UNIVERSIDADE DE SO PAULO Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Departamento de Cincias Biolgicas

BIOQUMICA LCB 208

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

PROF.DR. DANIEL SHERER DE MOURA PROFA. DRA. HELAINE CARRER PROF. DR.LUIZ ANTONIO GALLO PROF. DR. LUIZ CARLOS BASSO PROF. DR. MURILO MELO

Piracicaba - SP 2010
1

SUMARIO
ASSUNTO Normas para redao do relatrio de aulas prticas de Bioqumica Colorimetria e Espectrofotometria Determinao de Lactose no leite Cromatografia em Papel de Filtro Determinao do Teor de Casena no leite (reao do biureto 14 03 04 08 11 pg

Determinao da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade mxima (Vm) para a invertase de levedura Reao de Hill (Fotlise da gua) Redutase de Nitrato em Plantas Listas de Exerccios 16 19 21 24

NORMAS PARA REDAO DO RELATRIO DE AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA LCB 208

A forma para se redigir o relatrio deve ser respeitada, uma vez que a avaliao do mesmo feita de acordo com esta orientao. Assim todo relatrio devera conter os seguintes itens: CAPA devera ter: Nome da ESALQ. Depto de Cincias Biolgicas Relatrio de aulas prticas de Bioqumica Ttulo da aula (numero da aula) Nome e nmero do aluno Data (d/m/a) OBJETIVOS INTRODUO Comentrio da aula, incluindo comparativamente os fundamentos qumicos da metodologia empregada REVISO DE LITERATURA Aspectos tericos e informativos do assunto da aula pratica encontrados na literatura . MATERIAL E MTODOS (PROCEDIMENTOS) Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificaes propostas pelo professor RESULTADOS E DISCUSSO Colocar em tabelas os resultados obtidos, grficos, etc. As reta padro somente sero aceitas se forem feitas em papel milimetrado. Comentar os resultados comparando-os com os da literatura CONCLUSO Comentar quais as concluses da aula pratica. Ser claro e objetivo nas concluses. Algumas poucas linhas so suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA
1. OBJETIVOS
Dosagens de espcies qumicas mediante a absoro de luz. 2. FUNDAMENTOS A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatria, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda ( , expressos em m ou nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matria, sendo que parte de sua energia absorvida por eltrons da eletrosfera dos tomos constituintes das molculas.

Uma soluo quando iluminada por luz branca, apresenta uma cr que resultante da absoro relativa dos vrios comprimentos de onda que a compem. Esta absoro, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substncia, de usa concentrao e da espessura da mesma que atravessada pela luz. A Lei de Lambert-Beer: a absorbncia proporcional concentrao da espcie qumica absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relao linear entre absorbncia ou densidade tica e concentrao, e de uma relao logartmica entre transmitncia e concentrao.

b Io I

c= concentrao da espcie qumica absorvente b= espessura atravessada pelo feixe luminoso Io= intensidade de luz incidente I= intensidade de luz emergente (transmitida) I < Io Io Ab = D.O. = K.b.c = log (absorbncia ou densidade tica) I A Transmitncia ou Transmisso (T%), corresponde a: I Io I T = 100 x Io 100 T I como, Io
=

T , temos que : 100

Io = I

100 T

Io portanto, log I logo, Ab = log 100 - log T Ab = 2 log T = log

100 T

Fotocolormetro:

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotmetro com cubetas - Pipetas de 5 mL graduadas - Estante com tubos de ensaio 3.2. Reagentes - Alaranjado de Metila: Concentrao: ______ - Azul de Bromofenol : Concentrao: ______ 3.3. Procedimento: A. Coleta de dados para a construo do espectro de absoro do Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).
Usando gua destilada como referncia, efetuar as leituras de Absorbncia (ou D.O.) do Alaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)

Preencher os dados da tabela 1 abaixo, de acrdo com o corante escolhido pelo grupo:
CORANTE: ALARANJADO DE METILA
(nM) 400 420 44 460 480 500 520 550 600 650 700 Leitura T(%) Absorbncia

CORANTE: AZUL DE BROMOFENOL

(nM) 400 440 490 520 540 565 580 590 620 660 700 Leitura T (%) Absorbncia

Utilizando os dados da tabela acima preparar um grfico ( x = comprimento de onda nm )e (y = leitura em absorbncia), encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absoro do corante usado em aula.
Abs

Qual o comprimento de onda correspondente ao Pico de absoro da luz? ____________

B. Demonstrao da Lei de Lambert-Beer: Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue; o tubo no 6 estar contendo soluo do corante com concentrao desconhecida, a qual dever ser determinada atravs da Lei de Lambert-Beer.
Tabela 2:
TUBO GUA CORANTE* CONCENTRAO TRANSMITNCIA ABSORBNCIA OBTIDA (No) (mL) (mL) (T%)** (Abs ou D.O.)

( g/mL) 0 1 2 3 4 5 6 5 4 3 2 1 0 5 mL 0 1 2 3 4 5
Encontrar no grfico

* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol ** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absoro do composto ( max). 4. RESULTADOS A SEREM APRESENTADOS NO RELATRIO:

4.1. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbncia atravs de tabela ou clculo. 4.2. Construir um grfico da Absorbncia (Abs) em funo do comprimento de onda ( ) e determinar o pico de absoro ( max) do composto estudado. 4.3. Completar a tabela 2 calculando as concentraes do corante nos diversos tubos 4.4. Construir um segundo grfico apresentando as variaes de Densidade tica (D.O.) ou Absorbncia (Abs) em funo da concentrao da espcie qumica absorvente e um terceiro grfico apresentando as variaes de Transmitncia em funo da concentrao. 4.5. Apresentar o valor da concentrao do corante no tubo 6 mediante interpolao da leitura de Absorbncia no grfico (Abs x concentrao).
Abs Transmitncia

Concentrao

Concentrao

5. ANLISES DOS RESULTADOS E CONCLUSES

Discutir os resultados e listar as concluses obtidas durante os experimentos realizados em classe.

6. BIBLIOGRAFIA

Listar as referncias bibliogrficas utilizadas para preparar o relatrio.

DETERMINAO DE LACTOSE NO LEITE (MTODO DE SOMOGY & NELSON)

1. OBJETIVO Quantificar o teor de lactose em amostra de leite pelo mtodo de Somogy-Nelson. 2. FUNDAMENTO DO MTODO A lactose, dissacardio redutor, reduz o on cprico do reativo de SOMOGYI a xido cuproso, em meio alcalino e a quente. Em seguida, o xido cuproso reage com o anion arseno-molibdato do reativo de NELSON produzindo um composto de colorao azul (xidos de molibdnio, Mo2O3, com max = 540 nm).

Dentro de certos limites, a intensidade da colorao azul diretamente proporcional quantidade de lactose na amostra. Antes da reao quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada, mediante precipitao de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.

3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Equipamentos e vidrarias - Espectrofotmetro - Centrfuga de mesa - Banho-maria (ebulio) - Balo volumtrico de 100 mL - Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrfuga - Pipetas 3.2. Reagentes - Hidrxido de brio 0,3N - Sulfato de zinco 5% - Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato monocido de sdio e 40 gramas de tartarato duplo de sdio e potssio em 700 ml de gua. Adicionar 100 ml de NaOH 1N. Gotejar, sob agitao constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar 180 gramas de sulfato de sdio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37oC. Filtrar antes do uso. - Reativo de Nelson: dissolver 25 gramas de molibdato de amnio em 450 ml de gua destilada. Cuidadosamente, adicionar 26 ml de cido sulfrico concentrado. Adicionar 3 gramas de arseniato dibsico de sdio dissolvido em 25 ml de gua. Manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso. - Padro de lactose: dissolver 0,100 gramas de lactose pura em um litro de gua. Esta soluo conter 100 g/ml. 33. Reta Padro a) Tomar 6 tubos de ensaio e numer-los de 0 a 5. Adicionar 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1.0 mL da soluo padro de lactose contendo (100 microgramas/mL = 100 g/mL) e completar o volume a 1.0 mL com gua destilada. b) Acrescentar em cada tubo 1.0 mL do REATIVO DE SOMOGYI e agitar. Deixar em banho-maria fervente por 10 minutos. Esfriar em gua corrente. c) Adicionar 1.0 ml do REATIVO DE NELSON e agitar. Completar o volume a 10 mL, adicionando 7 ml de gua destilada. d) Fazer leitura em espectrofotmetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:

10

TUBO (No)

GUA (ml)

Lactose (mL)

Conc. Obtida ( g/mL)

Reat. Somogy (mL)

Banho Maria (min)

Reat. Nelson (mL)

Compl. Vol. (10 mL)

Transmit. Absorb. (T%)

Absorb.

0 1 2 3 4 5

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

10 10 10 10 10 10

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL 7 mL

3.4. Preparo das amostras de leite Cada grupo receber 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida temperatura ambiente. a) Transferir 1 mL (com pipeta volumtrica) da amostra de leite para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua destilada. Agitar bem. b) Transferir 1 mL (com pipeta volumtrica) da soluo diluda de leite para tubo de centrfuga. Efetuar a remoo dos interferentes pela adico de 1,0 mL de ZnS0 4 a 5% (agitar) e acrescentar 1,0 mL de hidrxido de brio 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de gua destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm). 3.5. Determinao do teor de lactose no leite Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como segue na tabela abaixo:
TUBO Volume (mL) Reat. Somogy (mL) Banho Maria ( min.) Reat. Nelson (mL) Compl. Vol. Transmit. Absorb. (10 mL) (T%) Absorb.

Concen t.
(g/mL)

Leite Ambiente

1.0 1.0

1.0 1.0

10 10

1.0 1.0

7 mL 7 mL

Leite Geladeira

4. RESULTADOS
11

4.1. Construir um grfico com as concentraes de lactose nas abcissas ( g de lactose por tubo) e as leituras de Absorbncia dos padres (tendo subtrado o valor da leitura da prova em branco, ou seja do tubo no 0), nas ordenadas. 4.2. Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite utilizando os dados de , fazendo-se a interpolao na reta padro obtida no item acima. Colocar no grfico os resultados de concentrao de lactose encontrados 4.3. Expressar os resultados em g/100 mL de leite, observar que a amostra de leite analisada foi diluida 1:100. 5. DISCUSSO DOS RESULTADOS a. Discutir os resultados obtidos de acrdo com a concentrao de lactose encontrada nas amostras de leite mantidas em temperatura ambiente e refrigerada. Os resultados obtidos foram os esperados? b. Qual ou quais as razes para que os resultados da concentrao de lactose no leite mantido na temperatura ambiente e refrigerada no so iguais? Como a temperatura afeta a qualidade do leite? 6. BIBLIOGRAFIA USADA
Listar as bibliografias utilizadas para preparar o relatrio

12

CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO

Este o tipo que ser utilizado na aula prtica. Usualmente, trabalha-se com papel Whatmann, com a devida especificao (nmero 4 por exemplo). Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente: a) Cromatografia - consta de papel devidamente tratado, ou seja, cortando de acordo com as dimenses da cmara onde ser colocado, no qual fizemos manchas de solues padres ou de solues problemas. b) Cmaras cromatogrficas - so os recipientes, hemeticamente fechados, onde os cromatogramas sero desenvolvidos; c) Linha bsica - a linha traada, geralmente a trs centmetros do bordo inferior do papel, sobre o qual distribumos as manchas de solutos. Alguns cuidados que devem ser tomados: a) antes de ser iniciar o processo cromatogrfico, a cmara, contendo a mistura de solvente, j deve estar saturada de seus vapores, b) o solvente no deve correr at o bordo superior do papel (cuidado com o nmero de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distncia. De preferncia at uns 2 a 3 cm de processamento) e nem tampouco uma pequena distncia. De preferncia at uns 2 a 3 cm de bordo superior. Os tipos de cmara cromatogrfica variam de tamanho e forma, desde as mais bem trabalhadas, at a um simples tubo de ensaio ou proveta. As modalidades de cromatografia em papel so as mais variadas possveis. Temos cromatografia ascendente e descendente, mono e bidimensional, vertical e horizontal. Mais orientaes a respeito sero fornecidas pelo professor durante a aula. Clculo de Rf ( Fator de Reteno) Imaginemos o seguinte diagrama

limite at onde o solvente atingiu sentido em que o cromatograma foi desenvolvido a c a b c linha bsica 13 b d

Chama-se de Rf a relao existente entre a distncia percorrida pelo soluto (at o centro da mancha), pela distncia total percorrida pelo solvente. Assim: Rfa = a/d Rfb = b/d Rfc = c/d

Os valores de Rf fornecem uma orientao quanto distribuio dos solventes ao longo do papel. Teoria sobre Rf (equao de Martin e Synge) Chama-se de Rf a relao: Al Al + a As onde: a = coeficiente de partio As = rea ocupada pelo soluto na fase estacionria Al = rea ocupada pelo soluto na fase mvel Solventes usados em cromatografia: De acordo com as substncias a serem cromatografadas, utilizamos solvente os mais diversos Fenol - gua (80: 20) Usado para cromatografia de aminocidos. Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente. Butanol: HaO (4: 1: 1) Tambm empregado na cromatografia de aminocidos, acares etc. Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1) Existem basicamente trs modos de revelao a) Pelo uso da luz ultra-violeta: empregado quando os compostos possuem ncleo que revelam o comprim,ento de onda ao nvel do U.V; b) Uso de reagentes: comumente utiliza-se para acares e imerso na seguinte soluo: 1 ml de anilina + 1g de difenilamina + 100 ml de acetona + 10 ml de H2PO4 a 85%. Para aminocidos puveriza-se o papel com soluo de ninhidrina a 0,3% em lcool (usado nesta aula) Para cidos orgnicos pulveriza-se o papel com a seguinte soluo: 1g de xilose + 3 ml de gua + 1 ml de anilina + 100 ml de lcool metlico; 14

PARTE PRTICA 1) Preparao do papel de filtro Examinar a cmara cromatogrfica e planejar as dimenses do papel. Tome muito cuidado para no tocar o mesmo com os dedos, visto que h contaminao com aminocidos da mo. Cada grupo montar um cromatograma. 2) Padres de aminocidos: arginina, cido glutmico. leucina e prolina Preparar padres de aminocidos 0,01 M e guard-los no congelador. Cada grupo receber trs padres diferentes com a finalidade de comparar estas trs manchas com as produzidas pela amostra problema (esta ser fornecida pelo professor). Montagem do cromatograma Traar numa linha bsica a 3 cm da base do papel e deixar 2 cm de bordadura Distribuir as solues a serem analisadas no papel dentro nos pontos marcados Em seguida fazer manchas da rea aproximada de 0,5 cm2 utilizando um volume de 40-50 microlitros usando micropipetas. Secar as manchas conforme instrues dadas pelo professor Adaptar o cromatograma cmara tomando sempre o cuidado de no toc-lo com os dedos.

Mistura

aa1

aa2

aa3

aa 4

3 cm

Deixar o cromatograma correndo at que o solvente atinja uns 2 ou 3 cm abaixo do bordo superior do papel Em seguida retire-o e deixe secar. Aps a secagem pulverizar ninidrina a 0,3% em soluo alcolica. Levar o cromatograma estufa temperatura de 60 - 65oC at aparecimento de manchas coloridas Determinao do Rf: Marcar o limite at onde o solvente atingiu (front). 15

Medir a distncia da linha bsica at o front(d) , marcar o centro das manchas A, B, C e D. Verificar as distncias d A, d B, d C, e d D, que vo desde a linha bsica at o centro de A, B, C e D. Calcular os Rfs dA Rfa = d dB d

Rfb =

RESULTADOS E DISCUSSO 1. Escrever quais os aminocidos estudados em classe e a colorao deles na reao com ninidrina 2. Apresentar Rf dos aminocidos utilizados no experimento 3. Qual aminocido apresentou maior Rf e porque? 4. Qual aminocido apresentou menor Rf e porque? 5. Os aminocidos apresentaram colorao diferente? Porque? 6. Quais aminocidos esto presente na mistura? 7. Quais as aplicaes da metodologia da cromatografia?

BIBLIOGRAFIA Listar as bibliografias utilizadas na preparao do relatrio

16

DETERMINAO DO TEOR DE CASEINA NO LEITE (PELA REAO DO BIURETO)

1. FUNDAMENTO DA METODOLOGIA As protenas podem ser dosadas em diversos materiais biolgicos por vrias metodologias. A reao do Biureto, que utilizada para a caracterizao de protenas, pode ser empregada para a quantificao das mesmas mediante a colorimetria. O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as protenas formam um complexo com o on cprico (Cu++) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absoro a 540 nm. A reao positiva para peptdios constitudos de no mnimo de trs aminocidos. Tal complexao tambm ocorre com o biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), da o nome da reao.

complexo de cor violeta (prpura) 2. MATERIAL E MTODOS: Equipamentos e Vidrarias: ESPECTROFOTMETRO (540 nm) Estante com 7 tubos de ensaio 1 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 10 mL Reagentes: Reagente do Biureto Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sdio e potssio, dissolv-los em gua destilada completando o volume a aproximadamente 500 ml. Juntar, sob agitao, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.
17

Padro de Casena (5 mg/mL) - dissolver 2,5g de casena em 500 mL de NaOH 0,1 N 3. PROCEDIMENTO ANALTICO 1. Transferir 1 ml de leite (pipeta volumtrica) para tubo de ensaio e completar o volume com 9 ml de gua destilada (esta soluo corresponde ao leite diludo 1:10). Agitar bem. 2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro abaixo. 3. Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos. A colorao prpura formada indicativo da presena de protenas. 4. Fazer leitura de Transmitncia a 540 nm em espectrotofmetro e converter em Absorbncia com auxlio de tabela (Ab = 2 - log T). 5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, fazer um grfico em papel milimetrado contendo no eixo Y os valores de Absorbncia ou Leitura e no eixo X as concentraes de casena expressas em mg/tubo. 6. Interpolar o valor de leitura da amostra de leite diludo e calcular a concentrao de casena no leite expressando o valor em mg/100 mL de leite.
TUBO (NO) 0 1 2 3 4 5 6 GUA CASENA DESTIL. (6 mg/mL) 4.0 0.0 3.5 0.5 3.0 1.0 2.5 1.5 2.0 2.0 1.5 2.5 1 mL leite diludo (1:10) CASENA (mg/tubo) REATIVO BIURETO 5 5 5 5 5 5 5 Transmitncia (%) ABSORB. 540 nm ABSORB. 540 nm 0

4. RESULTADOS E DISCUSSO:
1. Completar tabela 2. Grfico com os valores de absorbncia (y) e concentrao (x) 3. Determinar o valor da concentrao de casena no leite atravs do grfico e dar o resultado em mg/100mL de leite 4. Discutir o valor encontrado em relao ao valor nutricional do leite. 5. O qu ocorre com a casena do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6.5?
ABSORB. (540 nm)

Concentrao (mg/tubo) 6. BIBLIOGRAFIA

18

DETERMINAES DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km)

E DA VELOCIDADE MXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA 1. OBJETIVOS Determinar os parmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como substrato, mediante o estudo cintico da reao. 2. FUNDAMENTOS As reaes qumicas conduzidas pelos organismos vivos so, na sua grande maioria, catalizadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatveis com as exigncias metablicas. Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermdio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, acares esses que so absorvidos pela clula. A membrana plasmtica impermevel sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrlise ocorrer fora da clula de levedura. No presente experimento a invertase ser obtida de levedura de panificao (fermento Fleischmann) e adicionada sacarose (acar no redutor), cuja hidrlise resulta na formao de acares redutores (glicose e frutose) que sero estimados pela reao de Somogyi-Nelson.

Para tal se colocar a enzima frente diferentes concentraes de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reao enzimtica, permitindo, mediante um tratamento matemtico adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm.
19

3. MATERIAL 3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotmetro - Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) - 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) - 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) - 1 pipeta volumtrica de 1 mL (por grupo) - Centrfuga e banho-Maria para dosagem de acares redutores 3.2. Reagente - 4 g de fermento prensado tipo Fleischmann - Reagente de Somogyi - Reagente de Nelson - Padro de acar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL) - Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L) 4. PROCEDIMENTO 4.1. Extrao da enzima Transferir 4 g de fermento de panificao para tubo de centrfuga, adicionar 20 mL de gua destilada e deixar em estufa a 37oC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contm a enzima invertase. Fazer uma diluio de 1:100 ou 1:200 (a critrio do professor). 4.2. Ensaio enzimtico Em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, pipetar os volumes (em mL) das solues conforme indica o quadro que se segue:

TUBO (NO) 0 1 2 3 4 5 6 7

SACAROSE 12,5 mM 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,0 2,5 mL de padro

GUA 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0,5 contendo 100 ug

INVERTASE DILUDA 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 de glicose

20

Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrlise da sacarose, resultando na formao de glicose e frutose (acares redutores), os quais podem ser determinados pela reao de Somogyi-Nelson. 4.3. Reao para dosagem de acares redutores. To logo termine o perodo de incubao acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reao enzimtica paralizada pela desnaturao da invertase, quer pela ao do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente). Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfri-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de gua destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm. 5. ANLISES DOS RESULTADOS E DISCUSSO Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue. TUBO T% D.O. [S]* V** 1 1 D.O. O 530 nm 530 nm 530 nm [S] V (N ) 0 0 mM 1 2 mM 2 4 mM 3 6 mM 4 8 mM 5 10 mM 6 7 * [S] = concentrao de substrato (sacarose) no meio de reao enzimtica expressa em milimolaridade mM. ** V = velocidade de reao enzimtica expressa em g (micrograma) de glicose (acar redutor) formado por hora. PARA O RELATRIO: 1. Preencher a tabela 2. Transformar as leituras de densidade tica em quantidades de acar redutor 3. Calcular as velocidades de reao (V) para cada tubo. Com os dados construir os grficos V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S]. 4. Determinar analiticamente os valores de Km e Vmx e discutir os seus significados bioqumicos. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimento.
21

REAO DE HILL (FOTLISE DA GUA)

1. OBJETIVOS Avaliar a habilidade metablica do cloroplasto de promover a fotlise da gua, o primeiro passo na sequncia de reaes da fotossntese. 2. FUNDAMENTOS O processo fotossinttico, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas: a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotlise da gua acoplada com as produes de NADPH+H+ (fotorreduo) e de ATP (fotofosforilao), conforme a equao abaixo.
luz

NADP+ + ADP + Pi + H20

cloroplastos

NADPH + H+ + ATP +02

b) Fase escura: no depende de luz e corresponde reduo do CO2 ao nvel de carboidrato s expensas do NADPH+H+ e ATP.
escuro

NADPH + H+ + ATP + CO

NADP+ + ADP + Pi + C(H20)

cloroplastos

Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossinttico empregando cloroplastos isolados de espinafre, pretendia a reduo do C02 ao nvel de carboidrato. Por dificuldades tcnicas, limitadas pela poca, no conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado fotlise da gua com evoluo de 0 :
2

luz
2

Fe+3

H20
cloroplastos

Fe+2 + 2H+ +

02

Assim a produo fotoqumica de oxignio exige a presena de um aceptor de H+ e/ou eltrons, que necessariamente no precida ser o CO2.

22

No presente experimento ser utilizado como aceptor de eltrons (reagente de Hill) um indicador de xido-reduo, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada azul (com max ao redor de 540 nm) e na forma reduzida incolor, o que permite o acompanhamento da reao fotoqumica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.

3. MATERIAL 3.1. Equipamentos e Vidrarias - Colormetro com filtro no 54 - Tubos de colormetro (4 por grupo) - Centrfuga de mesa com tubos (10 ml) - Banho de glo - Almofariz com pistilo (1 para cada grupo) - Lmpada de 100 W (2) - Folha de alumnio - Banho maria (100oC) 3.2. Reagentes - Sacarose 0,35M - Tampo fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M - 2,6-diclorofenollindofenol (16 mg/100 ml) - cido ascrbico (cristais) 4. PROCEDIMENTO 4.1. Extrao dos Cloroplastos a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator.
23

b) Filtrar o homogeneizado em gase, ou algodo. c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o precipitado e centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 xg. (3000 rpm) d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampo fosfato 0,05 M (pH= 6,5) contendo sacarose 0,35 M. Manter em banho de gelo at o momento do uso. 4.2. Ensaio Preparar 4 tubos de colormetro conforme o quadro que se segue:
SUSPENSO CLOROPLASTO (mL) 1,5 (+ c.ascrbico) 1,5 1,5 TAMPO FOSFATO (mL) 3 3 3

TUBOS 1 2 3

2,6-DCF (mL) 0,5 0,5 0,5

OBSERVAES ajustar o zerodo aparelho ler imediatamente ler imediatamente e cobrir com folha de Alumnio

1,5 (ferver 3)

0,5

Os tubos 2, 3 e 4 so expostos luz de lmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo no 3 protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbncia (D.0) repetindo a operao 4 vezes. 5. ANLISES DOS RESULTADOS Anotar as leituras obtidas e fazer um grfico Discutir os resultados: a) Qual a funo do cido ascrbico? b) Qual a funo do 2,6 DCF? c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras d) Quais tubos ocorre fotossntese? Porque? e) Quais tubos no ocorre a fotossntese? Porque?

24

REDUTASE DE NITRATO EM PLANTAS

1. OBJETIVOS Verificar a habilidade de tecidos vegetais de reduzir o nitrato, o primeiro passo na utilizao metablica dessa forma nitrogenada, avaliando-se ainda o efeito da luminosidade. 2. FUNDAMENTOS O nitrato (NO3-) a forma nitrogenada mais abundante no solo e as plantas desenvolveram mecanismos bioqumicos para a sua utilizao. Para tal o NO 3- reduzido a NO2- pela enzima "redutase de nitrato"e a seguir o NO2- transformado em amnia (NH ) pela "redutase de nitrito. A amnia posteriormente assimilada
3

resultando nos compostos orgnicos nitrogenados. A redutase de NO3 estimulada pela luz e h indcios de que a atividade da mesma esteja relacionada com a capacidade de certas plantas em acumular mais protenas, o que tem sugerido o melhoramento gentico monitorado pela medida da atividade enzimtica. Tambm tem sido utilizada na avaliao da nutrio nitrogenada em diversas culturas. NO3 + NADH + H+ (nitrato)
(redutase)

NO 2 +

NAD+ + H O
2

(nitrito)

A atividade da enzima pode ser estimada pela quantidade de N02- formada que colorimtricamente dosada mediante reao com sulfanilamida e -naftilenodiamino, gerando um complexo colorido (diazo composto) com max em 540 nm. 3. MATERIAL 3.1. Equipamentos e Vidrarias
25

- Espectrofotmetro - Banho-Maria (37oC) - Perfurador (0,5 cm de dimetro) - Pinas - Estante com tubos de ensaio (8 tubos por grupo) - 5 pipetas graduadas de 5 ml (por grupo) 3.2. Reagentes - Sulfanilamida 1% em HCl 12 N - -naftilenodiamino 0,05% - Padro de NaNO2 10 M - Substrato tamponado (KNO3 200 mM em tampo fosfato 50 mM pH= 7.4) 4. PROCEDIMENTO a) Pesar 100 mg de discos foliares (0,5 cm de dimetro), de folhas iluminadas e de folhas mantidas ao abrigo da luz, transferindo para tubos de ensaio. b) Incubar com 5 mL de substrato tamponado a 37oC por 1 hora, mantendo os tubos ao abrigo da luz (envoltos em folhas de alumnio). c) Paralizar a reao enzimtica pela adio de sulfanilamida 1% em HCl 2N e a seguir adicionar 1 ml de -neftilenodiamino 0,05%. d) Agitar, aguardar 5 minutos para a reao cromognica, remover os discos por filtrao e efetuar a leitura em fotocolormetro com filtro no 54. e) Paralelamente fazer reta padro fazendo-se reao conforme a tabela que se segue:
TUBO NO H2O DEST. NaNO2 10 M SULFANILAMIDA NAFTILENO DIAMINO LEITURA t% 540 nm Abs 540nm Abs 540 nm

0 1 2 3 4 5 6 7

5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 0 mL 5 mL folha Escuro 5 mL folha Claro

1 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 0 0

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 mL 1 mL 1 mL

26

5. RESULTADOS e DISCUSSO Com os dados obtidos estabelecer a reta padro (leituras na ordenada contra concentraes de N02- na abcissa) e mediante interpolao na reta calcular as atividades de Redutase de Nitrato, expressando os valores em moles de nitrato reduzido por hora por g de tecido foliar fresco ( moles, g-1 h -1). Discutir os resultados: 1. Porque a diferena encontrada entre os resultados das folhas mantidas no claro em relao as folhas mantidas no escuro? 2. Qual a importncia da luz no processo de reduo do Nitrato? REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967, p.1. HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology, 35: 700-708 (1960). HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In "Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103. JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p. LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p. MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioqumica Experimental. Ao Livro Tcnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p.
VILLELA, g.g.; BACILA, M. e TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522 p.

VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica. Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p. WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

27

QUESTIONRIO 1 ASSUNTO: CARBODRATOS E LIPIDEOS 1.Defina ligao hemicetal demonstrando um exemplo atravs de uma cetose e uma aldose (ciclo hexose). 2.Escreva a frmula cclica (projeo) dos principais monossacarideos (hexoses). Considere as posies D,L, e 3.A molcula de D- - glicose difere em que de uma molcula de D- glucose? 4.Explique resumidamente: (1) Como se faz a numerao da cadeia de um monossacardeo; (2) Diferencie posio D,L,(+) e (), 5.Escreva as frmulas de: sacarose, maltose, lactose e celobiose. 6.O que so ligaes glicosdicas dos tipos a ( 1,4) e a ( 1,4)? 7.Diferencie os polissacarideos amido, glicognio e celulose quanto s ligaes glicosdicas. Esquematize as trs macromolculas e fale de suas funes. 8.Como se dividem os polissacarideos? D exemplos. 9.O que so dextranas, frutanas e hemicelulose? 10.O que so N-glicosideos, o-metlicos, acares-alcois e amino-acares 111. Citar as funes dos lipdeos nos seres vivos. 12.Qual a importncia do ndice de saponificao e ndice de iodo (em relao ao peso molecular e grau de insaturao) nos cidos graxos , gorduras e leos. 13.Escreva a relao entre ponto de fuso e solubilidade quanto ao peso molecular, estrutura e grau de insaturao de lipdeos. 14.O que ocorre na rancificao oxidativa? Qual o papel dos antioxidantes? Cite exemplos. 15.Citar as caractersticas necessrias para que uma molcula funcione como sabo ou detergente. 16.Quais os componentes estruturais de uma cera e o tipo de ligao entre elas? 17.Que so cidos graxos saturados, insaturados e poliinsaturados?. D exemplos. 18.Quais as funes dos triglicerdeos? Que tipo de ligao existe? 19.Qual a funo dos fosfolipideos? Escreva um exemplo, dando sua 28

importncia. 20.Testosterona e Progesterona pertencem a que classe de lipideos? Porque? QUESTIONARIO 2 1.Escreva as classificaes dos aminocidos de acordo com a cadeia lateral. 2. Cite dois exemplos de cada classe 3 Escrever a reao entre dois aminoacido, identificando a ligao peptidica. 4. Explicar o que significa ponto isoeltrico de um aminocido. 5 . Citar a carga de um aminocido abaixo e acima de seu ponto isoeletrico. 6. Representar a ligao peptidica.. 7 O que vem a ser a estrutura primaria, secundaria, terciria e quaternria de uma protena? 8. Citar os tipos de ligao responsveis pelas estruturas secundaria e terciria da protena 9. O que vem a ser desnaturao de uma protena, e que agentes causam esta desnaturao? 10. Definir protena simples e conjugada. De exemplos. 11.O que vem a ser velocidade de uma reao enzimtica? 12. Qual a explicao de Michaelis Mentem para o modo de ao de uma enzima? 13. Qual o conceito desitio ativo? 14.Escreva graficamente a comparao entre as energias de ligao de uma reao catalisada e uma reao no catalisada. 15.Que vem a ser inibidor competitivo e no competitivo? 16.O que uma enzima alosterica? 17. Qual o efeito da temperatura em uma reao enzimtica? 18.Qual o efeito do pH em uma reao enzimtica? 19.Q que cofator enzimtico? 20.O que so coenzimas ? de exemplo QUESTIONARIO 3 1) Escreva graficamente a comparao entre as energias de ativao de uma reao catalisada e de uma reao no catalisada. 2) Qual o conceito de sitio ativo? 3) Qual o significado da constante de Michaelis e Menten? 4) O que gliclise? 5) Localizao celular da gliclise. 6) Qual a relao entre insulina e gliclise? 7)A frutose pode ser utilizada na gliclise? 8) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104. Porm na clula a reao se desloca no sentido da degradao da frutose. Por qu? 29

9)Qual o efeito da adrenalina sobre a gliclise? 10) Explicar o balano de ATP no processo da gliclise. 11) Qual a relao entre abate de animais e descanso? 12)0 que significa formao de ATP a nvel de substrato? 13)0 que gluconeognese? 14) Qual a importncia da gluconeogenese? 15) Como pode ser utilizada a fermentao alcolica para a produo de glicerol? 16) Mecanismo de formao do glicerol. 17) Quais as diferenas entre gliclise e fermentao alcolica? 18) Destacar a importncia da nicotinamida (vit. do complexo B) na gliclise. 19) Qual a importncia do ciclo das pentoses? 20) Localizao celular do ciclo das pentoses. 21) No que consiste o ciclo das pentoses? 22) Comparar gliclise com ciclo das pentoses. 23)Destacar a importncia de elementos minerais no ciclo das pentoses. 24)Como voc pode determinar, na prtica, se um tecido est realizando gliclise ou ciclo das pentoses? 25) Porque h necessidade do ciclo de Krebs para a oxidao do acetilCoA? 26) Quais os produtos do ciclo de Krebs? 27) Quais so as enzimas regulatrias do ciclo de Krebs? 28) Qual o significado do ciclo de Krebs? 29) Quais os inibidores do ciclo? 30) Que significa cadeia respiratria? 31) Qual a produo de ATP atravs da oxidao total de uma molcula de glicose? 32) Quais os venenos respiratrios? 33) Que composto o ltimo aceptor de eletrons na cadeia respiratria? 34) Qual a diferena entre ATP e GTP ?

30

QUESTIONARIO 4 (GLICLISE, CICLO DE KREBS E CADEIA RESPIRATORIA) 1. O que vem a ser gliclise? 2. Em que regio da clula se processa a gliclise e qual a sua finalidade? 3. O que vem a ser balano de coenzimas e por que ele nulo em anaerobiose? 4. Quais os substratos e os produtos do metabolismo anaerbico dos carboidratos? 5. Qual o rendimento energtico obtido por uma clula muscular ao degradar anaerobicamente a glicose? Por que este rendimento superior quando se utiliza glicognio como substrato? Dados: ADP + Pi ATP ( G=-8.000 cal/mol) C6H1206 2C3H603 ( G=-47 .000cal/mol) 6. O que vem a ser malte e qual a sua funo na produo de etanol a partir de cereais? 7. Qual a vantagem do abate de animais descansados luz do metabolismo anaerbico nas clulas musculares? 8. Em que se fundamenta a conservao de alimentos (coalhadas, iogurtes, ensilagem, picles, etc.) ao se propiciar a fermentao ltica? 9. Quais as funes do Ciclo de Krebs? Onde ele se processa? 1O.Quais as funes da Cadeira Respiratria? Onde ela se processa e por que a mesma est acoplada ao Ciclo de Krebs? 11 .Qual a diferena entre veneno respiratrio e desacoplador da fosforilao oxidativa? 12.Qual a diferena entre fosforilao oxidativa e fosforilao ao nvel de substrato? Qual a mais significativa em condies de aerobiose, por que? 13. Qual o rendimento energtico obtido por uma clula ao oxidar completamente a molcula de glicose? Quantos ATPs so produzidos pela fosforilao oxidativa e quantos pela fosforilao ao nvel de substrato? Dados: C6H1206 + C02 + H2O ( G=-686.000 cal/moI)

14.Quantos ATPs so produzidos pela combusto biolgica completa do acetil-CoA, piruvato, lactato e etanol? 15.Qual a vantagem da membrana interna da mitocndria se apresentar enrugada? 31

16.Como se explica a ao txica do flor acetato (principio txico de algumas plantas) sobre o Ciclo de Krebs? 17.Como se explica a ao txica do cianeto na Cadeia Respiratria?

QUESTIONRIO 5 SOBRE VIA PENTOSE FOSFATO, METABOLISMO DOS TRIGLICERIDIOS, METABOLISMO DEGRADAT1VO DAS PROTEINAS E AMINOCIDOS E EXCREO DO NITROGNIO. 1.Cite duas diferenas e duas semelhanas entre gliclise e via pentose fosfato. 2.Quais as finalidades da via pentose fosfato e em que regio da clula ela opera? 3.Comparando-se as glndulas mamrias e o msculo esqueltico em quais desses tecidos predomina a via pentose fosfato? Justifique. idem para os tecidos vegetais jovens e maduros. 4.Qual a importncia energtica quantitativa e qualitativa dos triglicerdios de nossa dieta? 5.O que resulta da beta-oxidao dos cidos graxos? Onde ela se processa e quais os destinos dos seus produtos? 6.Quantos ATPs seriam obtidos por uma clula ao oxidar completamente o triglicerdio abaixo estruturado? CH2- O - CO - (CH2)13- CH3 CH-O-CO-(CH2)14-CH3 CH2- O-CO - (CH2)
14

- CH3

7.Como a clula efetua a dessaturao dos cidos graxos? Como ela est relacionada com a aclimatao de certas plantas em ambientes mais frio? 8.Por que as protenas devem estar presentes em nossa dieta? Podem elas, e como, atender a demanda energtica de nosso organismo? 9. O que vem a ser aminocido essencial? Cite 3 deles para o homem. 10.0 que vem a ser balano ntrogenado? Por que ele nulo em animais adultos e negativo quando de uma dieta deficiente em aminocidos essenciais? 11. O que vem a ser reao de transaminao? Cite uma delas e comente a sua importncia. Idem para reao de descarboxilao de aminocido. 12. Quais as formas nitrogenadas de excreo utilizadas pelos organismos animais? Que propriedades de solubilidade e toxidez apresentam? 13.Por que a uria a forma n~trogenada de excreo mais adequada 32

para os mamferos? Idem quanto ao cido rico para as aves. 14. Por que animais com habilidade metablica para excreo de uria ou cido rico voltam a excretar nitrognio amoniacal quando em ambiente com grande disponibilidade de gua?

QUESTIONARIO 6 INTEGRAO DO METABOLISMO, REGULAO METABLICA, FOTOSSINTESE E CICLO DO NITROGNIO 1.Quais so as etapas (fases) pelas quais passam polissacardios, triglicerdios e protenas para atender demanda de energia (ATP) por parte da clula? 2.Com que eficincia aprisionada a energia das ligaes steres, glicosdicas e peptdicas na fase de hidrlise dos alimentos? 3.Quais so os 3 compostos chaves do metabolismo degradativo dos carboidratos, lipdios e protenas? Quais os seus destinos? 4.Esquematize a formao de triglicerdio a partir de carboidrato. 5. Esquematize a formao dos cidos glutmico, asprtico e alanina a partir de uria e acar de melao no rumen bovino. Porque a uria tem que ser fornecida juntamente com uma forma facilmente metabolizvel de acar? 6.O que vem a ser aminoacido glicognico? Cite 3 deles. Qual a importncia deste fato para o metabolismo animal? 7. O que vem a ser corpos cetnicos e como so formados em nosso organismo? Em que condies fisiolgicas tais compostos se mostram com contedos mais elevados na urina e no sangue? 8.Podem os triglicerdios ser convertidos em acar no organismo animal? Por que? 9.O que vem a ser Ciclo do Glioxilato? Em que organismos ocorre e qual a sua funo bioqumica? Porque tal ciclo particularmente ativo durante a germinao de sementes oleaginosas? 10.0 que vem a ser Efeito Pasteur e como ele explicado bioqumicamente? 11.Por que uma adubao nitrogenada excessiva por acarretar o acamamento em certas culturas? 12.Como o excesso de amnia pode comprometer o metabolismo das clulas nervosas (crebro) levando ao coma cerebral? Como a intoxicao com etanol leva ao mesmo quadro clnico? 13.Porque o diabtico bebe mais gua que o indivduo saudvel? 14.Quais os eventos que dependem e quais os que no dependem da luz quanto formao de glicose por uma planta fotossintetizadora? 15.Por que as luzes de comprimentos de onde de 450 e 650 nm so mais eficientes para a realizao de fotossntese pelas plantas superiores? 33

16.Quais as funes dos carotenides no processo fotossinttico conduzido pelas plantas? 17.Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo fotossinttico? 1 8.Como so estruturados os sistemas de pigmentos para a captao da energia radiante para a conduo da fotossntese? 19.Qual a funo da gua no processo fotossnttico? 20. 0 que fica demonstrado quando se observa a reduo do 2,6diclorofenolindofenol por cloroplastos iluminados (reao de Hill)? 21. 0 que vem a ser foto-reduo do NADP + e fotofosforilao do ADP? 22. Qual o primeiro composto formado pela assimilao do CO2 mediante a via C-3 de fixao? Idem para a via C-4. Quais as enzimas envolvidas nesta etapa e suas afinidades para com o CO2? 23.Que adaptaes ocorreram nas crassulceas que lhes permitem a Me sobrevivncia em ambientes quentes e ridos? 24.0 que vem a ser fotorrespirao? Qual o seu substrato e porque pouco intensa nas plantas C-4? Qual a importncia da luz e do 02 neste processo? 25.Cite 4 diferenas entre plantas C-3 e C-4 (exceto foto-respirao). 26.Por que as plantas C-4 so menos exigentes em nitrognio quando comparadas com as C-3? 27.Porque as plantas C-4 fazem fotossntese com boa eficincia mesmo em temperaturas mais elevadas? 28. Porque a fotossntese nas plantas C-4 no atinge a saturao mesmo com grande intensidade luminosa? 29.0 que vem a ser ponto de compensao e por que menor para as plantas C-4? 30.Porque o nitrato a forma nitrogenada mais abundante no solo? Existiria alguma vantagem para as plantas? 31 .Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons no processo fotossinttico matam a planta? 32.0 que vem a ser reduo do nitrato? Quais as participaes do ferro e molibdnio neste processo? 33.0 que vem a ser fixao do nitrognio? Quais as modalidades de fixao do N ? 34. 0 que vem a ser assimilao da amnia e quais a vias metablcas envolvidas? 35. 0que vem a ser nitrificao e qual a importncia agronmica para essa transformao? 36.0 que vem a ser desnitrificao? Que organismo est envolvido e com que objetivo tal processo conduzido? 37.Como que os herbicidas que bloqueiam o transporte de eltrons na fase luminosa da fotossntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta? 34

35

Tabela de Converso T em A x 1.000

00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 2.000 1.699 1.523 1.398 1.301 1.222 1.155 1.097 1.048 1.000 959 921 886 01 3.000 1.959 1.678 1.509 1.387 1.292 1.215 1.149 1.092 1.041 0.996 955 917 883 851 821 793 767 745 719 697 676 656 636 618 600 583 567 551 536 521 507 493 480 467 455 442 431 419 408 397 386 376 366 356 346 336 327 318 309 01 300 292 283 275 267 259 251 243 236 228 221 214 207 200 193 186 180 173 167 161 154 148 142 136 130 124 119 113 107 102 02 2699 1.921 1.658 1.495 1.377 1.284 1.208 1.143 1.086 1.036 0.991 951 914 879 848 818 790 764 742 717 695 674 654 635 616 599 582 565 550 535 520 506 492 479 468 453 441 429 418 407 396 385 375 365 355 345 335 328 317 308 02 299 291 282 274 266 258 250 243 235 228 220 213 206 199 192 186 179 173 166 160 154 148 141 135 130 124 118 112 107 101 ~ 2.523 1.886 1.638 1.481 1.387 1.276 1.201 1.137 1.081 1.032 0.987 947 910 876 845 815 788 762 738 714 693 672 652 633 614 597 580 564 548 533 519 504 491 478 465 452 440 428 417 406 395 384 374 364 354 344 334 326 316 307 03 298 290 281 273 265 257 249 242 234 227 220 213 206 199 192 185 178 172 166 159 153 147 141 135 129 123 117 112 106 101 04 2.398 1.854 1.620 1.469 1.357 1.268 1.194 1.131 1.076 1.027 0.983 943 907 873 842 812 785 759 735 712 690 670 650 631 613 595 578 562 547 532 517 503 489 476 463 451 439 427 416 405 394 383 373 363 353 343 333 325 315 306 04 298 289 281 272 264 257 249 241 234 226 219 212 205 198 191 184 178 171 165 159 152 146 140 134 128 123 117 111 106 100 05 2.301 1.824 1.602 1.458 1.347 1.260 1.187 1.125 1.071 1.022 0.979 939 903 870 839 810 783 757 733 710 688 688 648 629 611 503 577 561 545 530 516 502 488 475 462 450 438 426 415 403 393 382 372 362 352 342 333 324 314 305 05 297 288 280 272 264 256 248 240 233 225 218 211 204 197 190 184 177 171 164 158 152 146 140 134 128 122 116 111 105 100 06 2.222 1.796 1.585 1.444 1.337 1.252 1.180 1.119 1.066 1.018 0.975 938 900 866 836 807 780 764 730 708 686 666 646 627 609 592 575 559 544 529 514 500 487 474 461 449 437 425 413 402 391 381 371 361 351 341 332 323 313 305 06 296 287 279 271 263 255 247 240 232 225 218 210 203 197 190 183 177 170 164 157 151 145 139 133 127 121 116 110 105 099 07 2.155 1.770 1.569 1.432 1.328 1.244 1.174 1.114 1.060 1.013 0.971 932 896 863 833 804 777 752 728 706 684 664 644 625 607 590 573 558 542 527 513 499 485 472 460 447 435 424 412 401 390 380 370 360 350 340 331 322 312 304 07 295 287 278 270 262 254 246 239 231 224 217 210 203 196 189 182 176 169 163 157 151 144 138 133 127 121 115 110 104 099 08 2.097 1.745 1.553 1.420 1.319 1.237 1.167 1.108 1.056 1.009 0.967 928 893 860 830 801 775 750 726 703 682 662 642 623 606 588 572 556 541 528 511 498 484 471 458 446 334 423 411 400 389 379 369 359 349 339 330 321 312 303 08 294 286 277 289 261 253 246 238 231 223 216 209 202 195 188 182 175 169 162 156 150 144 138 132 126 120 115 109 103 098 09 2.046 1.721 1.538 1.409 1.310 1.229 1.161 1.102 1.051 1.004 0.963 924 889 857 827 799 772 747 724 701 680 660 640 622 604 587 570 554 539 524 510 495 483 470 457 445 433 421 410 399 388 378 368 358 348 338 329 320 311 302 09 293 285 277 268 260 253 245 237 230 223 215 208 202 194 188 181 175 168 162 156 149 143 137 132 126 120 114 109 103 097

824 796 770 745 721 699 678 658 638 620 602 585 569 553 538 523 509 495 481 469 456 444 432 420 409 398 387 377 367 357 347 337 328 319 310 00 301 292 284 278 268 250 252 244 237 229 222 215 208 201 194 187 180 174 167 161 155 149 143 137 131 125 119 114 108 102

854

36

80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99

097 092 086 081 076 071 066 060 056 051 046 041 036 032 027 022 018 013 009 004

096 091 086 080 075 070 065 060 055 050 045 040 036 031 026 022 017 013 008 004

096 090 085 080 075 070 064 059 055 050 045 040 035 031 026 021 017 012 007 003

095 090 085 079 074 069 064 059 054 049 044 040 035 030 025 021 016 012 007 003

095 089 084 079 074 069 063 058 054 049 044 039 034 030 025 020 016 011 007 003

094 089 084 078 073 068 063 058 053 048 043 039 034 029 025 020 015 011 007 002

094 088 083 078 073 068 062 057 053 048 043 038 033 029 024 020 015 011 006 002

093 088 083 077 072 067 062 057 052 047 042 038 033 028 024 019 015 010 006 001

093 087 082 077 072 067 061 057 052 047 042 037 032 028 023 019 014 010 005 001

092 087 081 076 071 066 061 056 051 046 041 037 032 027 023 018 014 009 005 000

37