Detecção de organismos

geneticamente modificados

Francine Zanatta
Patricia D. C. Schaker
 IDENTIFICAÇÃO

Os OGM’s produzem uma proteína adicional codificada pelo

gene introduzido, portanto, sua identificação pode ser feita
de duas maneiras:

1)Detecção do DNA introduzido

2)Detecção do produto codificado por este DNA
 Estrutura do Inserto
Gene de interesse
+
combinação de pequenos fragmentos de DNA
(promotor, terminador)
Detecção de OGM’s e Rotulagem

Produtos alimentícios

Produtos farmacêuticos

Processos de purificação
 EUA = NÃO É OBRIGATÓRIA
“consideram que os transgênicos são substancialmente equivalentes
aos produtos convencionais, ou seja, possuem composição química e
valor nutricional semelhante e ausência de substancias tóxicas”.

BRASIL, UE, CHILE, NOVA ZELÂNDIA,

AUSTRALIA
“exigem a rotulagem de produtos geneticamente modificados ou dos
que contenham ingredientes derivados de organismos
geneticamente modificados em porcentagens superiores a 1%”.
 Amostragem
• Amostra: Parcela representativa da
população
• Amostragem: processo que define como a
amostra deverá ser coletada.

– Aleatória
– Todos os indivíduos devem ter a mesma chance de
serem amostras
– Deve ser estatisticamente representativa
 Métodos utilizados na detecção
de OGM’s
Bioensaios e métodos alternativos

“Teste do desafio”

- Resistência a insetos
- Resistência a antibióticos
- Resistência a herbicidas

Se a modificação for confirmada por este teste, ensaios mais

sensíveis e específicos deverão ser realizados
ANÁLISE DE PROTEÍNAS
 ELISA

US$ 7,00 – 10,00

8 horas
Imunoensaio de Fluxo Lateral

US$ 4,00 – 7,00

5 a 15 minutos
Western Blot
1) LISE CELULAR

2) DESNATURAÇÃO
(CALOR,
DETERGENTE,
COMPOSTO
SULFUROSO)

3) ELETROFORESE

4) TRANSFERENCIA
PARA
NITROCELULOSE

5) BLOQUEIO

6) REMOÇÃO ACS
NÃO LIGADOS

7) DETECÇÃO
Western Blot

US$ 70,00 – 90,00

2 DIAS
ANÁLISE DE DNA

Para OGM’s que não

expressam níveis
detectáveis de
proteínas
Southern Blot

1) ELETROFORESE

2) DESNATURAÇÃO

3) MEMBRANA DE
NITROCELULOSE SOBRE O
GEL

4) TRATAMENTO COM A SONDA

DE HIBRIDIZAÇÃO
(COMPLEMENTAR OU
IDENTICA)

5) RETIRADA DO EXCESSO DE
SONDA

6) DETECÇÃO (RAIO X)
Southern Blot
Reação de Polimerização em
Cadeia
 A PCR é um método que permite amplificar
seletivamente sequências de um molécula de
DNA (Duplicação do DNA In vitro).

Todos os reagentes são reunidos em um

eppendorf (DNA polimerase, amostra de DNA
alvo, desoxiribonucleosideos trifosfatos,
cofatores, primers e água.) Amplificando bilhões
da seqüência desejada em poucas horas.
Servindo assim para detecção de OGM’s.
 A operação é dividida em 3 fases:

1 – Desnaturação: Fita de DNA dupla é

separada pelo calor

2 – Anelamento – Onde os
oligonucleotideos (primers) anelan-se a
sequencia complementar marcando o
ponto de partida para a DNA polimerase
(os primers flanqueiam a seqüência de
interesse e possibilitam o alongamento
da seqüência de interesse).

3 – Extensão – A partir dos primers a

DNA polimerase adiciona nucleotídeos
complementares a fita molde.
Fig. 01 - Termocilcador

Fig. 02 - Eppendorf e amostra

 PCR screening
Este método detecta seqüências de DNA estranhas
a espécie analisada porem comum a uma ampla
variedade de OMG’s.

O resultado positivo indica a presença de uma

modificação genética, mas sem permitir a
identificação do tipo ou do organismo que foi
modificado.

Esse método causa falso positivo

• Este método emprega primes que flanqueiam
dois elementos genéticos adjacentes, como o
promotor e o gene de interesse ou o gene de
interesse e o terminador - Essas seqüências
são especificas de OGN’s.

• Para confirmar os dados pode-se utilizar os

seguintes métodos:
 Digestão com enzimas de restrição
 Southern blot.
 PCR Quantitativa
Duas diferentes metodologias quantitativas
podem ser utilizadas:

• PCR quantitativa competitiva (PCR – QC)

• PCR em tempo real (PCR – TR)
 PCR - Quantitativa Competitiva
a) Preparação de uma diluição em série do DNA
alvo e adição de uma quantidade constante do
competidor (DNA Standard)
b) Coamplificação do DNA standart e do DNA alvo
c) Separação dos produtos através de eletroforese
em gel de agarose contendo brometo de etídio.
d) Análise Desintométrica do gel
e) Estimativa da quantidade relativa do DNA
standard e do DNA alvo através da analise de
regressão
 PCR – Tempo Real
• A quantidade de produto amplificado durante a reação é
estimada diretamente pela mensuração da fluorescência
emitida.

• Processo

Durante a reação, a introdução de uma sonda especial de

DNA permite a detecção da fluorescência. Esta sonda
contem uma molécula repórter (de emissão) e uma
molécula quencher (de extimação). Fisicamente próximo ao
reporter, o quencher tem a propriedade de absorver a
fluorescência gerada, e portanto, nenhum sinal pode ser
detectado. Durante a amplificação a sonda é degradada,
afastando o repórter do quencher, possibilitando a emissão
do sinal fluorescente, que é detectado por uma camera
digital. A mensuração é on line, diretamente nos tubos ,
durante a reação de PCR.
Com base na curvas de calibração criadas a
partir do material de referência, o percentual
de OMG é determinado pela relação entre o
número de cópias dos genes modificados e o
número de cópias dos genes da espécie
vegetal presente na amostra.
 PCR Multiflex
• Este método permite a detecção de várias
seqüências de DNA alvo em uma única reação.

• Na prática, isto é possível apenas

acrescentando-se apenas uma quantidade
maior de reagentes e primers para cada
seqüência alvo.

• Passível de riscos incorretos

Microarranjos de DNA
 Dividido em 8 etapas:

1. Isolamento e purificação do DNA da amostra.

2. Amplificação das sequências de DNA especificas dos OGM’s através
de duas reações de PCR multiplex separadas
3.Mistura de produtos de ambas as reações
4.Através da digestão com uma exonuclease , os produtos dupla fita
passam para simples fita
5. Mistura da amostra com tampão de hibridização.
6. Aplicação da amostra no chip
7. Sondas de DNA ligadas covalentemente aos chip, marcadas com
corante fluorescente Cy5, hibridizam as sequências de DNA alvo
amplificadas
8. Análise das sequências coradas em um leitor de biochip.

O limite de detecção para OGM’s está na margem de 250 cópias de

cada uma das seqüências de DNA alvo amplificadas na PCR.
OBRIGADA!!!!