 100 400
*Amostra realizada em triplicata.

1.1.3.Método III – Determinação de D e z.

A prática realizada no dia 30 de outubro teve como objetivo principal
determinar D e Z, o qual mede o tempo necessário para reduzir a atividade
enzimática em 90 % ou então diminuir a quantidade de microorganismos vivos
inicialmente. Para a realização dessa prática utilizou-se 8 tubos de aço
inoxidável, simulando um pasteurizador, o qual foi adicionado de 20 g de polpa
de açaí, em seguida as amostrar foram colocadas, com exceção da amostra
controle, em banho-maria por um determinado período de tempo de acordo
com a Tabela 2. O tratamento térmico consistia em fornecer calor a cada tubo
de aço por um determinado tempo.
Tabela 2 - Tempo e temperatura o qual cada tubo foi submetido.

Tubo Tempo de incubação Temperatura (°C)

1 1s 85
2 30 s 85
3a 10 min 85
3b 10 min 85
3c 10 min 85
4 1s 75
5 1s 65

Após o tratamento térmico o tubo era resfriado à 21 °C. Após o

resfriamento as amostras eram diluídos a uma proporção de 1:9, utilizando o
tampão ideal, e filtrados e posteriormente eram novamente diluídas a um fator
de 3,33. Em cubetas foi adicionado 2700µl de tampão, 100µl de peróxido,
100µl da diluição do açaí e 100µl da solução de p-pda (2%), o qual foram
homogeneizadas e posteriormente levadas para a verificação no
espectrofotômetro.

2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1. DETERMINAÇÃO DO PH ÓTIMO
As enzimas dependem do próton livre para a sua atuação, para manter
sua conformação molecular e permitir o encaixe do substrato específico, desse
modo o estudo relacionado aos processos oxidativos do material em estudo
será melhor controlado conhecendo exatamente o pH em que a enzima atual
em sua maior velocidade.
O Gráfico 1 mostra o comportamento da peroxidase com a utilização de
diferentes valores de pH.

Gráfico 1 - Comportamento da peroxidase em relação ao pH

Apesar de o gráfico evidenciar que a maior atividade da peroxidase é no

pH 5, é sabido que a maior atividade é no pH 6. Justifica-se tal erro pela
probabilidade de ter ocorrido uma má manipulação dos componentes durante o
experimento ou mesmo o fato de a solução tampão não ter sido preparada de
imediato. O pH testado menos eficiente foi o pH 3, não ocorreu absorbância.

Gráfico 2 - Absorbância em função do pH

O Gráfico 2 evidencia que quanto maior a quantidade de p-pda oxidado maior é
a sua absorbância.

2.2. DETERMINAÇÃO DE KM E VMÁX e valores de D e z.

O tratamento térmico resultou na inativação de algumas enzimas, de
acordo com o binômio tempo e temperatura a qual cada amostra foi exposta.
Para o cálculo de KM e VMÁX utiliza-se os valores da absorbância de cada
amostra “pasteurizada” em relação a concentração de p-pda desse modo é
possível determinar os parâmetros cinéticos.
Obteve-se os valores da absorbância através de cálculos, em posse
desses dados foi possível calcular a concentração de produto formado em mM
utilizando a equação da reta da curva de calibração.

Gráfico 3 - Concentração de produto formado em relação a concentração de p-pda

Foi possível notar que quanto maior a concentração de substrato maior

é a quantidade de produto formado. Evidencia-se também que a quantidade
inicial de p-pda afetou a quantidade de produto formado devido ao curto tempo
de reação.
Tomando-se os valores inversos do coeficiente angular do gráfico que
relaciona o tempo com a quantidade de produto formado obtém-se o valor de
D.

Gráfico 4 - Determinação de D (absorbância em função do tempo, com temperatura constante).

No Gráfico 4 observa-se que no intervalo de tempo 10 minuto a redução

de produto formado é a maior, isso significa que após esse determinado
período a atividade enzimática é reduzida.
Em um gráfico linear decrescente de D em função da temperatura, uma
única reta foi obtida, cujo inverso negativo do coeficiente angular também
forneceu o valor de z.
Gráfico 5 - Determinação de Z (absorbância em função da temperatura,com temperatura constante)

A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que o tratamento

térmico a 85 °C e a 10 minutos houve uma redução de 90% na atividade
enzimática. E que também quanto maior a temperatura maior o inativação
enzimática.
3. REFERÊNCIAS

BEZERRA, J. A. No Ceará tem disso, sim. Agricultores nordestinos adotam

parcerias para multiplicar a produção e investem em tecnologia para aumentar
as exportações de frutas frescas, ajudando o Brasil a conquistar novos
mercados. Globo Rural Agropecuária e Negócios, n. 230, p. 44-52, dez.
2004.

HAMMER, F.E. Oxidoredutases. In: NAGODAWITHANA,T., REED, G (Ed)

Enzymes in food processing, England: Academic Press, 1993, p.233-243.

MAGALHÃES, M.M.A. Estudo cinético da inativação térmica de enzimas

termorresistentes, com ou sem adição de sacarose na polpa de mamão
“formosa” (Carica papaua L.) acidificada e o estabelecimentodo
processamento térmico requerido. 1992. 166 f.

MENEZES, E.M.S.; ROSENTHAL, A.; SRUR, A.S.; CAMARGO, L.; CALADO,

V.; SANTOS, A. Efeito da alta pressão hidrostática na atividade de enzimas
da polpa de açaí. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 28, 2008

RICHARDSON, T., HYSLOP,D.B. Enzymes. In: FENNEMA, O. R. Food

chemistry, 2 ed. ,New York: Marcel Dekker, Inc. 1985, p. 451-452.

ROBINSON, D.S. Peroxidases and their significance in fruits and vegetables.

In: FOX, P.F. (Ed), Food enzymology. London and New York: Editora, p. 399-
426, 1991.

VÁMOS-VIGYÁZÓ, L. Polyphenoloxidase and peroxidase in fruits and

vegetable. CRC Criticals Reviews in Food Science and Nutrition, Cleveland,
1981, v.15, p. 49-127.