UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA

Caracterizao Cariotpica de espcies de peixes do gnero Astyanax: uma contribuio para a anlise da biodiversidade do grupo

Aluno (a): Alessandra Ribeiro Torres Mariano

Orientador (a): Prof. Dr. Sandra Morelli Co-Orientador (a): Prof. Dr. Ana Maria Bonetti

UBERLNDIA, MG 2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA

Caracterizao Cariotpica de espcies de peixes do gnero Astyanax: uma contribuio para a anlise da biodiversidade do grupo

Alessandra Ribeiro Torres-Mariano Orientador (a): Prof. Dr. Sandra Morelli Co-Orientador (a): Prof. Dr.Ana Maria Bonetti

Tese

apresentada

Universidade

Federal de Uberlndia como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Doutor em Gentica e Bioqumica, rea de concentrao Gentica.

UBERLNDIA - MG 2010
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

T693c

Torres-Mariano, Alessandra Ribeiro, 1967Caracterizao cariotpica de espcies de peixes do gnero Astyanax : uma contribuio para a anlise da do grupo / Alessandra Ribeiro Torres-Mariano. - 2010. 79 f. : il. Orientadora:.Sandra Morelli. Coorientadora: Ana Maria Bonetti. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlndia, Programa de Ps-Graduao em Gentica e Bioqumica. Inclui bibliografia. 1.Peixe - Gentica - Teses. 2. Astyanax (Peixe) Gentica - Teses. I.Morelli, Sandra.II.Universidade Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Graduao em Gentica e Bioqumica. III. Ttulo. 597-115 CDU:

Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogao e Classificao

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA

Caracterizao Cariotpica de espcies de peixes do gnero Astyanax: uma contribuio para a anlise da biodiversidade do grupo

Aluno (a): Alessandra Ribeiro Torres-Mariano Comisso Examinadora: Presidente: Prof. Dr. Sandra Morelli Examinadores: Prof. Dr. Isabel Cristina Martins dos Santos Prof. Dr. Rodrigo Aparecido Fernandes Redondo Prof. Dr. Mrio Antnio Span Prof. Dr. Luiz Antnio Carlos Bertollo

Data da Defesa: 28/01/2010 As sugestes da Comisso examinadora e as Normas PGGB para o formato da tese foram contempladas.

_________________________________________ Sandra Morelli

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Dedico esse trabalho aos meus filhos Rassa e Leonardo, meus pais Ottoni e Marina.

O valor das coisas no est no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecveis, coisas inexplicveis e pessoas incomparveis. Fernando Pessoa

"Embora ningum possa voltar atrs e fazer um novo comeo, qualquer um pode comear agora e fazer um novo fim". Chico Xavier

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AGRADECIMENTOS Aos rgos de fomento pesquisa: CAPES, CNPq, FAPEMIG; Universidade Federal de Uberlndia; Ao Instituto de Gentica e Bioqumica e Coordenao da Ps-Graduao em Gentica e Bioqumica; Aos membros da banca examinadora: o Prof. Dr. Sandra Morelli o Prof. Dr. Isabel Cristina Martins dos Santos o Prof. Dr. Rodrigo Aparecido Fernandes Redondo o Prof. Dr. Mrio Antnio Span o Prof. Dr. Luiz Antnio Carlos Bertollo prof Dr Ana Maria Bonetti por me aceitar em seu laboratrio e dar dicas to preciosas no desenvolvimento do meu trabalho; Ao prof. Dr. Carlos Ueira Vieira pela amizade e por todos os ensinamentos e dicas durante a realizao dos experimentos; Ao Prof. Dr. Rodrigo Redondo por me orientar e ensinar os passos que deveriam ser seguidos para que eu atingisse o meu objetivo; Ao Prof. Dr. Fausto Foresti Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes, UNESP, Botucatu, SP por me dar a oportunidade de estar em seu laboratrio aprendendo e desenvolvendo parte desse trabalho; Patrcia Elda Sobrinho por ter cedido as sondas utilizadas no FISH duplo; Ao Prof. Dr. Francisco Langeani Neto UNESP So Jos do Rio Preto, SP que identificou os exemplares utilizados nesse trabalho; Ao Secretrio da Coordenao de Ps-Graduao Gerson Fraissat por todas as informaes e pela amizade; Ao tcnico do Laboratrio de Citogentica Animal Jos Clidenor dos Santos, pela companhia nas coletas e amizade; Aos colegas do Laboratrio de Citogentica Animal pela amizade e companheirismo, tornando agradvel o nosso local de trabalho;

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Aos colegas do Laboratrio de Gentica Molecular pela amizade, apoio e ensinamentos; s amigas Patrcia, Dbora e Rosangela: que a nossa amizade persista ao longo do tempo; Ao Sr. Joo Batista Dias Fazenda Lageado Crrego dos Caetano e Sr. Ivo Zanatta Fazenda Quilombo Crrego Quilombo, pela permisso de coletar os exemplares utilizados nesse trabalho, em suas propriedades; Aos meus filhos, Rassa e Leonardo, pelo tempo que gastei no desenvolvimento desse trabalho; minha me que me acompanhou e apoiou durante todos esses anos, em todos os momentos; Ao meu amigo, companheiro, namorado, marido e amante, Luiz Carlos Guilherme, que esteve sempre ao meu lado nos momentos felizes e nos momentos difceis da vida; Ao meu tio Otoniti que direta ou indiretamente participou da elaborao deste trabalho; A todos aqueles que de alguma forma participaram e me apoiaram na realizao desse trabalho; DEUS pela oportunidade de desenvolvimento do presente trabalho. minha orientadora Sandra Morelli: Obrigado pela oportunidade, mas mais do que isso, pela grande amizade. Com todos esses anos de convivncia, aprendi a admir-la e respeit-la cada vez mais...

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Lista de Figuras

Mapa destacando a localizao da bacia do Rio Araguari ......................................... 4 Foto de satlite retirada do software online Google Earth, mostrando a localizao dos pontos de coleta em relao ao Rio Araguari...................................................... 5 Karyotypes of A. eigenmanniorum from the Caetano Stream................................... 27 Metfase de A. bockmanni tratada com CMA3 ......................................................... 39 Metfase de A. bockmanni tratada com DAPI. ......................................................... 39 Metfase de A. bockmanni submetida tcnica de double FISH............................. 40 Foto de satlite retirada do software online Google Earth, mostrando a localizao dos pontos de coleta em relao ao Rio Araguari.................................................... 52 Caritipos de Astyanax sp. CC Astyanax sp. Q e Astyanax sp. A ......................... 54 Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando AgNORs ................................ 55 Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando stios CMA3 positivos ............. 56 Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A submetidas ao tratamento com DAPI .......... 57 Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando stios de DNAr 5S e 18S....... 58

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Lista de Tabelas

Chromosome number frequency found in Astyanax eigenmanniorum from de Caetano Stream ....................................................................................................... 28 Frmula cariotpica e nmero fundamental das 3 populaes de Astyanax do grupo A. paranae analisadas.............................................................................................. 52

Lista de Abreviaturas
2n a A AgNOR AR AT B CC CEMIG CMA3 DAPI DNA DNAr FISH GC IGS/ETS ITS Km m m MG NF NOR NTS Q RNAr sm st Nmero diplide Cromossomo acrocntrico Aude artificial da Fazenda Lageado Regio organizadora nucleolar impregnada com nitrato de Prata Arm ratio Adenina Timina Cromossomo supranumerrio Crrego dos Caetano Central Eltrica de Minas Gerais Cromomicina A3 Diamidino-2-fenilindol cido desoxirribonuclico cido desoxirribonuclico ribossmico Hibridao in situ fluorescente Guanina Citosina Espaadores transcritos externos Espaadores transcritos internos Quilmetro Cromossomo metacntrico Metros Minas Gerais Nmero fundamental Regio organizadora de nuclolos Espaadores no transcritos Crrego Quilombo cido ribonuclico ribossmico Cromossomo submetacntrico Cromossomo subtelocntrico

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Sumrio

Apresentao .........................................................................................................................1 1.Fundamentao Terica ......................................................................................................4 Introduo Geral .................................................................................................................5 1.1. Localizao e caracterizao dos locais de coleta ..................................................5 1.2. Consideraes sobre a famlia Characidae e o gnero Astyanax............................8 1.3. A citogentica na famlia Characidae, destacando o gnero Astyanax.................. 10 1.4. Genes ribossomais e hibridao in situ fluorescente (FISH).................................. 12 1.5. Referncias Bibliogrficas: .................................................................................... 17 2. B chromosomes in a population of Astyanax eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlndia, MG, Brazil) .................................................... 25 3.Caracterizao das regies organizadoras nucleolares e da heterocromatina do cromossomo B em Astyanax bockmanni, Vari & Castro, 2007 (Characiformes, Characidae) da bacia do Rio Araguari (Uberlndia, MG, Brasil) ............................................................ 34 3.1. Referncias Bibliogrficas: .................................................................................... 38 4.Localizao de stios ribossmicos 5S e 18S em trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae (Pisces, Characidae) da bacia do Alto Paran Uberlndia MG......................... 44 4.1. Introduo ............................................................................................................. 44 4.2. Material e Mtodos ................................................................................................ 46 4.3. Resultados e Discusso ........................................................................................ 47 4.4. Referencias Bibliogrficas ..................................................................................... 51 5. Consideraes e Concluses Finais ................................................................................. 62

RESUMO
Astyanax constitui um gnero numeroso da famlia Characidae, encontrado desde a Argentina at a fronteira do Mxico com os Estados Unidos. Nesse gnero j foram descritas quase 100 espcies, porm existem dificuldades na identificao delas por apresentarem morfologias muito similares. Nesse sentido a citogentica tem sido uma excelente ferramenta citotaxonmica. A espcie Astyanax bockmanni, anteriormente chamada de A. eigenmanniorum, foi descrita recentemente e est distribuda em riachos do Alto Paran, nas regies centro-oeste, sudeste e sul do Brasil. Ela apresenta 2n = 50 cromossomos na maioria das populaes estudadas, porm na populao do Crrego dos Caetano (bacia do Rio Araguari), o nmero diplide encontrado foi 2n=48, com a presena de um ou dois cromossomos supranumerrios metacntricos grandes em fmeas. No presente trabalho, essa populao foi analisada com o intuito de localizar os genes ribossmicos 5S e 18S, alm de caracterizar a heterocromatina que forma o cromossomo B. As regies organizadoras de nuclolos impregnadas com nitrato de Prata (AgNORs) nessa populao so mltiplas e a hibridao in situ fluorescente (FISH) destacou seis cromossomos. A sonda 5S localizou stios pericentromricos em um par de cromossomos metacntricos e telomricos em um par de acrocntricos. Astyanax scabripinnis foi considerado um complexo de espcies, depois de serem analisados morfolgica e citogeneticamente. Esse complexo composto por 15 espcies, inclundo A. paranae. Dentro desse grupo, o nmero cromossmico varia entre 2n=46, 2n=48 e 2n=50, com muitas populaes apresentando cromossomos supranumerrios. As regies organizadoras de nuclolos (NOR) so, na maioria das vezes, mltiplas tanto em anlises de AgNORs como por FISH, com sonda de DNAr 18S. No presente estudo, foram analisados os caritipos de trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae, provenientes do Crrego dos Caetano, Crrego Quilombo e de um aude formado por uma nascente que desgua no Crrego dos Caentano, pertencentes bacia do Rio Araguari. O nmero de cromossomos nas 3 populaes 2n=50, embora com variaes nas frmulas cariotpica. A anlise dos

cromossomos aps colorao com os fluorocromos CMA3 e DAPI, AgNOR, assim como dos stios de DNAr 5S e 18S por FISH, permitiram localizar os genes ribossomais nos cromossomos, determinar o seu nmero e estabelecer algumas particularidades em relao s populaes estudadas. As caractersticas cromossmicas especficas de cada populao esto provavelmente correlacionadas com o isolamento geogrfico existente entre as mesmas.

Apresentao

Apresentao
A bacia do Alto Paran abrange um trecho do Rio Paran e os rios Paranapanema, Grande, Tiet e Paranaba. O Rio Araguari um dos principais afluentes do Rio Paranaba. Sua bacia situa-se no sudoeste de Minas Gerais, onde esto os municpios de Arax, Araguari e Uberlndia. Existem pelo menos 5 usinas hidreltricas instaladas ao longo do leito desse rio, provocando alteraes nas propriedades fsicas e qumicas da gua e, como consequncia os seres aquticos, incluindo a icitofauna, so afetados. As espcies de piracema refugiam-se em crregos e outros cursos de gua para se reproduzirem, deixando, em muitos casos, os leitos dos rios. Esse isolamento, ao longo de centenas a milhares de anos, pode levar a uma possvel especiao ou mesmo extino dessas espcies, por isso necessrio conhecer o patrimnio gentico dessa bacia, na tentativa de preserv-lo. Nesse sentido o presente trabalho contribui com a descrio citogentica de duas espcies de peixes do gnero Astyanax provenientes do Crrego dos Caetano e Crrego Quilombo, ambos pertencentes bacia do Rio Araguari. Este trabalho constitudo de quatro captulos. O primeiro uma reviso bibliogrfica onde so reunidas informaes sobre a regio de coleta dos exemplares utilizados; a posio atual do gnero Astyanax na sistemtica de peixes, particularmente de A. bockmanni e o complexo de espcies A. scabripinnis; alm de dados relacionados citogentica clssica e molecular dessas espcies. O segundo captulo um artigo j publicado que descreve citogeneticamente uma populao de A. eigenmanniorum (hoje identificada como A. bockmanni), coletada no crrego dos Caetano, pertencente bacia do Rio Araguari. Essa populao apresentou 2n=48 cromossomos, com a presena de um ou dois cromossomos B ou supranumerrios, totalmente heterocromticos, em fmeas. O terceiro captulo complementa as informaes coletadas no segundo, localizando os genes ribossomais 5S e 18S por meio de hibridao in situ fluorescente (FISH) e descreve a constituio da heterocromatina do cromossomo supranumerrio dessa populao. O quarto captulo o estudo citogentico de trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae,

pertencente ao complexo de espcies A. scabripinnis, que determina o nmero de cromossomos, a localizao e nmero de stios ribossmicos 18S com FISH, impregnao por nitrato de Prata, DAPI e CMA3, alm de stios 5S. Portanto, os objetivos desse trabalho foram: localizar os stios ribossmicos 5S e 18S da populao de A. bockmanni do Crrego dos Caetano (Uberlndia, MG, Brasil); alm de caracterizar a heterocromatina que compe o cromossomo B encontrado nas fmeas dessa populao e caracterizar citogeneticamente trs populaes de A. sp gr A. paranae da bacia do Rio Araguari com o intuito de determinar possveis diferenciaes entre elas.

Captulo 1

Fundamentao Terica

Introduo Geral
1.1. Localizao e caracterizao dos locais de coleta A bacia do Alto Paran abrange um trecho do Rio Paran (prximo barragem de Itaipu), os rios Paranapanema, Grande, Tiet e Paranaba. De acordo com a Companhia Energtica de Minas Gerais (CEMIG) (PORTAL PEIXE VIVO) o Rio Paranaba constitui uma bacia que drena uma rea de aproximadamente 220.000km2, 196 municpios, sendo 55 deles em Minas Gerais. O bioma predominante da bacia do Rio Paranaba o Cerrado, com clima variando de mido a semi-mido e semi-rido. A qualidade da gua oscila de mdia a ruim, devido destruio das matas ciliares, lanamento de efluentes domsticos e industriais, utilizao de agrotxicos e dragas irregulares na agricultura. Apesar de ter perdido cerca de 60% de sua vazo, como conseqncia desse mau uso de suas guas, a bacia do Rio Paranaba conhecida principalmente por suas riqueza diamantfera e seu potencial hidroeltrico, ao qual pertencem algumas usinas hidreltricas tais como, So Simo, Itumbiara, Cachoeira Dourada e Emborcao; e que, junto com outras menores, so responsveis pela gerao de energia de grande parte de Minas Gerais e Gois (CEMIG PORTAL PEIXE VIVO). Os principais afluentes da margem esquerda do Rio Paranaba so os rios Dourados, Perdizes, Bagagem, Araguari, Piedade, Tijuco e Prata (CEMIG PORTAL PEIXE VIVO). A bacia do Rio Araguari situa-se no sudoeste de Minas Gerais, onde esto os municpios de Uberlndia, Araguari e Arax (Figura 1). Suas nascentes esto localizadas na Serra da Canastra. Apresenta uma rea de drenagem de 21.856 km, abrangendo um total de 20 municpios com uma populao estimada de 1,2 milhes de pessoas (ANDRADE et al., 2008). O Rio Araguari tem guas escuras porm limpas, com vrias corredeiras de pedra e cnions e, devido sua conformao, apresenta um bom potencial para gerao de energia eltrica (WIKIPEDIA, 2008). Existem pelo menos cinco usinas

hidroeltricas instaladas ao longo do leito desse rio. Os represamentos provocam efeitos negativos para ambiente, como a liberao de gases txicos, condies anxicas, eutrofizao, produo excessiva de algas. Tais condies causam alteraes nas propriedades fsicas e qumicas da gua, que afetam diretamente a fauna aqutica, alm de alteraes nas caractersticas do curso de gua. Estas modificaes de habitats muitas vezes no so toleradas por varias espcies de peixes (AGOSTINHO et al., 2007 apud RGO, 2008). Com essas alteraes, a ictiofauna, principalmente as espcies de piracema, refugiam-se em crregos e outros cursos dgua para se reproduzirem, deixando, em muitos casos, os leitos dos rios. Esse isolamento, ao longo de centenas a milhares de anos, pode levar uma especiao ou mesmo extino desses animais justificando a necessidade de se conhecer o patrimnio gentico dessa bacia, na tentativa de preserv-lo.

Figura 1: Mapa destacando a localizao da bacia do Rio Araguari. Retirado de Brito e Rosa (2003)

Contribuem com essa bacia inmeros crregos, incluindo o Crrego dos Caetano e o Crrego Quilombo, onde foram realizadas as coletas para o desenvolvimento desse trabalho (Figura 2). O primeiro tem uma extenso de aproximadamente 9Km e atravessa muitas propriedades rurais sendo que, em vrias delas, suas guas foram desviadas para irrigar plantaes e/ou formar veios de gua
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para o gado. Seu terreno apresenta um declive acentuado, o que resulta em forte corredeira. O solo arenoso, cheio de cascalhos, formando pequenas cachoeiras. uma distncia aproximada de 2,5Km a montante da foz, existe uma cachoeira de aproximadamente 10m de altura, a qual constitui uma barreira natural para os peixes, pois os espcimens que esto abaixo dela no conseguem subir. Entre a cachoeira e a nascente do crrego existem trechos em que o curso de gua escasso devido aos desvios feitos pelos fazendeiros, constituindo assim uma barreira geogrfica artificial.

Figura 2: Foto de satlite retirada do software online Google Earth, mostrando a localizao dos pontos de coleta em relao ao Rio Araguari

O Crrego Quilombo tem uma extenso de aproximadamente 3Km e desgua a mais ou menos 700m abaixo do Crrego dos Caetano. Sua nascente est localizada na regio conhecida popularmente por Tiracouro, prxima rodovia Neuza Rezende. Na poca da estiagem, sua vazo de gua diminui muito, chegando a secar em alguns pontos. Na poca das chuvas, seu volume de gua aumenta, permitindo a formao de pequenas quedas dgua. Seu solo arenoso e cheio de pedregulhos.

1.2. Consideraes sobre a famlia Characidae e o gnero Astyanax Os peixes formam o grupo de vertebrados mais antigo e diversificado, com enorme variao biolgica, incluindo sua morfologia e nos habitats que ocupam. Essa diversidade auxilia no entendimento da sua histria evolutiva, mas estabelece certa dificuldade de classificao. Baseado na classificao cladstica, os peixes que tem nadadeiras com raios constituem um grupo dominante em nmero de espcies e, embora formem um grupo heterogneo, exibem continuidade filogentica (NELSON, 2006). As informaes j conhecidas sobre os peixes so bastante vastas e incluem todas as reas da biologia. Eles so atraentes para os pesquisadores, devido riqueza de informaes e diversidade que exibem, tanto nos txons fsseis como nos vivos (NELSON, 2006). Os peixes so encontrados em ecossistemas aquticos marinhos ou dulccolas, vivem em diferentes profundidades, em regies frias ou quentes e, por isso, sua distribuio ampla. Nelson (2006) considera que mais de 225 espcies so didromas, vivendo parte de suas vidas na gua doce e parte na gua salgada. Dentre esses, a maioria androma, desovam em gua doce e passam a maior parte da vida em gua salgada, como os salmes, e poucos so catdromos, ou seja, desovam em guas salgadas e retornam para gua doce, como as enguias. Aproximadamente 43% de todas as espcies de peixes vivem exclusivamente em gua doce. De acordo com Vaz et al. (2000), a fauna neotropical a mais numerosa. A ordem Characiformes compreende 18 famlias, 270 gneros e 1674 espcies de gua doce (NELSON, 2006), abrangendo quase um tero da ictiofauna sul americana, com grande diversidade em relao habitats e regime alimentar (VAZ et al., 2000). Das 18 famlias conhecidas, Characidae uma das mais numerosas, com 952 espcies descritas e aproximadamente 400 espcies no descritas, perfazendo um total de 1352 espcies (REIS et al., 2003). No Brasil, so conhecidas diversas espcies de caracdeos, tais como: matrinchs, dourados, caranhas, piranhas, tambaquis, pacus, tabarana, piraputangas, lambaris ou piabas, entre outras.

Os lambaris ou piabas esto distribudos desde a Argentina at a fronteira do Mxico com os Estados Unidos (EIGENMANN 1921, apud MORELLI 1981). So encontrados nos mais diversos ambientes, tais como cabeceiras de riachos, rios, lagos, brejos. Movem-se em cardumes e podem realizar curtas migraes ascendentes na poca das cheias, o que lhes proporciona estmulo para a reproduo. Algumas espcies aparecem com maior freqncia na poca das cheias, estando presentes em ambientes com fundo de areia e pedra (VAZ et al., 2000). Os lambaris pertencem ao gnero Astyanax que, dentro da famlia Characidae, classificado como Incertae Sedis juntamente com outros 87 gneros considerados heterogneos. A maioria deles estava alocada na subfamlia Tetragonopterinae, de onde foram excludos por falta de evidncias quanto sua monofilia (LIMA et al., 2003). Dentro desse gnero j foram descritas quase 100 espcies. Existem, porm, dificuldades na identificao por serem morfologicamente muito semelhantes. A espcie A. bockmanni, anteriormente classificada como A. eigenmanniorum, foi descrita recentemente e est distribuda em riachos do Alto Rio Paran, nas regies centro-oeste, sudeste e sul do Brasil (VARI e CASTRO, 2007). A. altiparanae, A. fasciatus, A. scabripinnis so hoje consideradas como complexos de espcies. Estudos citogenticos tm evidenciado uma grande diversidade cariotpica entre diferentes populaes ou mesmo em uma mesma populao (FERNANDES e MARTINS SANTOS, 2004; FERREIRA NETO et al., 2009; MEDRADO et al., 2008; PAZZA et al., 2008). A. scabripinnis foi a primeira espcie do gnero a ser considerada como um complexo, a partir dos estudos desenvolvidos por Moreira-Filho e Bertollo (1991), quando foram analisadas sete populaes de bacias hidrogrficas diferentes. Seis delas, alm da citogentica, foram estudadas morfologicamente, utilizando anlise cannica varivel. Esses dados, em conjunto, permitiram propor que essa espcie no poderia representar uma nica entidade taxonmica. Bertaco e Malabarba (2001) reforaram essa hiptese com a descrio de duas espcies pertencentes a

esse complexo, o qual parece ser composto por 15 espcies distintas, incluindo A. paranae (Bertaco e Lucena 2006). 1.3. A citogentica na famlia Characidae, destacando o gnero Astyanax A citogentica de peixes fornece subsdios para elucidar problemas evolutivos, alm de ser uma importante ferramenta para o desenvolvimento de diversas linhas de pesquisa (TOLEDO-FILHO, 1978). O estudo das modificaes na estrutura dos caritipos, relacionadas ao conjunto de fenmenos que acompanham o processo evolutivo dos diferentes grupos de peixes (GALETTI-JNIOR, 1986), alm da citotaxonomia (BARROS e MARGARIDO, 1999), so ferramentas importantes para aumentar o conhecimento de muitas populaes desse grupo. A ictiocitogentica foi aperfeioada a partir da aplicao de tcnicas de bandeamento utilizadas na citogentica humana e de outros mamferos, apesar das dificuldades de adaptao aos seus cromossomos. A introduo de metodologias que evidenciam regies cromossmicas como as de heterocromatina constitutiva (banda C) ou NOR; o uso de fluorocromos e hibridao in situ, fornecem importantes resultados para a caracterizao dos cromossomos dos peixes e suas relaes evolutivas (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1988; FELDBERG et al., 1992). Com isso, observa-se uma expanso nas pesquisas exibindo uma abordagem populacional, onde so analisados diferentes tipos de polimorfismos e modos de diversificao cromossmica, deixando de focar exclusivamente na identificao do nmero e morfologia dos cromossomos. Um levantamento feito por Oliveira et al. (2000) registra os nmeros cromossmicos haplides e diplides de 44 famlias, 252 gneros e 921 espcies de peixes de gua doce (dentre elas, 41 apresentando cromossomos supranumerrios), os quais variam de 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis a 2n=132 em Corydoras aeneus. Oliveira et al. (1988) relatam que as variaes na macroestrutura cromossmica entre diferentes populaes podem estar relacionadas com a sua mobilidade e tamanho, ou seja, grupos de peixes, tais como Prochilodontidae

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(FELDBERG et al., 1992), que apresentam maior mobilidade e populaes mais numerosas tendem a conservar a macroestrutura cariotpica, pois elas mantem um fluxo genetico constante. No entanto, grupos que apresentam pouca mobilidade e pequenas populaes tm caritipos distintos, como Hoplias (BERTOLLO et al., 2000) e Astyanax scabripinnis (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991). Algumas famlias de peixes neotropicais, como Curimatidae, Anostomidae, Parodontidae, Chilodontidae, Cichlidae e Hemiodontidae possuem caritipos menos variveis quanto ao nmero de cromossomos (FELDBERG et al.,1992), porm a grande maioria apresenta muita variabilidade. De acordo com Denton (1973), os complementos cromossmicos entre os peixes geralmente so diversificados. Kosswig (1973) refora tal afirmativa, dizendo que no h outra classe de vertebrados apresentando grande quantidade de caritipos diferentes como os Characidae. Nessa famlia, podem ser encontrados gneros com nmeros cromossmicos constantes e pouca variabilidade cariotpica, tais como Salminus (VENERE et al., 1996; MONDIN et al. 1999; SOUZA et al., 2008), Brycon (WASKO e GALETTIJNIOR, 2000) e Oligosarcus (RUBERT e MARGARIDO, 2007). Porm, a maioria apresenta variabilidade cariotpica como, por exemplo, Bryconamericus (PAINTERMARQUES et al., 2003), Serrasalmus (NAKAYAMA et al., 2000) e Astyanax (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2004; PAZZA et al., 2006; VICARI et al., 2008). Entre os Astyanax, o nmero cromossmico varia de 2n = 36 em A. schubarti (MORELLI et al., 1983) a 2n = 50 em A. altiparanae e A. bockmanni (FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2004; KAVALCO et al., 2009). Entre as espcies que formam o complexo A. scabripinnis, esse nmero varia de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 (ALVES e MARTINS-SANTOS, 2002; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2005; PERES et al., 2008; VICARI et al., 2008), sendo este ltimo o mais comum, alm da presena de cromossomos B ou supranumerrios em vrias espcies. Esses cromossomos podem ser meta-, submeta-, subtelo- ou acrocntricos; macro- ou microcromossomos. Os macrocromossomos so mais freqentes em fmeas, metacntricos e de tamanho correspondente ao maior do
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complemento (VICENTE et al., 1996; FERRO et al., 2003) e os microcromossomos, so mais freqentes em machos e com maior variao de nmero de uma clula para outra (ROCON-STANGE e ALMEIDA-TOLEDO, 1993; MIZOGUCHI e MARTINS-SANTOS, 1997). De acordo com Moreira-Filho et al. (2004) esses cromossomos podem variar de 0 a 4, enquanto os macrocromossomos variam de 0 a 2. O macrocromossomo B metacntrico, correspondente em tamanho ao maior cromossomo do complemento, o mais freqente entre as fmeas das populaes do complexo de espcies A. scabripinnis, bem como em outras espcies do mesmo gnero, como A. bockmanni (TORRES-MARIANO e MORELLI, 2008). Em A. bockmanni o nmero diplide mais comum 50 cromossomos. Stripecke et al. (1985) analisaram trs exemplares fmeas capturadas no Rio Atibaia, sendo que duas delas apresentaram 2n = 50 e uma apresentou um cromossomo supranumerrio de tamanho correspondente ao segundo par. Fauaz et al. (1994) e Kavalco et al. (2009) encontraram 2n = 50, na populao do Rio Grande (MG). Artoni et al. (1999), analisaram 4 machos e 2 fmeas de A. cf eigenmanniorum, que apresentaram nmero diplide igual a 48 cromossomos, assim como a populao estudada por Torres-Mariano e Morelli (2008), com 2n = 48 + 1 ou 2 supranumerrios. 1.4. Genes ribossomais e hibridao in situ fluorescente (FISH) Em eucariotos superiores as famlias multignicas correspondem a um elemento estrutural comum ao genoma desse grupo e so definidas como um conjunto de genes derivados por duplicao de um gene ancestral, com 50% de semelhana. A repetio em tandem da matriz de RNAr das famlias multignicas confere uma dinmica especial evoluo dessas regies, tornando-as importantes para a compreenso da estrutura e evoluo do genoma (MARTINS e WASCO, 2004). Nesses organismos os genes ribossomais esto presentes em multiplas cpias por genoma, arranjadas em seqncias repetidas e organizados em duas

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famlias multignicas distintas: a 5S e a 45S (MARTINS e WASCO, 2004; ANDRADE e JORDO, 2005). O DNAr 5S transcrito em um local diferente da regio organizadora nucleolar (NOR), migra para o nuclolo e se une ao RNAr 5,8S e 28S para formar a subunidade maior do ribossomo. Suas unidades repetitivas possuem aproximadamente 120 pares de bases, intercaladas por um espaador no transcrito (NTS) muito heterogneo, variando de tamanho entre as espcies (ANDRADE e JORDO, 2005; PENDAS et al., 1994 apud FERNANDES, 2006). Os NTS no sofrem presso seletiva, permitindo a ocorrncia de mutaes em taxas bastante elevadas, levando a uma diferenciao nessa regio e distino entre espcies que divergiram recentemente na historia evolutiva (ALVES-COSTA e MARTINS, 2005). A regio codificante do DNAr 5S conservada, mesmo entre organismos filogeneticamente distantes, incluindo os peixes, onde na maioria das vezes, ocupa uma regio intersticial nos cromossomos. Embora essa conservao seja observada, ocorreram mudanas em seqncias nucleotdicas e na organizao das unidades repetidas em peixes (WASKO e GALETTI-JNIOR, 2000). O DNAr 45S composto por trs genes que codificam os RNAs 18S, 5.8S e 28S, que so processados e parcialmente organizados para formar as subunidades do ribossomo no nuclolo. Estes esto separados por espaadores transcritos internos (ITS) e externos (IGS ou ETS) que so ntrons eliminados na organizao das molculas precursoras de RNAr (ANDRADE e JORDO, 2005). Assim, o tamanho e a organizao das seqncias de bases destes segmentos variam inter e intraespecificamente (MESTRINER, 1993). Os ITSs so geralmente ricos em GC e compostos por seqncias repetitivas (TORRES et al., 1990; KING, 1991 apud FERNANDES, 2006). Todo esse conjunto conhecido citogeneticamente como NOR e considerada uma regio associada aos nuclolos que tm a funo de reorganiz-los no final da diviso celular (HEITZ, 1931 apud BICUDO, 1985). As NORs, quando impregnadas pelo nitrato de Prata, podem ser facilmente visualizadas (HOWELL e BLACK, 1980). A Prata se liga preferencialmente em protenas no-histnicas, de natureza cida, associadas ao RNAr recm transcrito
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nos stios de DNAr, evidenciando os stios que estiveram transcricionalmente ativos e ainda apresentam resduos de RNAr associados a protenas, presos em torno de cistrons de DNAr condensados (HOWELL, 1977 apud MOREIRA-FILHO, 1983). Em peixes essa tcnica amplamente utilizada por ser uma tcnica simples, rpida e barata. As NORs so variveis em muitos aspectos, tais como nmero, localizao, atividade, tamanho e a organizao das seqncias do DNA ribossmico. Quando est presente em apenas um par de cromossomos, dizemos tratar-se de um sistema de NOR simples. Por outro lado, a localizao das NORs em mais de um par cromossmico, caracteriza um sistema de NORs mltiplas (MOREIRA-FILHO, 1983). Em algumas espcies, gneros, famlias e at mesmo em ordens de peixes, o padro de NOR constante e por isso, podem ser consideradas marcadores citogeneticos. Nos Gymnotiformes o padro de NOR comum simples, porm Fonteles et al. (2008) encontrou trs cromossomos marcados em uma populao de Electrophorus electricus. Eles sugerem que este fato seja espordico. Entre os Anostomidae, a impregnao das NORs com nitrato de Prata (AgNOR) permite caracterizar algumas espcies, pois, apesar de todas elas serem simples, esto localizadas em posies diferentes nos cromossomos (GALETTIJNIOR et al., 1984). Na famlia Characidae possvel observar uma variao no padro de AgNOR, sendo simples em alguns grupos e mltiplas em outros. Em Serrasalminae, o padro mltiplo, variando o nmero e a localizao destas regies (NAKAYAMA et al., 2002). A presena de NORs conservadas em um nico par de cromossomos comum a todas as espcies de Brycon estudadas e pode ser uma caracterstica primitiva na subfamlia Bryconinae, indicando uma notvel estabilidade entre esses peixes (WASKO e GALETTI-JNIOR, 2000). Em outros grupos de caracdeos possvel observar ambos os padres de Ag-NOR, como nos Astyanax. Em A. fasciatus, as NORs so mltiplas com at dez cromossomos marcados, embora algumas populaes apresentam NOR simples (MEDRADO et al., 2008 TORRES-MARIANO e MORELLI, 2006; PAZZA et al., 2006). Em A. bockmanni da bacia do Rio Paranapanema e na populao da bacia do
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Rio Araguari a AgNOR mltipla com at seis cromossomos marcados (KAVALKO et al., 2009; TORRES-MARIANO e MORELLI, 2008). No complexo A. scabripinnis, o mais estudado do gnero, j foram encontradas populaes com o nmero de AgNORs variando de um a quinze (ROCON-STANGE e ALMEIDA-TOLEDO, 1993; MANTOVANI et al., 2000; MAISTRO et al., 2001; ARAUJO e MORELLI, 2006; VICARI et al., 2008). Na maioria das vezes, todos os stios de NORs dos cromossomos de peixes, independente de sua atividade, mesmo aqueles usualmente no detectados pelo nitrato de Prata, so evidenciados pela Cromomicina A3 (CMA3) ou Mitramicina (GALETTI-JNIOR et al., 2004). De acordo com Schweizer (1981; apud AMEMIYA e GOLD, 1986) esses antibiticos se ligam, preferencialmente, em regies cromossmicas ricas em pares de bases GC e, geralmente, produzem padres fluorescentes em cromossomos, que so inversos s produzidas por fluorocromos AT base especficos, tais como Hoechst 33258, Quinacrina e DAPI. Amemiya e Gold (1986), consideram que os cromossomos de peixes e anfbios so muito semelhantes em sua composio e possuem regies ricas em GC relacionadas com as NORs. Essas regies podem ser interespaadoras, de heterocromatina associada s NORs ou stios de DNA ribossmico (DNAr). Porm, essa relao no absoluta, pois existem vrios relatos de evidncias de stios no correspondentes s AgNORs. Por outro lado, stios detectados pelo CMA3 e no pelo nitrato de Prata tambm foram evidenciados (MORELLI et al., 2007 e SOUZA et al., 2001 apud GALETTI-JNIOR et al., 2004). A citogentica molecular baseada principalmente na tcnica de hibridao in situ fluorescente (FISH), onde uma sonda de DNA marcada hibridada sobre alvos citolgicos, como por exemplo, cromossomos metafsicos. Nos ltimos anos a FISH tem sido utilizada para o mapeamento das NORs e stios de DNAr 5S, atravs de sondas de DNAr. Essa tcnica permite a deteco de todos os stios de DNAr 45S existentes em uma espcie, independente de sua atividade, diferente do que pode ser observado com a impregnao por nitrato de Prata ou colorao com CMA3 e Mitramicina. Por outro lado, o DNAr 5S, no pode ser localizado pelo tratamento com nitrato de Prata e colorao com fluorocromos. Sua identificao s pode ser realizada por hibridao in situ (GALETTI-JNIOR et al., 2004).
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Fernandes (2006) reuniu dados de estudos que localizam os genes DNAr 45S e/ou 5S nos cromossomos. Segundo ele, esses dados foram determinados em 71 espcies de peixes pertencentes a diferentes ordens, como por exemplo Acipenseriformes, Anguilliformes, Characiformes, Cypriniformes, Salmoniformes, Siluriformes, Perciformes e Tetraodontiformes. Esses estudos demonstraram que o DNAr 5S, na maioria dos casos, est localizado em regies intersticiais do cromossomo, facilitando sua conservao no genoma (SCHWEIZER e LOIDL, 1987 apud FERNANDES, 2006). Os genes DNAr 45S, por sua vez, quando esto localizados em regies telomricas, apresentam maior facilidade na transferncia de material gentico, aumentando a variabilidade inter e intrapopulacional (FERRO et al., 2001; CENTOFANTE et al., 2003; JESUS e MOREIRA-FILHO, 2003; MANTOVANI et al., 2005). No gnero Astyanax, estudos localizando os genes ribossomais 5S e 45S tiveram seu inicio em 2001, quando Ferro et al. (2001) observaram os genes 5S e 18S em quatro populaes de A. scabripinnis pertencentes bacia do Rio SapucaGuau. Almeida-Toledo et al. (2002) analisaram os genes 5S e 28S em cinco espcies do gnero. Kavalco e Moreira-Filho (2003), Kavalco et al. (2004), Mantovani et al. (2005), Fernandes (2006), Peres et al. (2008), Vicari et al. (2008) e Kavalco et al. (2009) prosseguiram com essas anlises em Astyanax. O DNAr 5S se mostrou conservado nos estudos citados acima, com o 2 ou 3 par metacntrico constantemente marcado na regio centromrica. Adicionalmente, foram evidenciados at oito sinais positivos, nas regies terminais ou intersticiais de diversos pares de cromossomos. Os stios de DNAr 18S, muito mais variveis que os 5S, apresentam-se localizados em 2 a 16 cromossomos no gnero Astyanax, de acordo com os autores supra citados. Nele, A. scabripinnis (MANTOVANI et al., 2005) apresentou maior nmero de stios ribossmicos 18S, com 16 cromossomos marcados. Kavalco et al. (2009) observaram 8 cromossomos em A. bockmanni. Os dados sobre os genes ribossmais 5S e 18S, reunidos at hoje, tem sido importantes para a caracterizao cariotpica das diferentes espcies do gnero Astyanax.

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1.5. Referncias Bibliogrficas: Almeida-Toledo, L. F.; Foresti, F.; Toledo-Filho, S. A. An early stage of sex chromosome differentiation in the fish Eigenmannia virescens (Sternopygidae). In: XVI CONGRS INTERNAT. DE GNTIQUE, Toronto, Canad. Resumos. Toronto, p. 258, 1988. Almeida-Toledo, L. F.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Bonillo, C.; Porto-Foresti, F.; Daniel- Silva, M. F. Z. Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and colocalization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): 229-233, 2002. Alves A. L.; Martins-Santos, I. C. Cytogenetics studies in two populations of Astyanax scabripinnis with 2n = 48 chromosomes (Teleostei, Characidae). Cytologia 67: 117122, 2002. Alves-Costa, F. A.; Martins, C. DNAr 5S Um novo marcador molecular para analyses geneticas de tilapias. Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento, n. 35, p 22-27, 2005. Amemiya C. T.; Gold J. R. Chromomycin A3 stains nucleolus organizer regions of fish chromosomes. Copeia, 1: 226-231, 1986. Andrade, C. G. T. J e Jordo, B. Q. O ncleo da clula. IN: Junqueira, L. C. e Carneiro, J. Biologia Celular e Molecular Rio de Janeiro, Guanabara Koogan p. 141169, 2005. Andrade, I. F.; Arajo, N. C.; Pinese, J. F. Jr; Leal, P. C. B.; Silva, J. F.; Rodrigues, S. C. Avaliao de cenrios ambientais na regio do mdio curso do Rio Araguari. VIII Encontro Interno, XII Seminrio de Iniciao Cientfica da Universidade Federal de Uberlndia, Uberlndia, 2008. < www.ic-ufu.org/anaisufu2008/PDF/IC20080440.PDF> Araujo, A. C. S.; Morelli, S. Comparao citogentica de duas populaes de Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) da regio do Tringulo Mineiro. Biosci J 22:145-150, 2006. Artoni, R. F., Vicari, M. R., Matoso, D. A. & Bertollo, L. A. C.. Dados preliminares sobre o caritipo de Astyanax cf. eigenmanniorum (Characidae). 45 Congresso Nacional de Gentica, Resumos, 803pp. Gramado (RS), 1999. Barros, N. M. T.; Margarido V. P. Estudos Cariotpicos em Astyanax sp B. (PISCES, CHARACIDAE, TETRAGONOPTERINAE) Coletado no Rio Vor Bacia do Iguau. Genetics and Molecular Biology, 22, n 3 supplement, resumo n 01-40, 1999.

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Captulo 2

B chromosomes in a population of Astyanax eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlndia, MG, Brazil)

Publicado em Genetics and Molecular Biology 2008

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2. B chromosomes in a population of Astyanax eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlndia, MG, Brazil)
Alessandra Ribeiro Torres-Mariano and Sandra Morelli Instituto de Gentica e Bioqumica, Universidade Federal de Uberlndia, Uberlndia, MG, Brazil. Abstract A cytogenetic study was conducted on an Astyanax eigenmanniorum population from the Caetano Stream (18 44' 56" S/ 048 18' 39" W) - in Uberlndia, MG, Brazil showing a modal diploid number of 48 chromosomes in the standard male and female karyotypes. However, in several specimens it was also possible to observe metaphases with one or two B chromosomes, increasing the diploid number to 49 or 50 chromosomes, respectively. The supernumerary chromosomes were totally heterochromatic and highlighted after C-banding. The silver-stained nucleolus organizing regions (AgNORs) were located in at least five chromosomes of the standard karyotype, thus characterizing a multiple NOR system in the species. This is the first occurrence of an A. eigenmanniorum population with 2n = 48 chromosomes, bearing supernumerary chromosomes.
Key words: Characidae, Astyanax eigenmanniorum, supernumerary chromosome, heterochromatin, nucleolus organizing regions (NORs). Received: August 18, 2006; Accepted: May 22, 2007.

Preliminary cytogenetic studies in Brazilian Astyanax species were initiated in the late 1970s by Foresti et al. (1977). Further studies confirmed that the chromosomal number in this fish group ranges from 2n = 36 in A. schubarti (Morelli et al., 1983) to 2n = 50 in A. altiparanae (Pacheco et al., 2001; Fernandes and MartinsSantos, 2004) and A. eigenmanniorum (Stripecke et al., 1985; Fauaz et al., 1994; Pfister and Moreira-Filho, 1997). A. scabripinnis (Morelli et al., 1983; Araujo and

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Morelli,2006), A. fasciatus (Morelli et al., 1983; Torres-Mariano and Morelli, 2006), and A. altiparanae correspond to the species with the highest number of cytogenetic studies. Karyotypic variability among different Astyanax fish populations is very common and, in some cases, the presence of different numbers of chromosomes has been found among individuals of the same population, such as in A. fasciatus (Pazza et al., 2006) and A. scabripinnis (Kavalco and Moreira-Filho, 2003; Fernandes and Martins-Santos, 2005). Supernumerary or B chromosomes are additional dispensable chromosomes that are present in some individuals from some populations in some species, which have probably arisen from the A (standard) chromosomes but follow their own evolutionary pathway (Camacho et al., 2000). These chromosomes may constitute an alternative form of organization of the genetic material and can be considered true parasites, remaining in populations exclusively by means of their distinctive transmission mechanisms (Rejn et al., 1987). B chromosomes can be found in haploid or diploid organisms, and can be seen totally or partially heterochromatic (Jones, 1991), after the C-banding technique (Sumner, 1972). However, although very common, these characteristics are not present in all B chromosomes (Beukeboom, 1994). Among fishes, the most studied species is A. scabripinnis, which presents macro- and micro-supernumerary chromosomes with a frequency that varies between males and females and according to the altitude at which populations occur (Salvador and Moreira-Filho, 1992; Vicente et al., 1996; No et al., 2000; Mestriner et al., 2000; Ferro et al., 2003; Moreira-Filho et al., 2004; Araujo and Morelli, 2006). This paper gives the description of a large metacentric supernumerary chromosome in A. eigenmanniorum from the Caetano Stream (18 44' 56" S/ 048 18' 39" W, Uberlndia, MG, Brazil). Thirteen specimens (five males, seven females, and one unsexed) were cytogenetically analyzed. The animals were identified by Dr. Valdener Garutti (UNESP, So Jos do Rio Preto, SP), and further registered and

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deposited in the fish collection of the Laboratory of Animal Cytogenetics, at the Federal University of Uberlndia. Mitotic chromosomes were obtained according to Bertollo et al. (1978). Nucleolus organizer regions (AgNORs) were identified following the procedure described by Howell and Black (1980). Constitutive heterochromatin was detected using the C-banding technique (Sumner, 1972). The chromosome morphology was determined on the basis of the arm ratio (AR), as proposed by Levan et al. (1964), and the chromosomes were classified as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st), and acrocentric (a). A. eigenmanniorum presented a standard karyotype with a diploid number of 2n = 48 chromosomes, both in males and females (Table 1) and a karyotype composed of 7 pairs of metacentric (m), 9 pairs of submetacentric (sm), 5 pairs of subtelocentric (st), and 3 pairs of acrocentric (a) chromosomes (Figure 1a). However, in several specimens it was also possible to observe metaphases with one or two B chromosomes, increasing the diploid number up to 49 chromosomes or 50 chromosomes (Table 1). In three females the proportion between 48 and 49 chromosomes was very similar (Table 1). The metaphases with 49 and 50 chromosomes showed the presence of one or two large metacentric supernumerary chromosomes, respectively (Figure 1b, c), corresponding in size to the second chromosome pair of the A complement, which proved to be totally heterochromatic when subjected to C-banding (Figure 1e). The other chromosomes showed heterochromatin located at the telomeric and/or centromeric regions, as well as in the whole short arm (Figure 1e). Although two male specimens (n. 584 and 623) showed 2n = 49 chromosomes, a low metaphase index was found with this chromosome number (Table 1), and they did not present completely heterochromatic chromosomes after C-banding. Thus, the extra chromosome found in these cases appears only to be a lost chromosome from another standard metaphase. A. eigenmanniorum is characterized by a multiple NOR system. Indeed, AgNORs were seen in different chromosome pairs of the standard karyotype. In the first pair of submetacentric chromosome it is also evident a size polymorphism between the homologous NORs, but with a low frequency (Figure 1d).
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Data from only three A. eigenmanniorum populations have been described to date (Stripecke et al., 1985; Fauaz et al., 1994; Pfister and Moreira-Filho, 1997), all with 2n = 50 chromosomes. Some triploid specimens were found in populations of the

Figure 1 - Karyotypes of A. eigenmanniorum from the Caetano Stream, presenting 48 chromosomes (a), 49 chromosomes with 1 B chromosome (b), and 50 chromosomes with 2 B chromosomes (c). In (d) Ag-NOR bearing chromosomes - from left to right: 3rd metacentric chromosome, an acrocentric chromosome (which is rarely detected), 4th metacentric pair, and 1st submetacentric pair, highlighting the size polymorphism of the NOR site. In (e) C-banded metaphase: the small black arrow indicates the heterochromatic supernumerary chromosome; the thick white one indicates the metacentric NOR bearing chromosome.

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Grande River, MG (Fauaz et al., 1994), and only one female from Atibaia River population showed a B chromosome whose size corresponds to that found in the present paper (Stripecke et al., 1985). In the A. eigenmanniorum population from the Caetano Stream, the presence of at least one totally heterochromatic B chromosome was evidenced in several specimens. It is also interesting to note that these specimens presented inter- and intra-individual variation in chromosome number (Table 1), suggesting a recent origin for the B chromosomes in this population. This paper also describes, for the first time, the presence of supernumerary chromosomes in an A. eigenmanniorum population with the diploid number equal to 48 chromosomes.

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Acknowledgments We are indebted to Dr. Valdener Garutti for identifying the specimens and to the financial support from CAPES, CNPq, FAPEMIG, and UFU (Brazil).

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Associate Editor: Luiz Antonio Carlos Bertollo License information: This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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Captulo 3

Caracterizao das NORs, sito ribossmico 5S e da heterocromatina do cromossomo B em Astyanax bockmanni, Vari & Castro, 2007 (Characiformes, Characidae) da bacia do Rio Araguari (Uberlndia, MG)

Short Comunication Journal of Fish Biology

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3. Caracterizao das regies organizadoras nucleolares e da heterocromatina do cromossomo B em Astyanax bockmanni, Vari & Castro, 2007 (Characiformes, Characidae) da bacia do Rio Araguari (Uberlndia, MG, Brasil)
Alessandra Ribeiro Torres-Mariano & Sandra Morelli Instituto de Gentica e Bioqumica Universidade Federal de Uberlndia

Resumo Analises da hibridao in situ fluorescente (FISH) utilizando sonda de DNAr 18S, evidenciaram seis stios ribossmicos, confirmando os dados de AgNORs e CMA3 e com a sonda de DNAr 5S foi encontrada em dois pares de cromossomos: um em regio telomrica e outro pericentromrica. O tratamento com DAPI destacou todo o cromossomo supranumerrio que quando submetido a tratamento com a CMA3 no apresentou marcas, evidenciando a presena de heterocromatina rica em bases AT. Pela diversidade das caractersticas entre as populaes de A. bockmanni estudadas, pode-se propor que esta seja um complexo de espcies, assim como outras do gnero Astyanax. Palavras Chave: Genes ribossomais, NOR, Fluorocromos, Cromossomo supranumerrio, Astyanax bockmanni.

Os

cromossomos

de

peixes

suas relaes

evolutivas

tm

sido

caracterizados utilizando metodologias de bandamento, tais como banda C e impregnao das regies organizadoras nucleolares com nitrato de Prata (AgNOR); fluorocromos e hibridao in situ, que evidenciam regies cromossmicas especficas (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1988; FELDBERG et al., 1992). Essas metodologias podem ser utilizadas como excelentes marcadores populacionais, evidenciando um alto grau de polimorfismo inter- e intraespecifico.
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A AgNOR evidencia apenas os cromossomos portadores das NORs que estiveram ativas em interfases precedentes e por isso, normalmente, essa informao complementada com o uso de fluorocromos com afinidade por bases GC; pois na maioria das espcies de peixes, essas regies esto relacionadas s NORs e as evidenciam independente de sua atividade (AMEMIYA e GOLD, 1986). A hibridao in situ fluorescente (FISH) utilizando sondas de segmentos de DNA especficos, tais como os genes ribossomais 18S e 5S vm permitindo a localizao exata dessas regies no genoma (MESTRINER et al., 2000; PAZZA et al., 2006; KAVALCO et al., 2009). Estudos citogenticos em A. bockmanni (VARI e CASTRO, 2007), anteriormente identificada como A. eigenmanniorum, so raros, sendo descritas apenas cinco populaes. O nmero de cromossomos encontrado na maioria delas foi igual a 50, porm a populao descrita por Torres-Mariano e Morelli (2008) apresentou 48, 49 e 50 cromossomos e um ou dois cromossomos supranumerrios metacntricos grandes, apenas em fmeas. Dados relacionando as AgNORs com FISH utilizando sondas de DNAr 18S e 5S esto disponveis apenas para a populao da bacia do Rio Paranapanema (STRIPECKE et al., 1985; FAUAZ et al., 1994; PFISTER et al., 1997; TORRES-MARIANO e MORELLI, 2008 e KAVALCO et al., 2009).. O presente trabalho uma complementao da caracterizao citogentica de A. bockmanni do Crrego dos Caetano, bacia do Rio Araguari (Uberlndia, MG, Brasil) (TORRES-MARIANO e MORELLI, 2008), com o objetivo de localizar fisicamente os stios ribossmicos 5S e 18S, alm de caracterizar a heterocromatina constitutiva de seus cromossomos supranumerrios. Foram utilizados 16 exemplares (5 machos, 10 fmeas e 1 sexo indefinido) coletados no Crrego dos Caetano (18 44' 56" S/ 048 18' 39" O), para a obteno dos cromossomos mitticos utilizando a tcnica descrita por Bertollo et al. (1978). As regies ricas em A/T e G/C foram evidenciadas utilizando a tcnica descrita por Christian et al. (1998). A FISH foi realizada conforme a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986), com algumas modificaes. As sondas de DNA ribossmico (DNAr) 18S e 5S utilizadas so heterlogas de Moenkausia sanctaefilomenae.
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Em estudos prvios, Torres-Mariano e Morelli (2008) evidenciaram at seis cromossomos portadores de AgNORs telomricas em A. bockmanni, destacando-se o primeiro par submetacntrico que apresenta polimorfismo de tamanho das NORs. Quando esse material foi submetido colorao com CMA3, seis cromossomos apresentaram stios positivos telomricos (Figura 1b), concordando com a localizao tambm telomrica das AgNORs (Torres-Mariano e Morelli, 2008). O maior par de cromossomos submetacntricos (sm) mostrou-se constantemente marcado nas metfases analisadas. De acordo com Amemiya e Gold (1986), cromossomos de peixes e anfbios so muito semelhantes em sua composio e possuem regies ricas em pares de bases GC relacionadas com as NORs. Essas regies podem ser interespaadoras, de heterocromatina associada s NORs ou stios de DNAr. Artoni et al. (1999) considera que a colorao com CMA3 no deve ser utilizada como um mtodo direto e nico de deteco dos genes ribossmicos, pois pode tambm evidenciar heterocromatina constituda de grande quantidade de bases GC, alm das regies heterocromticas associadas s NORs. Em eucariotos superiores, as NORs so constitudas pela unio dos stios ribossmicos 18S, 5.8S e 28S (45S), que se organizam para formar as subunidades do ribossomo. O RNAr 5S, que est localizado fora da regio das NORs, se une aos RNAr 5,8S e 28S para formar a subunidade maior dos ribossomos. Esses genes esto presentes em milhares de cpias repetidas em seqncia por genoma e organizados em duas famlias multignicas distintas: 5S e 45S, (MARTINS e WASCO, 2004; ANDRADE e JORDO, 2005). A hibridao in situ fluorescente (FISH) utilizando sonda de DNAr 18S, localizou seis stios ribossmicos, corroborando os dados de AgNORs e CMA3 (Figura 3). Kavalco et al. (2009) detectou a presena de oito cromossomos subteloacrocntrios portadores de NORs, utilizando FISH e colorao com nitrato de Prata, caracterizando um sistema de NORs mltiplas na populao de A. bockmanni da bacia do rio Paranapanema. A regio codificante do stio ribossmico 5S conservada mesmo entre organismos filogeneticamente distantes, incluindo os peixes. Nesses organismos, na maioria das vezes, ocupam uma regio intersticial nos cromossomos (WASKO e
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GALETTI-JNIOR, 2000). Essa localizao pode dificultar a transferncia de material gentico entre cromossomos. No gnero Astyanax, a distribuio do stio ribossmico 5S diversificada, embora ocorra a predominncia de um par de cromossomos portadores desses genes, alm da possibilidade de ser encontrado em sintenia com o stio de DNAr 18S (KAVALKO et al., 2004). No presente trabalho, a sonda de DNAr 5S localizou esse cstron de forma bem evidente em um par de cromossomos acrocntricos de mdio porte, na regio telomrica, alm de um cromossomo metacntrico com um stio discreto na regio intersticial, prximo ao centrmero (Figura 3). Em A. bockmanni de duas populaes da bacia do rio Paranapanema foram observadas marcaes em dois pares de cromossomos metacntricos, sendo uma telomrica e a outra intersticial (KAVALCO et al., 2009). A localizao dos genes DNAr 5S no gnero Astyanax parece ser conservada em relao ao par de metacntrico, que j foi evidenciado em diversas espcies (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2006; PERES et al., 2008). Na populao de A. bokmanni ora analisada os stios ribossmicos 5S e 18S ocorrem em sintenia no cromossomo metacntrico, assim como em algumas outras espcies de Astyanax (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; MANTOVANI et al., 2005). A populao de A. bockmanni analisada por Torres-Mariano e Morelli (2008) apresenta um ou dois cromossomos supranumerrios totalmente heterocromticos, de tamanho correspondente ao 2 do complemento. No presente estudo, esse cromossomo no apresentou marcao positiva quando submetido colorao com CMA3 (Figura 1b), porm mostrou-se positivo quando corado com DAPI (Figura 2), indicando que sua heterocromatina rica em bases AT. Cromossomos B com heterocromatina rica em bases AT tambm foram encontrados em A. scabripinnis, em um estudo realizado por Mestriner et al. (2000). Neste caso foi isolado um DNA satlite de 51pb, o qual foi chamado de As51, com aproximadamente 59% de bases AT. Essa seqncia repetitiva est presente em outras populaes da mesma e de outras espcies de Astyanax, tais como A. fasciatus da bacia do Rio Tiet (SP) e A. scabripinnis das bacias dos rios So Francisco e Paranapanema (ABEL et al., 2006).

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DNA repetitivo em tandem, rico em bases AT, so relativamente comuns em peixes (MESTRINER et al. 2000). A presena de NOR em cromossomos supranumerrios no comum, apesar de j terem sido descritos alguns casos como em gafanhotos (CAMACHO, 2000). De acordo com os dados coletados at o presente momento, cromossomos supranumerrios de peixes do gnero Astyanax, no apresentam stios ribossmicos, assim como A. bockmanni analisado nesse trabalho. Os estudos realizados em A. bockmanni ainda so escassos e, por isso, os resultados deste trabalho vm acrescentar novos dados para o conhecimento da estrutura cariotpica dessa espcie. Como visto, A. bockmanni do Crrego dos Caetano (bacia do Rio Araguari) mostra-se divergente das demais populaes dessa espcie j analisadas. Seu nmero diplide 2n=48 contrasta com 2n=50, encontrado para a maioria das demais populaes. Alm disso, o nmero de stios de DNAr 18S diverge daquele encontrado para a populao do rio Paranapanema, bem como a localizao dos stios de DNAr 5S. Ao que tudo indica, possvel que A. bockmanni possa tambm englobar um grupo de espcies distintas, semelhana do que ocorre com outras espcies do gnero Astyanax. Agradecimentos: Dr. Valdener Garutti e Dr. Francisco Langeani Neto, Dr. Fausto Foresti, Ms. Patrcia Elda Sobrinho, Dra. Dbora Diniz, pela contribuio; CAPES, CNPq, FAPEMIG, and UFU (Brazil). 3.1. Referncias Bibliogrficas: Abel, L. D. S. Mantovani; M. & Moreira-Filho, O. (2006) Chromosomal distribution of the As-51 satellite DNA in two species complexes of the genus Astyanax (Pisces, Characidae). Genetics and Molecular Biology 29: 448452. Almeida-Toledo, L. F.; Foresti, F. & Toledo-Filho, S. A. (1988) An early stage of sex chromosome differentiation in the fish Eigenmannia virescens (Sternopygidae). In: XVI Congrs Internat. de Gntique, Toronto, Canad. Resumos. Toronto, p. 258. Almeida-Toledo, L. F.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti F., Bonillo C.; Porto-Foresti F. & Daniel-Silva M. F. Z. (2002). Conservation of the 5S bearing chromosome pair

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and co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetics and Genome Research. 97 (3-4): 229-233. Amemiya, C. T. & Gold, J. R. (1986). Chromomycin A3 stains nucleolus organizer regions of fish chromosomes. Copeia 1986: 226-231. Andrade, C. G. T. J & Jordo, B. Q. (2005) O ncleo da clula. IN: Junqueira, L. C. e Carneiro, J. Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan p. 141-169. Artoni, R. F.; Molina, W. F.; Bertollo, L. A. C. & Galetti-Jnior, P. M. (1999) Heterochromatin analysis in the fish species Liposarcus anisitsi (Siluriformes) and Leporinus elongatus (Characiformes). Genetics and Molecular Biology 22: 39-44. Bertollo, L. A. C.; Takahashi, C. S. & Moreira-Filho, O. (1978) Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of Genetic. 1: 103-120. Camacho, J. P.; Sharbel, T. F. & Beukeboom, L. W. (2000) B-chromosome evolution. Philosophical Transactions of the Royal Society of London 355: 163-178. Christian, A.; McNiel, E.; Robinson, J.; Drabek, R.; LaRue, S.; Waldren, C. & Bedford, J (1998) A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes. Cytogenetics and Cell Genetics 82: 172-179 . Fauaz, G.; Vicente, V. E. & Moreira-Filho, O. (1994) Natural triploidy and B chromosomes in the neotropical fish genus Astyanax (Characidae). Revista Brasileira Gentica 17: 157-163. Feldberg, E.; Porto, J. I. R. & Bertollo, L. A. C. Karyotype evolution in Curimatidae (Teleostei, Characiformes) of the Amazon region. I: Studies on the Genera Curimata, Psectogaster, Steindachmeira and Curimatella. Brazilian Journal of Genetics. 15: 369-383, 1992. Fernandes C. A. & Martins-Santos I. C. (2006) Chromosomal location of 5S and 18S rRNA genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the Iva river basin, state of Paran, Brazil. Caryologia, 59: 253-259. Kavalco, K. F.; Pazza, R. & Almeida-Toledo, L. F. (2009) Astyanax bockmanni Vari and Castro, 2007: an ambiguous karyotype in the Astyanax genus. Genetica 136: 135139. Kavalco, K. F.; Pazza, R.; Bertollo, L. A. C. & Moreira-Filho, O. (2004) Gene mapping of 5S rDNA sites in eight fish species from the Paraba do Sul river basin, Brazil. Cytogenetic and Genome Research 106: 107110.

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Mantovani, M.; Abel, L. D. S. & Moreira-Filho, O. (2005) Conserved 5S and variable 45S DNAr chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: 211-216. Martins, C. & Wasko, A. P. (2004) Organization and evolution of 5S ribosomal DNA in the fish genome. In: Focus on Genome Research. Editor: Clyde R. Williams, pp. 335-363. Mestriner, C. A.; Galetti-Jnior, P. M.; Valentini, S. R.; Ruiz, I. R. G.; Abel, L. D. S.; Moreira-Filho, O. & Camacho, J. P. M. (2000) Structural and functional evidence that a B chromosome in the characid fish Astyanax scabripinnis is an isochromosome. Heredity 85: 19. Pazza, R.; Kavalco, K. F. & Bertollo, L. A. C. (2006) Chromosome polymorphism in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae). 1. Karyotype analysis, Ag-NORs and mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in sympatric karyotypes and their possible hybrid forms. Cytogenetic and Genome Research. 112: 313319. Peres, W. A. M.; Bertollo, L. A. C. & Moreira Filho, O. (2008) Physical mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei, Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 31: 222-226. Pfister, S. C. & Moreira-Filho, O. (1997) Caracterizao citogentica de uma populao de Astyanax eigenmanniorum. Brazilian Journal Genetics (suppl) 20: 101. 43 Congresso Nacional de Gentica, Goinia (GO), Brasil. Pinkel, D.; Straume, T. & Gray, J. W. (1986) Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences 83: 2934-2938. Stripecke, R.; Nogueira-Pinto, M. T.; Hackel, C. & Sazima, I. (1985) O caritipo de Astyanax eigenmanniorum (Osteichthyes, Characidae). XII Congresso Brasileiro de Zoologia, pp 173 Campinas, Brasil. Torres-Mariano, A. R. & Morelli, S. (2008) B chromosomes in a population of Astyanax eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlndia, MG, Brazil). Genetics and Molecular Biology, 31: 246-249. Vari, R. P. & Castro, R. M. C. (2007) New Species of Astyanax (Ostariophysi: Characiformes: Characidae) from the Upper Rio Paran System, Brazil. Copeia, 1: 150162 Wasko, A. P. & Galetti-Jnior, P. M. (2000) Mapping 18S ribosomal genes in fish of the genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization (FISH). Genetics and Molecular Biology, 23: 135-138.

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a.

b.

Figura 1: Metfase de A. bockmanni tratada com CMA3, destacando em (a) o cromossomo B, indicado pela seta e em (b) as setas apontam seis cromossomos CMA3 positivos em regies telomricas.

Figura 2: Metfase de A. bockmanni tratada com DAPI. A seta indica o cromossomo supranumerrio.

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Figura 3: Metfase de A. bockmanni submetida tcnica de double FISH. As marcas vermelhas destacam os stios de DNAr 5S e as marcas verdes os stios de DNAr 18S. As pontas das setas indicam marcas discretas de stios de DNAr 5S e as setas destacam cromossomos portadores de marcas em sintenia.

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Captulo 4

Localizao de stios ribossmicos 5S e 18S em trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae (Pisces, Characidae) da bacia do Alto Paran Uberlndia (MG)

(Journal of Fish Biology)

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4. Localizao de stios ribossmicos 5S e 18S em trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae (Pisces, Characidae) da bacia do Alto Paran Uberlndia MG
Alessandra Ribeiro Torres-Mariano & Sandra Morelli Instituto de Gentica e Bioqumica Universidade Federal de Uberlndia

Resumo: O complexo de espcies Astyanax scabripinnis, pertencente ao gnero Astyanax classificado hoje como Incertae Sedis, composto por 15 espcies incluindo A. paranae. Nesse estudo foram analisadas 3 populaes de Astyanax sp gr A. paranae da bacia do Rio Araguari (Uberlndia, MG, Brasil) que apresentaram nmero cromossmico igual a 50, com algumas variaes na frmula cariotpica; AgNOR mltiplas coincidindo com os dados obtidos pelo tratamento com CMA3 e FISH utilizando sondas de DNAr 18. A sonda de DNAr 5S utilizada na FISH marcou um par de cromossomos metacntricos e um par acrocentrico nas 3 populaes. O tratamento com DAPI no evidencia uma distino concreta entre estas populaes. Apesar de esses dados serem coincidentes nessas populaes, elas exibem particularidades que permitem uma distino entre elas, provavelmente determinada pelo isolamento geogrfico a que esto submetidas. Palavras Chave: Astyanax scabripinnis, Fluorocromos, FISH e Genes ribossomais 4.1. Introduo Astyanax scabripinnis (Characidae, Incertae Sedis) foi considerada como um complexo de espcies a partir dos estudos de Moreira-Filho e Bertollo (1991), quando foram analisadas sete populaes de bacias hidrogrficas diferentes, citogentica e morfologicamente. Bertaco e Lucena (2006) consideram que esse complexo composto por aproximadamente 15 espcies, incluindo A. paranae.

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O nmero diplide das espcies que formam o complexo A. scabripinnis varia de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 (ALVES e MARTINS-SANTOS, 2002; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2005; PERES et al., 2008; VICARI et al., 2008), sendo este ltimo o mais comum. Suas regies organizadoras de nuclolos (NOR) normalmente so mltiplas. A impregnao com o nitrato de Prata nas regies organizadoras nucleolares (AgNORs) um mtodo indireto, j que a Prata tem afinidade pelas protenas associadas ao RNAr recm transcrito nos stios de DNAr e, por esse motivo, no evidencia todas as NORs existentes, mas apenas as ativas em interfases precedentes (HOWELL, 1977). Elas tambm podem ser evidenciadas pela colorao com Cromomicina A3 (CMA3) j que este um fluorocromo com afinidade por seqncias ricas em G-C (SCHWEIZER, 1976) que, na maioria das espcies de peixes, esto relacionadas s NORs (AMEMIYA e GOLD, 1986). Por outro lado, a hibridizao fluorescente in situ (FISH) revela a localizao exata de todos esses stios, independente de sua atividade, permitindo um melhor entendimento da organizao do genoma dos peixes, tendo sido bastante utilizada na localizao regies cromossmicas especficas, como DNA satlites (MESTRINER et al., 2000; MANTOVANI et al., 2004; ABEL et al., 2006, KAVALCO et al., 2007), alm dos stios ribossmicos 5S e 18S (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; KAVALCO et al., 2004; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2006a; KAVALCO et al., 2009). Nesse estudo foram analisados os caritipos de trs populaes de Astyanax sp. gr A. paranae da bacia do rio Araguari, pertencente bacia do Alto Paran, utilizando colorao convencional com Giemsa, impregnao com nitrato de Prata, CMA3, DAPI e FISH com sondas de DNAr 5S e 18S, com o objetivo de verificar possveis diferenciaes entre as populaes, decorrentes do isolamento geogrfico entre elas.

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4.2. Material e Mtodos Foram analisadas trs populaes de Astyanax sp gr A. paranae, sendo: 18 espcimes (4 machos, 12 fmeas e 2 sexo indefinido) oriundos do Crrego dos Caetano (184447S/0481842O) e aqui denominados de Astyanax sp CC; 11 exemplares (3 machos, e 4 fmeas e 4 sexo indefinido) do Crrego Quilombo (184447S/0481841O), identificados por Astyanax sp. Q e 9 indivduos (2 machos e 7 fmeas) provenientes de um aude localizado na fazenda Lageado, formado por uma nascente que desgua no Crrego dos Caetano (184443S/0481849O), denominados Astyanax sp. A. Todos esses locais de coleta fazem parte da bacia do Rio Araguari (Figura 1), contribuinte da bacia do Rio Paranaba, que o principal formador da bacia do Alto Paran; e se encontram localizados no municpio de Uberlndia, MG, Brasil. Os exemplares foram identificados pelo Prof. Dr. Francisco Langeani Neto e foram depositados na Coleo de Peixes da UNESP Campus So Jos do Rio Preto, SP, Brasil. Os cromossomos mitticos foram obtidos utilizando a tcnica descrita por Bertollo et al. (1978), com algumas modificaes. As NORs foram detectadas pela tcnica descrita por Howell e Black (1980), tambm com algumas adaptaes. A colorao com Cromomicina A3/Dapi foi realizada segundo a tcnica descrita por Christian et al. (1980), com modificaes. Os cstrons ribossmicos foram detectados utilizando sondas de DNAr 18S e 5S heterlogas, obtidas de Moenkausia sanctaefilomenae e a hibridao in situ fluorescente (FISH), realizada por meio da tcnica descrita por Pinkel et al. (1986), modificada. A morfologia dos cromossomos foi determinada com base na razo entre os braos, como proposto por Levan et al. (1964), sendo classificados como metacntricos (m), submetacntricos (sm), subtelocntricos (st) e acrocntricos (a). Foram analisadas, em mdia, 20 metfases por animal para se determinar o nmero e a frmula cariotpica de cada uma das populaes.

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4.3. Resultados e Discusso Apesar da grande diversidade cariotpica entre as espcies que compem o complexo A. scabripinnis, com nmero diplide variando entre 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50, a maioria das populaes estudadas possui 2n=50 cromossomos. Entretanto, mesmo que estas apresentem o mesmo nmero de cromossomos, cittipos diferentes so observados com freqncia (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991; MAISTRO et al., 2000; KAVALCO e MOREIRA-FILHO, 2003; MANTOVANI et al., 2004; VICARI et al., 2008). As trs populaes de Astyanax sp. Pertencentes ao grupo A. paranae, aqui examinadas, tambm apresentaram o nmero diplide igual a 50 cromossomos, tanto nos machos como nas fmeas. No foi evidenciado heteromorfismo cromossmico em relao ao sexo, indicando a ausncia de cromossomos sexuais diferenciados. O nmero fundamental e a frmula cariotpica correspondente para cada populao encontram-se relacionados na tabela 1 e os caritipos apresentados na figura 2. Embora conservando o mesmo nmero diplide, diferenas no tocante constituio do caritipo, ou seja, em relao aos cromossomos m, sm, st e a permitem uma diferenciao entre elas. No gnero Astyanax as NORs usualmente so mltiplas, mas com variaes numricas, de localizao e de posio. As trs populaes de Astyanax deste estudo seguiram esse mesmo padro. A deteco dessas regies pelo nitrato de Prata evidenciou a ocorrncia de AgNORs mltiplas, com variaes intra- e interpopulacionais. A princpio, estas regies foram sempre visualizadas em posio telomrica, tanto no brao curto como no brao longo de vrios cromossomos (Figura 3a, b e c). Embora no tenha sido possvel a identificao precisa de cada cromossomo portador dessas regies, pde-se verificar que elas se apresentaram distribudas entre as diferentes classes de cromossomos do caritipo, podendo ser bem caracterizado o primeiro par metacntrico como portador dessas regies nas populaes de Astyanax. sp. Q e Astyanax. sp. A (Figura 3b e c). Esta condio de NORs mltiplas foi confirmada pela FISH com sonda de DNAr 18S, onde foram mapeados, em mdia, 12 stios nas trs populaes (Figuras 6 a, b e c). Apesar do nmero de genes ribossmicos ser praticamente o mesmo,

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alguns cromossomos portadores desses stios parecem diferir entre as populaes, o que foi tambm observado em outras populaes de Astyanax que fazem parte do complexo A. scabripinnis (FERRO et al., 2001; ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2006b; VICARI et al. 2008; PERES et al. 2008) Em Astyanax sp. Q pde ser identificada a ocorrncia de um stio bitelomrico bem evidente, em um cromossomo acrocntrico (Figura 6b). A localizao de todos os stios de DNAr 18S tambm telomrica, o que coincide com a posio ocupada pelas AgNORs nos cromossomos. Coincidentemente, nas trs populaes, os stios CMA3+ foram tambm mltipos e telomricos (Figuras 4a, b e c). Em Astyanax sp A pode ser bem caracterizada a ocorrncia de stios fluorescentes no primeiro cromossomo metacntrico, assim como em ambos os telmeros de um cromossomo submetacntricos. Marcaes bitelomricas aparecem tambm nas populaes de Astyanax sp CC e Astyanax sp Q, porm em cromossomos acrocntricos. Esse fato corrobora a natureza GC rica das NORs, se no em todos pelo menos em alguns stios presentes no caritipo. Os dados obtidos com DAPI, por outro lado, no forneceram evidncias concretas de particularidades especficas nas trs populaes amostradas (Figura 5a, b e c). De acordo com Amemiya e Gold (1986), cromossomos de peixes e anfbios so muito semelhantes em sua composio e possuem regies ricas em pares de bases GC relacionadas com as NORs. Essas regies podem ser interespaadoras de heterocromatina associada s NORs ou dos prprios stios de DNAr. Artoni et al. (1999), consideram que a colorao com CMA3 no deve ser utilizada como um mtodo direto e nico de deteco dos genes ribossmicos, pois, ela tem afinidade por heterocromatina constituda de grande quantidade de bases GC, alm daquelas diretamente relacionadas com as NORs. A hibridao in situ fluorescente tem se mostrado eficiente na deteco dos stios ribossmicos, independentemente de sua atividade, sendo por isso frequentemente utilizada na complementao dos dados de AgNORs, a qual destaca apenas as regies que estiveram ativas em interfases precedentes (HOWELL, 1977). Como conseqncia, o nmero de stios ribossmicos detectados por FISH geralmente maior que os stios de AgNORs, principalmente nas espcies que apresentam NORs mltiplas. Este fato pode ser explicativo para os resultados
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obtidos no presente estudo, onde foi geralmente encontrado um nmero muito maior de stios ribossmicos do que de AgNORs. Por sua vez, o tamanho reduzido dos stios de NORs nas espcies analisadas pode tambm dificultar a deteco de todas as regies presentes no genoma, tanto por impregnao pela Prata como por FISH. Assim sendo, possvel que a presena de NORs em apenas um dos homlogos, como o caso do primeiro par metacntrico do caritipo de Astyanax sp Q e Astyanax sp A, seja conseqncia dessa problemtica tcnica. Alternativamente, Fernandes e Martins-Santos (2003, apud FERNANDES, 2006) sugerem que a presena de apenas um homlogo portador de stio de NOR possa ser tambm conseqncia de rearranjos cromossmicos. Quatro stios de DNAr 5S foram constatados nas trs populaes, dois deles localizados intersticialmente em um par metacntrico e dois na regio telomrica de um par acrocntrico (Figuras 6a, b e c). O nmero, a localizao e a posio dos stios de DNAr 5S podem ser tambm variveis em Atyanax, pois j foram observados de dois a oito loci intersticiais ou terminais. Entretanto, a ocorrncia de dois pares de cromossomos portadores desses cstrons tem sido predominante, com um cromossomo metacntrico de tamanho mdio constantemente marcado nas cinco populaes analisadas por Almeida-Toledo et al. (2002), que consideram esse fato como uma caracterstica conservada no gnero. Entretanto, Peres et al. (2008) destacam que essa no deve ser considerada uma caracterstica diagnstico do gnero, pois foi observada tambm em outros gneros da mesma famlia. A ocorrncia de um par acrocntrico com stio terminal no brao menor tambm foi destacada para outras espcies do complexo A. scabripinnis (FERRO et al., 2001; ALMEIDA-TOLEDO et al. 2002, MANTOVANI et al., 2005; FERNANDES e MARTINS-SANTOS, 2006b; PERES et al. 2008; VICARI et al., 2008). Em Astyanax sp. CC e Q foi observada a sintenia de stios de DNAr 5S e 18 (Figura 5a e b). A co-localizao dos stios ribossmicos 5S e 18S j foi descrita anteriormente em populaes de Astyanax pertencentes ao complexo A. scabripinnis, mas apenas em relao ao cromossomo metacntrico mdio, correspondente ao 2 ou 3 par do complemento (ALMEIDA-TOLEDO et al. 2002; MANTOVANI et al., 2005). Nas populaes de Astyanax sp CC e Astyanax sp Q,
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alm de sintenia em um cromossomo metacntrico, foi tambm visualizada essa situao em um cromossomo acrocntrico. As trs populaes aqui estudadas esto praticamente isoladas geograficamente (Figura 1), pois os crregos dos Caetano e Quilombo (Astyanax sp CC e Q), no apresentam comunicao entre si, porm os peixes do aude da Fazenda Lageado (Astyanax sp A) podem chegar ao Crrego dos Caetano, uma vez que ele desgua nesse local. A estrutura cariotpica geral de Astyanax sp. CC e Q so mais divergentes entre si, provavelmente decorrentes de seu isolamento geogrfico, enquanto que a estrutura cariotpica de Astyanax sp. A, apresenta uma maior semelhana com a de Astyanax sp. Q, apesar do isolamento geogrfico entre esses pontos. A formao do aude recente e seu ambiente difere das caractersticas dos crregos, provavelmente esses fatores estariam estimulando uma seleo entre indivduos que compem sua populao, resultando em caractersticas cariotpicas que a diferem quando comparadas com as outras duas populaes. No tocante aos stios de NORs (AgNORs e DNAr 18S), de DNAr 5S e CMA3+ h mais concordncia do que diferenas entre as trs populaes, visto que, de uma maneira geral, os resultados so concordantes entre elas, embora possam ocorrer alguns cromossomos marcadores especficos para cada populao. Destaca-se, entretanto, a aparente ausncia de sintenia nos espcimes de Astyanax sp. A. Assim sendo, coletivamente, os dados obtidos indicam que as populaes analisadas j apresentam certo grau de divergncia entre elas, no podendo, portanto, serem consideradas como uma unidade do ponto de vista evolutivo. A investigao de outros marcadores cromossmicos, como diferentes classes de DNAs repetitivos, podero contribuir para o melhor entendimento deste processo de diferenciao entre as populaes, bem como fornecer novos subsdios para uma definio de seu status taxonmico Agradecimentos: Dr. Francisco Langeani Neto, pela identificao dos exemplares; Dr. Fausto Foresti por me receber em seu laboratrio, Ms. Patrcia Elda Sobrinho por ceder as Sondas de DNAr 5S e 18S e Dra. Dbora Diniz, pela contribuio; CAPES, CNPq, FAPEMIG, and UFU (Brazil).
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4.4. Referencias Bibliogrficas Abel, L. D. S.; Mantovani, M. & Moreira-Filho, O. (2006) Chromosomal distribution of the As51 satellite DNA in two species complexes of the genus Astyanax (Pisces, Characidae). Genetics and Molecular Biology. 29: 448-452. Almeida-Toledo, L. F.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Bonillo, C.; Porto-Foresti, F.& Daniel-Silva MFZ (2002) Conservation of the 5S bearing chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogeneticis and Genome Research. 97: 229-233. Alves, A. L. & Martins-Santos, I. C. (2002) Cytogenetics studies in two populations of Astyanax scabripinnis with 2n = 48 chromosomes (Teleostei, Characidae). Cytologia 67: 117-122. Amemiya, C. T. & Gold, J. R. (1986) Chromomycin A3 stains nucleolus organizer regions of fish chromosomes. Copeia 1986: 226-231. Artoni, R. F.; Molina, W. F.; Bertollo, L. A. C. & Galetti-Jnior, P. M. (1999) Heterochromatin analysis in the fish species Liposarcus anisitsi (Siluriformes) and Leporinus elongatus (Characiformes). Genetics and Molecular Biology. 22: 39-44. Bertaco, V. A. & Lucena, C. A. S (2006) Two new species of Astyanax (Ostariophysi: Characiformes: Characidae) from eastern Brazil, with a synopsis of the Astyanax scabripinnis species complex. Neotropical Ichthyology. 4(1): 53-60. Bertollo, L. A. C.; Takahashi, C. S.; Moreira-Filho, O. (1978) Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of Genetic. 1: 103-120. Christian, A.; McNiel, E.; Robinson, J.; Drabek, R.; LaRue, S.; Waldren, C. & Bedford, J. (1998) A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes. Cytogenetic Cell Genetics. 82: 172179. Fernandes, C. A. & Martins-Santos, I. C. (2005) Sympatric occurrence of three cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the River Iva Basin, state of Paran, Brazil. Genetica 124: 301-306. Fernandes, C. A. Estudos citogenticos em trs espcies do gnero Astyanax, com nfase no DNA ribossomal. Tese (Doutorado em Cincias Biolgicas), Programa de ps-graduao em Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Maring, Maring 74f. (2006). Fernandes, C. A. & Martins-Santos, I. C. (2006a) Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paran river basin, Brazil. Genetics and Molecular Biology, 29: 464-468.

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Fernandes, C. A. & Martins-Santos, I. C. (2006b) Chromosomal location of 5S and 18S rRNA genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the Iva river basin, state of Parana, Brazil. Caryologia, 59: 253-259. Ferro, D. A. M.; No, D. M.; Moreira-Filho, O. & Bertollo, L. A. C. (2001) Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rDNA in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): Population distribution and functional diversity. Genetica 110: 55-62 Howell, W. M. (1977) Visualization of ribossomal gene activity: silver stains proteins associated with rRNA transcribed from oocyte chromosomes. Chromosoma 44: 367-370. Howell, W. M. & Black, D. A. (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: 1014-1015. Kavalco K. F. & Moreira-Filho, O. (2003) Cytogenetical analyses in four species of the genus Astyanax (Pisces, Characidae) from Paraba do Sul River Basin. Caryologia, 56: 453 461. Kavalco K. F.; Pazza R.; Bertollo, L. A. C. & Moreira-Filho, O. (2004) Gene mapping of 5S rDNA sites in eight fish species from the Paraba do Sul river basin, Brazil. Cytogenetic. Genome Research. 106: 107-110 Kavalco, K. F.; Pazza, R.; Bertollo, L. A. C. & Moreira-Filho, O. (2007) Satellite DNA sites in four species of the genus Astyanax (Teleostei, Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 30: 529-535. Kavalco, K. F.; Pazza, R. & Almeida-Toledo, L. F. (2009) Astyanax bockmanni Vari and Castro, 2007: an ambiguous karyotype in the Astyanax genus. Genetica 136: 135139. Levan, A & Fredga, K. (1964) Sandberg AA: Nomenclature for centromeric postion on chromosome, Hereditas 52: 201-220. Maistro, E. L.; Oliveira, C. & Foresti, F. (2000) Sympatric occurence of two cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae), Genetics and Molecular Biology, 23: 365-369. Mantovani, M.; Abel, L. D. S.; Mestriner, C. A. & Moreira-Filho, O. (2004) Evidence of the differentiated structural arrangement of constitutive heterochromatin between two populations ogy, 27: 436-442.of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae), Genetics and Molecular Biol Mantovani, M.; Abel, L. D. S.; Mestriner, C. A. & Moreira-Filho, O. (2005) O Conserved 5S and variable 45S rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: 211-216.

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Mestriner, C. A.; Galetti-Jnior, P. M.; Valentini, S. R.; Ruiz, I. R. G.; Abel, L. D. S.; Moreira-Filho, O. & Camacho, J. P. M. (2000) Structural and functional evidence that a B chromosome in the characid fish Astyanax scabripinnis is an isochromosome, Heredity 85: 1-9. Moreira-Filho, O. & Bertollo, L. A. C. (1991) Astyanax scabripinnis (PISCES, CHARACIDAE): a species complex. Brazilian Journal of Genetics. 14: 331-357. Peres, W. A. M.; Bertollo, L. A. C. & Moreira-Filho, O. (2008) Physical mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei, Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 31: 222-226. Pinkel, D.; Straume, T. & Gray, J. W. (1986) Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences 83: 2934-2938. Reis, R. E.; Kullander, S. O. & Ferraris, C. 2003 Check List of Freshwater of South and Central America. Porto Alegre: Edipucrs.742 p. Schweizer, D. (1976) Reverse Fluorescent Chromosome Banding with Chromomycin and DAPI. Chromosoma 58: 307-324 Vicari, M. R.; Noleto, R. F.; Artoni, R. F.; Moreira-Filho, O. & Bertollo, L. A. C. Comparative cytogenetics among species of the Astyanax scabripinnis complex. Evolutionary and biogeographical inferences. Genetics and Molecular Biology, 31: 173-179.

53

Tabela 4.1: Frmula cariotpica e nmero fundamental das 3 populaes de Astyanax do grupo A. paranae analisadas. Nmero Fundamental 94 92 92

2n Astyanax sp CC Astyanax sp Q Astyanax sp A Lageado. 50 50 50

Frmula Cariotpica 6m + 28sm + 10st + 6a 10m + 26sm + 6st + 8a 6m + 30sm + 6st + 8a

Legenda: CC Crrego dos Caetano, Q Crrego Quilombo, A aude da Fazenda

Figura 1: Foto de satlite retirada do software online Google Earth, mostrando a localizao dos pontos de coleta em relao ao Rio Araguari.

54

a.

b.

55

c.

Figura 2: Caritipos de Astyanax sp. CC (a); Astyanax sp. Q (b) e Astyanax sp. A (c).

56

a.

b.

c.

Figura 3: Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando AgNORs. As setas indicam os stios mais evidentes de NORs.

57

a.

b.

c.

Figura 4: Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando stios CMA3 positivos. As cabeas de seta destacam os cromossomos portadores de stios CMA3+ bitelomricos. .

58

Figura 5: Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A submetidas ao tratamento com DAPI.

59

a.

b.

c.

Figura 6: Metfases de Astyanax sp. CC, Q e A evidenciando stios de DNAr 5S (vermelho setas largas) e 18S (verdes setas estreitas). Note a ocorrncia de um cromossomo com stios de DNAr 18S bitelomricos em (b), indicado pela cabea de seta e de sintenia em cromossomos metacntricos (a e c) e acrocntricos (c).

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Captulo 5

Consideraes e Concluses Finais

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5. Consideraes e Concluses Finais

Esse estudo consiste na anlise citogentica de 4 populaes de peixes do gnero Astyanax provenientes do Crrego dos Caetano, Crrego Quilombo, e Aude da Fazenda Lageado, contribuintes da bacia do Rio Araguari no municpio de Uberlndia (MG Brasil). Exemplares de A. bockmanni coletadados no Crrego dos Caetano, foram descitos em um estudo anterior por Torres-Mariano e Morelli (2008) que determinaram o nmero de cromossomos, Ag-NOR, banda C e encontraram um ou dois cromossomos supranumerrios em fmeas. O presente trabalho complementou esses dados, mapeando fisicamente as NOR e o DNAr 5S; e caracterizando a heterocromatina que forma seus cromossomos supranumerrios. Os resultados revelaram seis cromossomos portadores de NOR quando submetidos AgNOR, CMA3 e FISH com sonda de DNAr 18S. Com a sonda de DNAr 5S foi possvel observar 2 pares de cromossomos marcados e o DAPI revelou que a heterocromatina que compe o cromossomo supranumerrio rica em AT. Dados citogeneticos relativos a essa espcie so escassos com apenas mais duas populaes de A. bockmanni da bacia do Rio Parapanema descritas citogeneticamente. Elas apresentaram resultados divergentes em relao s NORs e stios ribossmicos 5S; e ausncia de cromossomos supranumerrios (KAVALCO et al., 2009). Com as particularidades inerentes a cada uma dessas populaes possvel diferenci-las e propor que A. bockmanni forme um grupo de espcies. Foram descritas tambm, 3 populaes de Astyanax sp gr A. paranae, pertencente ao complexo de espcies A. scabripinnis, aqui denominadas Astyanax sp CC, Astyanax sp Q e Astyanax sp A, de acordo com o local onde foram coletadas. Com as anlises foi possvel determinar o nmero e tipos de cromossomos que formam seu caritipo, assim como seus nmeros fundamentais. Apesar do nmero cromossmico ser igual entre elas, seus cittipos so diferentes. Foi possvel tambm caracterizar as NORs, utilizando AgNOR, CMA3 e FISH com sonda de DNAr 18S; e o stio ribossmico 5S. A comparao entre as trs populaes revelou que

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elas apresentam algumas semelhanas. Em relao s NORs, so mltiplas, com uma mdia de 12 cromossomos com marcas positivas, tanto com CMA3, quanto com FISH utilizando sonda de DNAr 18S, assim como a maioria das outras espcies do complexo A. scabripinnis. A sonda 5S revelou a presena de 4 cromossomos marcados nas trs populaes. Apesar das semelhanas, cada uma dessas populaes apresenta caracterisitcas que lhes so peculiares. Foi possvel observar, por exemplo, marcas bitelomricas em um cromossomo acrocentrico do complemento nas populaes de Astyanax sp CC e Q, porm em Astyanax sp A essa marca se encontra em um cromossomo submetacentrico. Com a FISH utilizando sonda 18S a marca bitelomerica foi destacada na populao de Astyanax sp Q. Foram encontrdas tambm marcas sintnicas dos stios ribossmicos 5S e 18S nas populaes de Astyanax sp CC e Astyanax sp Que, ausente em Astyanax sp A. As diferenas aqui observadas provavelmente so conseqncia do isolamento geogrfico entre essas populaes, pois o Crrego dos Caetano e Crrego Quilombo esto completamente isolados entre si. O Aude desgua no Crrego dos Caetano fato este que, teoricamente, permite uma interao entre essas duas populaes, porm quando seus dados so comparados, elas apresentam diferenas. Dessa forma, no devem ser consideradas como uma unidade do ponto de vista evolutivo. Para se definir sua taxonomia, so necessrios estudos utilizando outros marcadores cromossmicos, tais como diferentes classes de DNAs repetitivos.

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