UEM Nutrio Mineral de Plantas

10.
METABOLISMO DO NITROGNIO 10.1. Consideraes gerais As formas mais comuns de nitrognio no solo so a ntrica e a amoniacal. Ambas resultam da ao de bactrias e fungos do solo, mineralizando as formas orgnicas, liberadas na decomposio de animais e vegetais mortos, como mostrado abaixo.

imobilizao

N orgnico
amonificao

NH4+

NO2

NO3

nitrificao

mineralizao
As principais fontes de nitrognio inorgnico absorvido pela plantas superiores tambm a ntrica e a amoniacal. A maior parte do amnio pode ser incorporado em compostos orgnicos nas razes, enquanto que o nitrato prontamente solvel no xilema e pode tambm ser armazenado nos vacolos das razes, da parte area e em rgos de armazenamento. A acumulao do nitrato nos vacolos pode importante no balano ctionnion, para a osmorregulao, principalmente em espcies nitroflicas como a Chenopodium album e Urtica dioica. Entretanto, para ser incorporado em estruturas orgnicas e desempenhar uma funo essencial na nutrio da planta, o nitrato deve ser reduzido a amnia. A importncia da reduo e assimilao do nitrato na vida das plantas similar a reduo e assimilao do C02 na fotossntese. 10.2. Absoro do nitrognio a. Absoro do nitrato O sistema de absoro das razes, para satisfazer a demanda de nitrato na planta, deve ser muito eficiente, e de fato . Evidncias recentes sugerem que a absoro do nitrato est acoplada a um fluxo eletrognico de prtons como mostrado na Figura 10.2.

102

UEM Nutrio Mineral de Plantas

ATP

H+
ADP+Pi

"POOL" METABLICO

[NO - ] 3

cit

"POOL" DE ARMAZENAMENTO

+ 2H [NO3 ]

[N03-] RN
REDUO

vac

TRANSPORTE

Figura 10.2 Diagrama esquemtico de absoro e de distribuio do nitrato nas clulas. Como pode ser observado a H+-ATPase produz o gradiente eltrico e de pH para possibilitar a entrada em simporte do nitrato com 2H+. Uma pequena parte do nitrato fica no citoplasma (pool metablico), mas a maior parte transportado para o vacolo (pool de armazenamento) e/ou exportado para outros locais na planta, principalmente para as folhas. Na verdade as plantas possuem dois sistemas distintos de absoro, com diferentes afinidades para o nitrato; um ativo sob baixas concentraes (abaixo de 1 mM) e outro sistema ativo sob altas concentraes (acima de 1mM) de nitrato. O sistema ativo em baixas concentraes possuem alta afinidade pelo substrato (nitrato) e exibe uma cintica de fluxo saturvel com KM entre 0,015 e 0,3 mM, e apresenta alta sensibilidade a inibidores metablicos. O segundo sistema citado, caracteriza-se por ser constitutivo (pr-existente), passivo e de baixa afinidade pelo substrato. b. Absoro de amnio A absoro do on amnio, similar de ctions monovalentes como o K+ por exemplo, parece ser um processo dependente de energia, mas a favor do seu gradiente de potencial eletroqumico. Em milho, foi encontrado um efluxo de H+ associado com a absoro de NH4+, na estequiometria de 1:1. 10.3. Reduo e assimilao do nitrato a. Locais de reduo e formas de transporte As plantas precisam reduzir o nitrato para que o nitrognio possa ser incorporado nos inmeros compostos orgnicos. Esta reduo pode ser feita exclusivamente no sistema radicular, como acontece em certas plantas lenhosas 103

UEM Nutrio Mineral de Plantas como a macieira silvestre. Neste caso, observa-se elevada atividade da redutase do nitrato nas razes, quase completa ausncia na parte area e o N encontrado na seiva xilemtica , quase completamente, de natureza orgnica. Outras plantas reduzem o nitrato exclusivamente nas folhas: o caso de Xanthium pennysylvanicum. Neste caso, as plantas possuem elevada atividade da redutase do nitrato na parte area e ausncia nas razes. A maioria das plantas, entretanto, reduzem o nitrato tanto nas razes quanto nas folhas e, portanto, possuem redutases do nitrato igualmente ativas nas duas partes da planta. A reduo do nitrato tambm depende dentro da mesma espcie, da idade da folha, da luz, do status nutricional da planta, entre outros fatores. As principais formas de N transportadas na seiva xilemtica das razes para a parte area dependem fundamentalmente do tipo de planta, da atividade da redutase do nitrato, da capacidade da planta fixar ou no N2 atmosfrico e da forma do N fornecido s plantas. A composio da seiva xilemtica de plantas de soja supridas com diferentes formas de nitrognio pode ser obsevada no Quadro 10.3. Quadro 10.3 Composio da seiva xilemtica de plantas de soja supridas com diferentes formas de nitrognio TRATAMENTOS 0 (em N) N-NO310 mM N-NO3- 20 mM N-URIA 10 mM N-URIA 10 mM N- total 187,4 134,1 138,0 173,8 192,9 N-uredico 83,0 47,5 15,0 49,4 39,3 N-aminoactico 16,3 26,4 37,6 48,0 56,8 N-NO30,4 25,8 47,0 2,4 3,5 N-NH4+ 0,2 0,3 0,4 0,2 0,3

No caso das plantas controles, nenhuma fonte de N foi adicionada e todo o N assimilado o foi simbioticamente. Do N total, 83% estava na forma de uredeos e 16% na forma de aminocidos. Aquelas que receberam N03-, com a inibio da fixao simbitica de N2, observou-se queda acentuada no teor de N-uredico e aumento nos teores de N-aminoactico, acentuando-se este efeito com o aumento da dose de N03-. As plantas que receberam uria, tambm, sofreram inibio na fixao simbitica de N2 e apresentaram teores de N-aminoactico ainda mais elevados. Os teores de N-NH4+ permaneceram sempre baixa em razo de um eficiente sistema de assimilao, para evitar sua toxicidade. O movimento de substncias nitrogenadas das razes para as folhas embora se d principalmente no xilema pode ocorrer tambm no floema.

104

UEM Nutrio Mineral de Plantas a. Enzimas de reduo do nitrato Redutase do nitrato

A redutase do nitrato (RN) uma molibdenoflavoprotena constituda de duas subunidades idnticas com peso molecular entre 100 a 110 kD que cataliza a reduo do nitrato a nitrito: NO3- + 2e- NO2Cada subunidade possui trs grupos prostticos que transferem os eltrons ao NO3- : FAD; Citocromo c (Fe2+/Fe3+ preso ao grupo heme do citocromo); Cofator molibdnio (MoCo: cofator Mo; Mo-pterina: Mo ligado a um grupo heterocclico tipo pterina do cido flico) (Figura 10.3).

Figura 10.3 Representao esquemtica da seqncia da assimilao do nitrato nas clulas da folhas. Como pode ser observado a redutase do nitrato (RN) est presente apenas no citoplasma. O doador de eltrons para a enzima proveniente do NADPH produzido no cloroplasto. Assim, a RN tem sua atividade induzida por nitrato e por luz e inibida por NH4+ e por aminocidos. - Redutase do nitrito A redutase do nitrito (RNi) uma enzima cloroplastdica que catalisa a reduo do nitrito a amnia: N02- + 6 e- ! NH4+ A enzima possui um peso molecular entre 60 e 70 kD com dois centro redox: um centro siro-heme e um centro Fe-S (Figura 10.3). inibida por cianeto e C0 e requer ferredoxina como fornecedor de eltrons. Em tecidos no-verdes a 105

UEM Nutrio Mineral de Plantas ferredoxina reduzida pode ser provida pela ao da enzima redutase da ferredoxina-NADP que catalisa a transferncia dos eltrons do NADPH para a ferredoxina. 10.4. Assimilao da amnia a. Enzimas de assimilao da amnia O on amnio, pode ser oriundo; da absoro radicular, produzido pela reduo do nitrato, do catabolismo de aminocidos ou da fotorrespirao. Esse on precisa ser rapidamente assimilado em compostos orgnicos em razo de sua toxicidade. A assimilao de amnia ocorre em vria etapas, necessitando da participao de vrias enzimas. As duas principais rotas de assimilao so: 1) Rota GDH Nesta rota, catalisada pela enzima desidrogenase do glutamato (GDH), o amnio, com gasto de uma molcula de NADH, incorporado ao cido oxoglutrico formando cido glutmico (Figura 10.4). Esta rota uma das primeiras a ser descoberta, parece ser importante apenas para o processo de desintoxicao de amnio sob condies de estresse (hdrico, salino, temperatura, etc). Requer NADH ou NADPH quando catalisa reaes aminativas e NAD+ ou NADP+ em reaes desaminativas. 2) Rota GS/GOGAT Na rota GS/GOGAT, sugerida na dcada de 70 com a descoberta das enzimas sintetase da glutamina (GS) e sintetase do glutamato ou glutamina oxoglutarato amino transferase (GOGAT) a assimilao do amnio ocorre em duas etapas. Numa primeira etapa a enzima GS catalisa a incorporao do on amnio numa molcula de glutamato, formando glutamina. Em seguida, a enzima GOGAT catalisa a transferncia do grupo amino da glutamina para o oxoglutarato formando-se duas molculas de glutamato. Uma das molculas de glutamato desviada para a sntese de outros aminocidos enquanto a outra retorna ao ciclo para ser receptora de novo on amnio (Figura 10.4). Esta rota , hoje, considerada a principal rota de assimilao do amnio produzido pela reduo do nitrato, principalmente em razo do KM da GS para o amnio ser mais baixo do que o da GDH. A GS pode estar presente em cloroplastos, citossol e em ndulos, sob diversas isoformas (GS1, GS2 GSn,s, etc). ativada por Mg2+ e inativada por Mn2+. A GOGAT existe tanto em tecidos verdes como em razes, principalmente dentro de organelas como em cloroplastos ou plastdios . Existe 3 isoformas desta enzima (Fd-GOGAT, NADH-GOGAT e NADPH-GOGAT). Existem ainda as formas 106

UEM Nutrio Mineral de Plantas NADH-GOGAT I e II em ndulos de plantas que fixam N2. A atividade desta enzima dependente de NH4+ e de aspartato.

NO3REDUTASE DO NITRATO
NADH NAD+ CITOSSOL
Fdred. Fdox.

NO2REDUTASE DO NITRITO

CLOROPLASTO LUZ CIDO GLUTMICO GS (1)

NH3
ROTA GDH

NADH

CIDO OXOGLUTRICO GDH (3)

GLUTAMINA

ROTA GS/GOGAT
GOGAT (2)

NAD+

CIDO GLUTMICO (1) GS = Sintetase da Glutamina (2) GOGAT = Glutamina oxoglutarato aminotransferase (3) GDH = Desidrogenase do cido AMINOCIDOS glutmico CIDOS NUCLICOS OUTROS COMPOSTOS NITROGENADOS PROTENAS

Figura 10.4 Representao esquemtica da reduo/assimilao do nitrato em plantas superiores. As principais classes de compostos orgnicos nitrogenados decorrentes do metabolismo dos ons, amnio, nitrato e N2, pode ser verificada abaixo:

107

UEM Nutrio Mineral de Plantas Protenas cidos Nuclicos Outros - Coenzimas, - Produtos secundrios - Constituinte de membranas

NO3NH4+ (N2)

Aminocidos Amidas Peptdeos Aminas Uredeos

108

UEM Nutrio Mineral de Plantas

11.
FIXAO DO NITROGNIO 11.1. Consideraes gerais A fixao biolgica de N2, atualmente no globo terrestre, est na faixa de 139 a 170 x 106 t N por ano, enquanto que a aplicao de N como fertilizante atinge uma faixa de 65 x 106 t por ano. A converso do N2 (gs inerte) em nitrognio combinado (NH3; N03-), a qual pode ser utilizado como nutriente mineral feita pela reduo do N2 a amnia (NH3) ou pela oxidao do N2 a nitrato. Esta converso tambm denominada de fixao, possui alto custo energtico. Na fixao industrial e na converso biolgica a reao N2 ! 2NH3 domina. Na fixao industrial, o N2 cataliticamente reduzido a NH3 pela reao com o hidrognio (produzido por ex. do gs natural) no processo Haber-Bosch (N2 + 3H2 ! 2NH3) sob condies de alta temperatura e presso. O incremento tanto no custo da energia fssil como o aumento na demanda global da utilizao dos fertilizantes nitrogenados para a produo de alimentos, a principal razo pelo novo interesse na fixao biolgica do N2, como uma alternativa ou no mnimo, como um complemento para o uso do fertilizante nitrogenado qumico. 11.2 Sistema de fixao do nitrognio biolgico A capacidade de fixao biolgica do N2 atmosfrico restrito aos organismos com estrutura de clula procariticas, chamada, bactrias e algas verde-azuis (cianobactrias). A fixao simbitica de significncia na agricultura feita por Eubactria, muitas das quais so heterotrficas, dependentes do suprimento de carbono reduzido (Azospirilllum). Outros so autotrficos e capazes de reduzir o C02 ( ex. Anabaena). Um nmero de espcies do genero Frankia (Thallobacteria), Nostoc e Anabaena (Cianobacteria) e de Rhizobium (Protobactria) so de particular importncia devido sua capacidade simbitica. Baseada na taxa de crescimento, dois grupos distintos de rizbios existem; o gnero de alto crescimento (Rhizobium) e o gnero de crescimento lento (Bradyrhizobium).. No ecossistema terrestre, trs tipos importantes de estratgias de fixao de N2 podem ser diferenciadas; simbiticos, associativos e organismos fixadores de nitrognio livre (Figura 11.2). Em mdia, o sistema simbitico tem maior capacidade de fixao no somente pelo suprimento de carboidratos obtidos da planta, mas tambm outras condies so otimizadas para a fixao eficiente de N2. Neste sistema as plantas se beneficiam porque mais de 90% do nitrognio fixado transportado da bactria para a planta. Leguminosas nodulada, tais como a alfafa e a soja em simbiose com Rhizobium e Bradyrhizobium, respectivamente, esto entre os mais importantes sistemas de fixao de nitrognio na agricultura. 109

UEM Nutrio Mineral de Plantas

Sistema de fixao de N2 (N2 ! NH4+) Simbiose e microrganismos envolvidos Fonte de energia (carbono orgnico) Estimativa da quantidade fixada (kg N h-1 ano-1) (ex. rhizobium, Actinomicetos) Sacarose e seus metablicos (da planta hospedeitra) Leguminosas: 50-400 Nodulados noleguminosas:20-300 Associao (ex. Azospirillum, Azotobacter) Livres

( ex. Azotobacter, Klebsiella, Rhodospirillum) Exsudatos Heterotr: Autotrf: radiculares da resduos de Fotossnplanta hospedeira Plantas tese

10-200

1-2

10-80

Figura 11.2 Tipo, fonte de energia, e capacidade do sistema de fixao biolgica do N2 nos solos ( MASCHNER, 1997). Alguns sistemas de fixao de nitrognio com alta especificidade bactriahospedeiro no desenvolvem ndulos. O habitat destas bactria a superfcie radicular e espaos intercelulares das clulas do crtex. Nesta associao com a rizosfera (Figura 11.2) a planta hospedeira fornece exsudatos radiculares como fonte de energia para a fixao de N2. Neste caso o benefcio para a planta neste tipo de fixao de N2 indireto, quando aproximadamente 90% do nitrognio fixado torna-se somente disponvel para a planta aps a morte da bactria. As bactrias fixadoras de N2 livres no solo so em sua maioria heterotrficas (ex. Azobacter), e possuem capacidade de fixao de N2 bastante limitada pela limitao de substratos devido a uma inadequada disponibilidade de resduos orgnicos (Figura 11.2). 11.3 Bioqumica da fixao do nitrognio A reduo biolgica do N2 a NH3 um processo endergnico, exigindo, ao contrrio do processo industrial, um baixo requerimento energtico. Em todos os microrganismos fixadores de N2, o passo mais importante desta reao o mesmo e pode ser observado na Figura 11.3. O complexo enzimtico chave, denominado Nitrogenase, nico para todos os microrganismos fixadores de nitrognio, e encontrado, por exemplo, em bactrias aerbicas e anaerbicas, em cianobactrias e em razes noduladas de leguminosas e no-leguminosas. 110

UEM Nutrio Mineral de Plantas

Figura 11.3 Esquema ilustrando o suprimento de energia e as principais reaes do sistema nitrogenase. A nitrogenase consiste em duas protenas no-heme sensveis ao 02 . A menor das duas denominada Protena Fe, consistindo de duas subunidades e um simples agrupamento de 4F e 4S. A maior, MoFe-protena, consiste de 4 subunidades e contm 30 tomos de Fe e 2 de Mo. Para a reao da nitrogenase, h necessidade de energia na forma de ATP e redutores equivalentes (eltrons) (Figura 11.3), provenientes da respirao (ATP) e transportadores de eltrons que normalmente a ferredoxina. A nitrogenase catalisa a reduo de muitos substratos, incluindo o H+, N2, e C2H2. A principal reao para a reduo do dinitrognio (N2) a seguinte: N2 + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi Apesar de estequiometricamente a reduo de um mol de N2 requerer 16 mol de ATP, na verdade entre 25 a 30 mol de ATP so utilizados. Como observado na Figura 11.3 durante a reduo do N2 h formao de gs H2, que no s um inibibor competitivo na fixao do nitrognio como tambm representa um desperdcio de energia lquida no processo, a menos que a bactria possua outra enzima chamada de hidrogenase. Sob condies timas para a fixao do N2, em mdia 25 % do total de fluxo de eltrons na nitrogenase alocado para a formao de H2. A funo da hidrogenase quebrar o H2 a 2H+ + 2 e- e reciclar estes eltrons produzindo mais ATP. Em leguminosas, a seleo de raas de rizbios que possuem alta atividade da hidrogenase considerado um fator importante no aumento da eficincia da fixao do N2 A nitrogenase extremamente sensvel ao O2. Para proteger a nitrogenase da inativao irreversvel pelo oxignio in vivo, as bactria fixadoras de N2 tem desenvolvido algumas estratgias e mecanismos que incluem: a) Controle da difuso de 02 atravs de barreiras mecnicas imposta por uma camada espessa de crtex envolvendo o local de fixao de N2; b) Controle da difuso de 02, enzimaticamente pela leghemoglobina. Esta protena funciona como um tampo de 02, ou seja, quando h excesso de 02 no sistema, ela absorve o excedente, liberando-o vagarosamente de maneira a no 111

UEM Nutrio Mineral de Plantas inativar a nitrogenase. Outras enzimas que desativam espcies de 02 txico e H202 a ascorbato peroxidase (estudada em funes dos elementos) 11.4 Processo de infeco da bactria Tanto em leguminosas como no leguminosas, a simbiose caracterizada pela especificidade entre a bactria e o hospedeiro (planta). O Quadro 11.4 fornece exemplos da preferncia do hospedeiro para o gnero Rhizobium e Bradyrhizobium. Quadro 11.4 Exemplos de preferncia pelo hospedeiro no gnero Rhizobium e Bradyrhizobium* Gnero/Espcie da Bactria Rhizobium leguminosarum biovar viciae biovar phaseoli biovar trifoli Rhizobium meliloti Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium lupinus Bradyrhizobium arachis Planta Hospedeira Vicia, Lens, Pisum sativum Phaseolus Trifolium Medicago sativa, Melilotus Glycine Lupinus Arachis

*Formalmente referido como rizbio de crescimento lento

Em solos que ainda no tenham sido colonizados por estirpes hospedeiras, recomenda-se a prtica de inoculao das sementes no momento da semeadura de leguminosas como por exemplo a soja e a alfafa. A manipulao gentica de estirpes de rizbios e mesmo de gentipos de plantas mais adequados tem sido muito pesquisado nestes ltimos anos, e tem contribudo para a efetividade da infeco, nodulao e fixao do N2 nos sistemas biolgicos. Os princpios do reconhecimento da planta hospedeira e infeco sumarizado na Figura 11.4 para rizbios que infectam os plos radiculares (ex. R. leguminosarum biovar trifolii em Trifolium spp.). a) O primeiro passo da infeco na planta pelo microsimbionte requer o reconhecimento do hospedeiro; b) Flavonides (lutena) so liberados pelas razes e induzem a expresso de genes de nodulao nas bactrias (necessrio para a produo de lectinas e ligao da bactria ao plo radicular); c) H o curvamento do plo radicular e simultaneamente a induo da diviso das clulas corticais; 112

UEM Nutrio Mineral de Plantas d) Invaso do Rhizobium atravs de um fio de infeco, ocorrendo concomitantemente o desenvolvimento do meristema nodular;

Figura 11.4 Modelo do incio do evento da infeco na planta hospedeira pelo Rhizobium em um perodo de 96 horas. e) O fio de infeco chegando ao meristema nodular, entra no citoplasma das clulas do crtex, e transformam-se em bacteriides (bactrias que perderam seu movimento), os quais so envoltos por uma membrana chamada de membrana peribacteriide. f) Na transformao das bactrias em bacteriide, ocorre tambm a sntese de hemoglobina, nitrogenase e outras enzimas requeridas para a fixao do N2. Dependendo da espcie da planta e dos fatores ambientais, a fixao do N2 comea de 10 a 21 dias aps a infeco. O funcionamento dos ndulos tambm diferem tipicamente entre espcies de plantas na forma e tamanho, e pode ser do tipo indeterminado (continua a crescer) ou do tipo determinado (Figura 11.4.1).

113

UEM Nutrio Mineral de Plantas Figura 11.4.1 - Seo de uma raiz nodulada de soja (Glycine max) com ndulos determinados (esquerda) e de Mimosa pudica L. com ndulos alongados indeterminados. 11.5. Funcionamento do ndulo radicular e energtica da fixao do nitrognio O grande potencial de fixao de N2 em leguminosas noduladas devido basicamente a 3 fatores: a) suprimento direto de fotoassimilados para o bacteriide nos ndulos; b) a manuteno de baixas concentraes de 02 no interior dos ndulos, protegendo a nitrogenase ; e c) o rpido transporte do nitrognio fixado para a parte area (Figura 11.5). A sacarose liberada do floema para os ndulos onde o metabolismo do carbono e do nitrognio adaptado a baixos nveis de 02. O baixo nvel de 02 controlado por uma barreira mecnica imposta pelo crtex do ndulo e, pela alta taxa de respirao pelo bacteriide para manter a produo de energia (fosforilao oxidativa). Entretanto, quem controla em grande parte a difuso de 02 no bacteriide a leghemoglobina. Esta enzima possui colorao avermelhada com um tomo de ferro central no anel porfirnico. A capacidade de fixao do N2 est intimamente ligada a concentrao de leghemoglobina, o que no significa que ambas estejam linearmente correlacionada.

Figura 11.5 Modelo da relao entre a nitrogenase e as reaes relacionadas nos bacteriides e no citossol de ndulos de leguminosa hospedeira. 114

UEM Nutrio Mineral de Plantas

A sacarose antes de entrar no bacteriide sofre transformao a cido mlico (devido a baixa tenso de 02), atuando como substrato para a sntese redutiva dos cido carboxlicos (C4), fumarato e succinato, os quais so transportados para dento do bacteriide servindo como substrato de energia para a nitrogenase. Outros esqueletos carbnicos da gliclise servem como substratos para a assimilao do NH3 no citossol (Figura 11.5). Muito do que respirado no bacteriide perdido como C02. Entretanto, grande parte do C02 que sai do bacteriide incorporado pela PEP case produzindo malato e/ou aspartato que pode ser utilizado na assimilao do NH3 e transporte nas plantas (Figura 11.5). O custo do carbono para a fixao do N2 depende da planta hospedeira, da raa da bactria e do desenvolvimento da planta. Em mdia, para leguminosas, 36-39% do custo do carbono requerido para a nodulao, 42-45% para a atividade nitrogenase e, 16-22 % para a assimilao e transporte. O nitrognio fixado nos bacteriides dos ndulos radiculares liberado como NH3 no citossol da planta hospedeira (Figura 11.5), por difuso simples, atravs da membrana do peribacteriide. No citossol da planta, o NH3 assimilado pela via rota sintase da glutamina (GS)/glutamato sintase (GOGAT), como j demonstrado anteriormente. Geralmente, a glutamina um composto nitrogenado exportado em pequena quantidade dos ndulos. Nas espcies leguminosas com ndulos indeterminados a glutamina normalmente metabolizada a asparagina nos ndulos e liberado no xilema para a parte area. Entretanto, em espcies leguminosas com ndulos determinados, a glutamina metabolizada nos ndulos a uredeos (alantona e cido alantico) e transportado no xilema para a parte area.

115