PCR CLSSICO

INTRODUO

PCR significa polymerase chain reaction , em portugus quer dizer reao em cadeia da polimerase ; Idealizada e desenvolvida pelo qumico Kary Banks Mullis, que conceituou o processo em 1983; Amplifica um segmento de DNA at que se obtenham cpias suficientes para anlise da seqncia alvo; Tcnica muito dinmica e com ampla aplicao;

PCR CLSSICO

Tcnica que permite a amplificao de um segmento de DNA em milhes de vezes em poucas horas; Revolucionou reas onde as pesquisas genticas esto presentes; Altas temperaturas so usadas para separar as fitas de DNA;

PCR CLSSICO A TCNICA

Extrao do DNA; Adio de uma mistura conhecida como pr-mix; A mistura passa por 3 etapas no termociclador: 1 etapa: desnaturao da cadeia a 94 96C; 2 etapa: anelamento dos primers entre 50 a 60C; 3 etapa: elevao de temperatura a 72C para funcionamento das enzimas; Um novo ciclo iniciado at que haja quantidade suficiente para amplificao;

Figura 1. Eventos relacionados s trs temperaturas bsicas da PCR: Desnaturao a 94 oC, pareamento dos primers a 50 oC e extenso de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq-polimerase ou outra DNA-polimerase termo-estvel.

Figura 2. Produo de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Aps anelamento dos primers a 56 oC, as fitas novas so sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reao.

Figura 3. Ciclo padro de uma PCR.

Ocorre amplificao e seqenciamento, gerando cpias de diversos tamanhos atravs da adio de bases nitrogenadas; Visualizao do processo por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida; O produto de uma PCR sempre uma fita dupla de DNA e se distinguem no gel pelo comprimento relativo; A determinao do resultado feita de acordo com uma escala de DNA que contm marcadores de peso molecular;

Figura 4. Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (nmero total de pares de bases) nas colunas 2 a 5. Na coluna 1 esto os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido enquanto a coluna 6 um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel apenas a fronteira da eletroforese.

PCR CLSSICO CUIDADOS

Cuidados com a contaminao; Pareamento dos primers; Erros na seqncia devido tautomeria das bases;

OBRIGADO!