Chung et al., 2010.

BMC Plant Biology, 10:103-128

Introduo
Patognese uma srie de eventos que ocorre numa interao patgeno-hospedeiro;

Loci de resistncia que afetam distintos estgios da patognese do fungo: uso de linhas de introgresso para mapeamento de QTL e caracterizao do patossistema milho Setosphaeria turcica

A variao gentica no hospedeiro e/ou patgeno pode ter efeitos quantitativos ou qualitativos sobre a extenso da doena; Resistncia quantitativa tenha um efeito relativamente pequeno sobre a patognese, este tipo de resistncia de interesse agrcola, porque mais durvel; Um grande nmero de QTL para resistncia a doena foram mapeadas em plantas, mas pouco se sabe sobre as bases genticas subjacentes ou mecanismos de defesas envolvidos.

Introduo
Mancha foliar foi utilizada como sistema modelo para identificar e caracterizar QTL de doena em nvel macro e microscpico. Setosphaeria turcica (Exserohilum turcicum anamorfo) Uma das doenas foliares mais prevalentes na maioria das regies de cultivo de milho do mundo. Formas qualitativas e quantitativas de resistncia contra S. turcica esto disponveis em germoplasma, e tm sido amplamente utilizados, isolados ou em associao, nos programas de melhoramento de resistncia.

Introduo
Anlise de QTLs utilizando linhagens recombinantes (RILs) proporciona maior estatstico na deteco de QTL. puras poder

Linhas de introgresso podem ser eficientemente utilizadas para produzir linhas quase-isognicas (NILs), que permitem uma anlise cuidadosa dos efeitos fenotpicos associados com os segmentos introgredidos. No geral, a resistncia em plantas adultas ou folhas mais velhas maior do que em plantas jovens; A expresso e a eficcia de muitos genes/QTL tem sido observados sendo regulados por condies ambientais. Saber se o QTL doena confere resistncia especfica ou de amplo espectro.

Introduo
Utilizao de linhas de introgresso e derivados de NILs para mapeamento de QTLs e caracterizao macro e microscpica do patossistema Setosphaeria turcica-milho. Linhas de introgresso disponveis TBBC3;
Gentipo doador Tx303; Gentipo parental recorrente B73;

Material e Mtodos
Material vegetal: Conjunto de 82 linhas de introgresso (Univ. CN); Informao genotpica foi publicamente disponibilizada para cada linha, consistindo de 14 RFLPs e 116 SSR no genoma. Avaliao da mancha foliar Cultivo do fungo meio LCA e em gros de sorgo; Plantas juvenis (5-6 folhas) e plantas adultas (2 semanas antes do espigamento) Inculo lquido CV Inculo slido Campo

Material e Mtodos
Caracterizao fenotpica da resistncia mancha foliar:
Anlise microscpica Eficincia de infeco; Incidncia de multiplos apressrios Eficincia na invaso vascular Dimetro reforado de rea fluorescente Anlise macroscpica PI EL AFD primria AFD SD CPD Curva de progresso da doena Quantificao da biomassa fngica na planta por qPCR.

Material e Mtodos
Avaliao para resistncia mltipla a doenas: Murcha de Stewart Pantoea stewartii; Antracnose Colletotrichium graminicola; Carvo Ustilago maydis; Ferrugem Puccinia sorghi. Anlise microscpica Extrao de DNA e genotipagem (SSR DNA Analyzer); Desenho experimental: Aurora (NI) Clayton (CN) 2 repeties 14 blocos por repetio 6 linhas experimentais com linha controle B73.

Linhas de introgresso da populao BC3

Subconjunto de linhas de introgresso

(A) Avaliao fenotpica do conjunto completo de 82 linhas de introgresso (PI, AFL e SD). (B) Identificao de linhas que diferiam de B73 ou que apresentavam fenotpica de 15 linhasalm introgresso de QTLs (C) Avaliao fentipos extremos, de putativos. selecionadas quanto a resistncia/suscetibilidade mancha foliar comparada a B73. Juvenis e adultas (PI, AFL, EL).

Identificao de outliers e QTLs putativos mancha foliar na populao TBBC3

B73 x linhas de introgresso selecionadas (D) Desenvolvimento de populaes segregantes BC4F2 (E) Cada planta foi testada com marcadores-alvo para as regies introgredidas. Foram determinados QTLs candidatos mancha foliar (F) Desenvolvimento de NILs carregando diferentes introgresses de Tx303 provenientes de populaes F2. (G) Validao de QTL nas NILs. (H) Seleo de NILs carregando QTL para caracterizao detalhada do mesmo. (I) NILs avaliados com vrios componentes da doena alvo em suas diferentes fases de desenvolvimento. (J) Caracterizao preliminar dos potenciais efeitos do QTL em mltiplas doenas.
Figura 1 - Estratgias para o mapeamento e caracterizao de QTLs usando linhas de introgresso.

82 linhas de introgresso
A populao TBBC3 foi geralmente mais suscetvel que B73 tanto em NI quanto na CN; Em Aurora (NI)
3 linhas foram consideradas mais resistentes; 20 linhas foram consideradas mais suscetveis que B73 AFL primria; 39 foram mais suscetveis que B73 com base na curva de progresso da doena.

Populaes BC4F2

Conjuntos derivados de NILs

NILs selecionados

Em Clayton (CN)
8 linhas foram consideradas mais resistentes; 13 foram mais suscetveis que B73 com base na curva de progresso da doena.

Avaliao fenotpica no subconjunto de 15 linhas TBBC3

Validao de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303 em conjuntos selecionados de NIL
Mais suscetveis que B73 (parental recorrente) resistentes
Consistentemente mais resistente Consistentemente mais suscetvel

Figura 2 Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (A) Diferentes nveis de resistncia em B73, Tx303, TBBC3-38-05F (NIL com qNBL1.06) e TBBC3-4210E-02 (com qNBL1.02). Fotos tiradas em Aurora (NI), 7 folha - 28 DAI.

Validao de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303 em conjuntos selecionados de NIL

Tubo de penetrao Linhagem CML52 (resistente). Os do condios continuam a produzir novos apressrio perfurando a Germinao do condio e tubos germinativos at esgotar suas cutcula e parede celular formao do apressrio. reservas.

Diminuio citoplasmtica do condio foi observada aps processo de infeco, propagao das hifas a clulas adjacentes causando morta da hospedeira. Figura 2 Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (B) Substituio do alelo B73 pelo alelo Tx303 (1.02) aumenta e muito a suscetibilidade mancha foliar. Fotos tiradas em Aurora (NI), 68 DAI. Figura 3 Micrografias de luz da infeco e recente colonizao de S. turcica em folhas de milho. Amostras da casa de vegetao coradas com azul de tripano.

Hifas infectivas Condio crescendo em germinando na contato com as superfcie da folha. clulas do mesfilo Resposta de Hifas crescendo defesa induzida emfora dodo local torno feixe vascular vizinhos da infeco. Deposio de calose e acmulo de compostos Hifas se fenlicos espalhando com autofluorescentes. sucesso pelo sistema vascular

Hifas infectivas crescendo em direo ao feixe vascular

Movimento das hifas atravs do feixes vasculares

Colonizao necrtica de hifas na leso de murcha

Figura 4 Micrografias de fluorescncia da patognese de S. turcica em folhas de milho. Amostras da casa de vegetao tratadas com azul de anilina-KOH.

Figura 5 Investigao microscpica dos efeitos de QTL nos componentes da doena.

Efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica na planta

Caracterizao preliminar dos efeitos potenciais dos QTLs para mltipla resistncia a doenas - NILs
Diferenas significativas foram observadas entre Tx303 e B73;
Em campo Tx303 resistente Murcha de Stewart e antracnose; Em campo B73 mais resistente ao carvo e ferrugem comum;

Coleta 9 DAI

Figura 6 Quantificao do efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica na planta usando DNA baseado qPCR

Evidncias sugerem que qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 foram efetivos para resistncia murcha de Stewart; NILs que possuiam qNBL1.06Tx303 eram mais resistentes que B73; qNBL1.06Tx303 foi ineficiente para resistncia antracnose, carvo e ferrugem; qNBL1.02B73 foi ineficiente para resistncia antracnose e carvo, mas potencialmente eficiente para ferrugem.

Discusso
2 QTLs para resistncia mancha foliar, qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 foram identificados com sucesso, validados e caracterizados usando populao de linhas de introgresso e derivados de NILs. O mecanismo subjacente resistncia conferido por qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 improvvel que seja o mesmo que o mecanismo subjacente a resistncia qualitativa conferidos por genes importantes conhecidos atualmente.

Discusso
PI uma caracterstica-alvo conveniente na seleo e melhoramento para resistncia a mancha foliar; qPCR foi empregado pela 1 vez para medio da biomassa de S. turcica na planta (apenas nos estgios iniciais da doena); Apesar do custo elevado, o qPCR serve como boa ferramenta para quantificar mais cedo o grau de colonizao micelial de S. turcica.

Discusso
H#1 - QTL individual afeta distintos estgios do desenvolvimento da doena Avaliaes macro e microscpicas revelaram caractersticas distintas de qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 e no desenvolvimento da doena; Incorporando um QTL eficaz em retardar a invaso da vasculatura deve assim aumentar consideravelmente a resistncia total.

Discusso
H#2 Eficcia do QTL para doena afetada pela maturidade da planta Geralmente a expresso consistente da resistncia ou suscetibilidade foi observada nas duas fases (florao e desenvolvimento da doena), no apresentando nenhuma implicao na eficcia destes QTLs em plantas maduras.

Discusso
H#3 A eficcia do QTL afetado por condies ambientais Uma grande limitao para aplicaes de QTLs a falta de consistncia dos efeitos destes em diversos ambientes; Os dados obtidos nesse trabalho foram consistentes nos locais avaliados, sugerindo sua aplicabilidade para o melhoramento gentico a resistncias. Os resultados sugerem que a resistncia de qNLB1.02B73 foi expresso de forma estvel na CV e no campo, enquanto que qNLB1.06Tx303 conferia um nvel de resistncia maior no campo do que na CV.

Discusso
H#4 QTL para resistncia mancha foliar inclui genes ou grupos de genes que envolvem um amplo espectro de resistncia Em NILs sugere-se que tanto qNLB1.02B73 quanto qNLB1.06Tx303 abranjam gene(s) que contribuem com efeitos inespecficos de defesa.

Concluso
Identificao bem sucedida de 2 QTLs expressos seguramente, que pode potencialmente ser utilizado para proteger o milho de S. turcica em diferentes ambientes. Clonagem baseada em mapas ir revelar mais sobre os genes e os mecanismos subjacentes s caractersticas distintas de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 nas fases da patognese. Mapeamento de grandes populaes foram gerados a partir do NILs e o mapeamento fino de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 est em andamento.

Obrigada!