2 Espectrometria de fluorescncia molecular

2.1. Fluorescncia molecular

2.1.1. O Fenmeno A luminescncia molecular a emisso de radiao eletromagntica (na

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regio do ultravioleta prximo-visvel) proveniente de molculas que foram excitadas, retornando ao seu estado fundamental. Esse fenmeno denominado de fotoluminescncia, quando a absoro de ftons de luz (hnex) o responsvel pela excitao da molcula pela elevao de eltrons de valncia de um orbital menos energtico para um orbital de maior energia. A luminescncia molecular formalmente dividida em fluorescncia e fosforescncia, dependendo da natureza do estado excitado envolvido no processo. Se o estado excitado envolvido singleto, onde o spin do eltron no orbital excitado mantm sua orientao original, tem-se a fluorescncia (Figura 7). Por outro lado, na fosforescncia, a orientao do eltron que foi promovido ao estado excitado invertida (estado excitado tripleto, Tn). Em conseqncia da reteno da orientao original, o retorno de uma populao que se encontra no estado excitado singleto para o estado fundamental (que tem carter singleto), permitido e ocorre muito rapidamente (tempo de vida na ordem de ns). Assim, a fluorescncia intrinsecamente um fenmeno luminescente mais comum que a fosforescncia, competindo eficientemente com processos de desativao no-radiativos do estado excitado. Como conseqncia direta disso, possvel observar facilmente fluorescncia na temperatura ambiente e diretamente em soluo, o que torna o procedimento experimental fluorimtrico bastante simples.

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Figura 7: Representao do estado fundamental e dos estados excitados singleto e tripleto.

Aps a absoro de radiao de comprimento de onda caracterstico, a populao de molculas promovida para um estado excitado singleto, Sn, (Figura 8). Segundo a regra de Kasha, a molcula se desativa por relaxamento atravs dos nveis vibracionais de estados eletrnicos de mesma multiplicidade at atingir o
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primeiro nvel vibracional do estado excitado singleto de menor energia (S1). Este processo de relaxamento recebe o nome de cruzamento interno (CI) e um fenmeno que ocorre com muita rapidez (10-l3 a 10-11 s) e sem emisso de radiao.

Figura 8: Diagrama de Jablonski modificado. (A) absoro de um fton, (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (RV) relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CSI) cruzamento intersistemas, (Tn) estado excitado tripleto. (Adaptado de Cardoso, 2003)

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A partir de S1, se a multiplicidade da populao molecular no mudar, ela pode seguir dois caminhos para retornar ao estado fundamental. Primeiro, se a diferena de energia entre S1 e S0 (estado fundamental) no for muito grande e existir possibilidade de sobreposio de nveis vibracionais, a molcula pode ser levada ao mais baixo nvel vibracional de S1 por relaxamento vibracional sem emisso de radiao eletromagntica, ou seja, ocorre um CI. Se, no entanto, a diferena energtica entre S1 e S0 for relativamente grande, a desativao para o estado fundamental se d com emisso de radiao na forma de fluorescncia. A fluorescncia a base da fluorimetria que engloba o conjunto de tcnicas analticas baseadas na deteco dos ftons emitidos por molculas excitadas de carter singleto quando estas retornam para o estado fundamental.

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2.1.2. Fatores que afetam a fluorescncia

Para que ocorra a fluorescncia, uma molcula precisa ter estrutura apropriada e estar em um meio que favorea a desativao radiativa S1 S0, sendo esses dois fatores crticos na magnitude da eficincia quntica fluorescente (ff ) de uma substncia. A eficincia quntica fluorescente de uma substncia a razo entre o nmero de ftons emitidos por fluorescncia e o nmero de ftons absorvidos (Equao 1). Uma molcula ser significativamente fluorescente se sua eficincia quntica tiver magnitude considervel (entre 0,1 e 1).

(1)

IF =ff IA

onde IF e IA so respectivamente as intensidades da radiao fluorescente e absorvida. Embora seja difcil prever teoricamente se uma molcula exibir luminescncia sem o prvio conhecimento da diferena de energia relativa entre o

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estado excitado singleto e o fundamental, pode-se, de um modo geral, se observar alguns requisitos. Primeiramente, molculas relativamente rgidas e ricas em eltrons p (como no caso das molculas aromticas), contendo ou no heterotomos em sua cadeia principal, so potencialmente fluorescentes. Estruturas moleculares rgidas (com restries de liberdade vibracional) tm o processo de desativao no-radiativo por CI significantemente minimizado com conseqente aumento da ff. J uma estrutura molecular planar favorece a fluorescncia, pois aumenta a interao e conjugao entre o sistema de eltrons p. A fluorescncia advm de transies p* p (entre orbital pi anti-ligante orbital pi ligante) e em menor escala p* n (entre orbital pi anti-ligante orbital no-ligante). A presena de grupos substituintes na molcula tambm fator importante, pois afeta a intensidade e o tipo de luminescncia, sendo que a presena de grupos hidroxi (-OH), metoxi (-OR), amino (-NR2), cianeto (-CN) e
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sulfnico (-SO3H) tm tendncia em amplificar a fluorescncia. Por outro lado, grupos cetnicos (-C=O) carboxlicos (-COOH) e halognios (-X) favorecem o cruzamento intersistemas, trocando a multiplicidade da populao excitada (S1 Tn) e por conseqncia diminuindo fluorescncia (Ingle e Crouch, 1988). Outros fatores tambm so essenciais, tais como: a temperatura, pH, solvente e a presena de outras espcies podem ter um profundo efeito nas caractersticas luminescentes de uma substncia, afetando no somente a velocidades dos processos luminescentes e dos processos no-radiativos, mas tambm a natureza e a energia relativa do estado excitado de menor energia (Schulman, 1977). Em geral o aumento da temperatura tem como conseqncia um aumento na eficincia dos processos de relaxamento vibracional (CI) na desativao do estado excitado. No entanto, por ser um fenmeno de tempo de vida relativamente curto, esse fator menos crtico no caso da fluorescncia, o que permite fcil observao do fenmeno na temperatura ambiente. A natureza do sistema de solventes tambm fator relevante sendo que a sua viscosidade, polaridade e carter prtico podem afetar significantemente a luminescncia. A viscosidade pode diminuir a taxa de colises bimoleculares desativadoras (quenching) pela diminuio da difuso de espcies desativadoras e do oxignio no meio. No caso da fluorescncia, a presena do oxignio no

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crtica, pois este apenas desativador do estado excitado tripleto, sendo assim, este um parmetro importante, no caso da fosforescncia. J a polaridade e o carter prtico do solvente so importantes, pois afetam a energia do estado excitado (Ingle e Crouch, 1988). As molculas rapidamente se reorientam em torno da molcula luminescente logo aps serem promovidas para o estado excitado e antes do retorno para o estado fundamental. Conseqentemente, a energia relativa do estado excitado aps a fluorescncia pode ser significantemente diferente do que era durante o processo de absoro. No caso das transies p-p*, comuns na fluorescncia, a molcula no estado excitado mais polar e tem carter mais bsico do que quando ela se encontra no estado fundamental. Assim, o aumento da polaridade do solvente ou do seu carter prtico, acarreta numa diminuio da energia relativa do estado excitado, com deslocamento batocrmico do espectro
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(em direo ao vermelho). Essa diminuio de energia pode tambm acarretar no aumento da eficincia da CI com a contrapartida da diminuio da fluorescncia. No caso das transies n-p*, o estado excitado menos polar e o aumento da polaridade ou do carter prtico do solvente ocasiona deslocamentos hipsocrmicos (em direo ao azul). Outro efeito comum decorrente da mudana do estado excitado singleto de n,p* para p,p* (se as energias dos mesmos forem prximos o suficiente para permitir a troca) na presena de solventes polares ou de maior carter prtico. Isso explica o porqu de algumas substncias no fluorescerem ou apresentarem fraca fluorescncia em solventes apolares ou no-prticos enquanto fluorescem intensamente em solventes polares e prticos (Ingle e Crouch, 1988). O efeito do pH nos sistemas de solventes prticos relevante na fluorescncia em molculas aromticas contendo grupos funcionais bsicos ou cidos, sendo muito comum observar significante diferena entre as propriedades luminescentes de molculas protonadas e no-protonadas. Em fluorescncia, certos ctions e nions de elementos de elevada massa atmica causam a desativao do estado excitado singleto, seja pela mudana da multiplicidade do mesmo (S1 Tn) ou pelo aumento da velocidade dos processos de desativao no-radiativos. Por exemplo, no caso dos halogenetos, esse efeito mais comum para o iodeto, seguido do brometo e em muito menor intensidade

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para o cloreto e fluoreto. Esse maior efeito desativador do estado excitado singleto causado por ons mais pesados se deve ao melhor acoplamento spin-orbital obtido entre esses ons e molculas no estado excitado. Esse efeito, denominado de efeito externo do tomo pesado, tambm observado para outros ons tais como Cd2+, Pb2+, Hg2+ e Tl+. Outras substncias podem desativar o estado excitado singleto por meio do quenching dinmico. Quenching pode ser definido como transferncia de energia, por processo no-radiativo, da substncia de interesse no estado excitado (fluorforo) para outras molculas, que sero denominadas aqui como agentes desativadores (Q), que por sua vez passam para o estado excitado enquanto o fluorforo retorna para o estado fundamental. O quenching dinmico um processo colisional e por isso requer o contato entre as espcies envolvidas. Em conseqncia, a magnitude dessa desativao proporcional concentrao do
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agente desativador e da sua capacidade de difuso no meio.

Substncias

concomitantes, presentes em maiores concentraes, podem tambm reduzir a luminescncia lquida emitida por uma populao de fluorforos por meio da reabsoro da fluorescncia (absoro secundria) (Ingle e Crouch, 1988; Schulman, 1977).

2.1.3. Relaes quantitativas A relao existente entre concentrao (C) e a intensidade da radiao absorvida (Ia) dada pela Lei de Beer-Lambert (Equao 2). (2) Ia = I0 It = I0 (1-10-eCl)

onde I0 e It so, respectivamente, as intensidades de radiao incidente e transmitida, e a absortividade molar caracterstica da molcula absorvente, C a concentrao do analito e l a espessura do caminho tico percorrido pela radiao dentro do compartimento onde se encontra a amostra. No processo luminescente, Ia passa a ser denominada de radiao de excitao.

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Como vrios processos competem pela desativao do estado excitado singleto, a intensidade de fluorescncia If (Equao 3) obtida multiplicando-se a Equao 2 por ff que o fator que indica a frao de molculas no estado excitado que efetivamente fluorescem. (3) If = ff Ia Assim, combinando-se as Equaes 2 e 3, temos a Equao 4: (4) If = ff I0 (1-10-eCl) Considerando que a amostra contendo o fluorforo (substncia fluorescente) esteja em soluo, que exista mnima perda por espalhamento da radiao de
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excitao, e que os valores de e.C.l seja menor que 0,02 (condies opticamente finas observadas em solues diludas de fluorforo), pode-se fazer a expanso em srie da Equao 4. Os termos superiores da srie podem ser negligenciados para simplificar o procedimento, obtendo-se assim a Equao 5: (5) ou (6) If = k C If = 2,3ff I0e.C l

onde o valor de k pode ser facilmente obtido a partir de uma curva analtica. O efeito quantitativo da presena de agentes desativadores na fluorescncia medida dado pela relao de Stern-Volmer (Equao 7).

(7)

I0 F IF

= 1 + K q [Q]

onde I0F e IF so as intensidades das fluorescncias na ausncia e na presena do agente desativador Q, Kq a constante de Stern-Volmer, que por sua vez a razo

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entre a constante de velocidade do quenching (kq) e o somatrio dos outras constantes de velocidade dos processos de destativao do estado excitado singleto a mencionar: a constante de velocidade da fluorescncia (kF), a constante de velocidade do cruzamento interno (kCI) e a constante de velocidade do cruzamento intersistemas (kCIS), que por sua vez o processo de mudana de multiplicidade do estado excitado (S1 Tn). A relao entre Kq e kq dada pela Equao 8, onde t0 o tempo de vida do evento luminescente na ausncia do agente desativador. (8) Kq = kq t0 Considerando que a taxa para coliso bimolecular em soluo na temperatura ambiente da ordem de 1010 L mol-1s-1, e que de todas as colises
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resultam em desativao, o valor mximo para kq ser 1010 L mol-1s-1. No caso da fluorescncia, cujo tempo de vida da ordem de ns (por exemplo, t0 = 1 ns), o valor esperado para Kq 10 L mol-1, que ao ser substitudo na Equao de SternVolmer, implica em um quenching dinmico da fluorescncia quase negligencivel para concentraes de agente desativador na ordem de 1 mmol L-1. Para efeito de comparao, no caso da fosforescncia (que tem t0 da ordem de ms), kq pode alcanar 107 L mol-1, o que implica em total desativao da luminescncia com concentraes de agente desativador na ordem de 1 mmol L-1. Assim, no caso da fluorescncia espera-se desativao significativa apenas em casos onde o agente desativador for um componente majoritrio na matriz onde o analito se encontra (por exemplo, uma substncia ativa associada presente em maior quantidade ou um veculo, no caso de medicamentos), j considerando as diluies inerentes preparao da amostra. Fica claro a partir da discusso acima, que o conhecimento dos parmetros experimentais fundamental para se aproveitar o potencial mximo do fenmeno luminescente, em aplicaes na qumica analtica, pois a manipulao de condies pode acarretar em significante aumento tanto da sensibilidade quanto da seletividade das determinaes fluorimtricas (Ingle e Crouch, 1988 e Schulman, 1977).

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2.2. Derivao fotoqumica

Substncias que no apresentam luminescncia intrnseca natural podem ser induzidas a fluorescer ou fosforescer atravs de diversas reaes que modificam a estrutura da molcula e conseqentemente as propriedades fsico-qumicas dessas substncias, obtendo-se assim, um derivado luminescente (derivao). Para a obteno destes derivados pode-se efetuar, como por exemplo, reaes com agentes oxidantes, agentes redutores, agentes fluorognicos ou fosfognicos (Yamaguchi et al., 1991; Katayama et al., 1993; Shibata et al., 1998), formao de quelatos com ons de terras raras e at mesmo por meio de simples reaes cido-base (Schulman, 1977). Esta tcnica amplamente utilizada em mtodos analticos baseados na fluorescncia. Existe um outro tipo de derivao onde a molcula do analito de interesse
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modificada por meio de reaes fotoqumicas provocadas principalmente por radiao eletromagntica na regio do ultravioleta (UV). O tratamento com UV usado para obter a espcie derivada de um analito que possa ter, por exemplo, um rendimento quntico luminescente mais elevado, que melhore a sensibilidade das determinaes analticas. Alternativamente, este procedimento pode gerar derivados no-luminescentes provenientes de compostos luminescentes, que podem ser teis para suprimir a luminescncia de potenciais interferentes, quando misturas complexas so analisadas. Propriedades das molculas como a absortividade molar, propriedades oxi-redutoras e as propriedades de reteno da mesma so tambm modificadas pela derivao fotoqumica. Em uma derivao fotoqumica faz-se uso da radiao UV para promover modificaes em um determinado analito, no somente por meio da degradao da molcula original, mas tambm por reaes catalisadas pela radiao UV. Dependendo de sua estrutura e dos componentes do meio reacional, um analito pode sofrer reaes de fotoxidao, fotoreduo, fotodecomposio, fotohidrlise entre outras reaes. A radiao UV pode ser vista como um reagente prontamente disponvel em vrias intensidades, apresentando um baixo custo para sua aplicao e eliminando problemas relacionados com contaminao, como potencialmente pode-se observar com a adio de reagentes qumicos. tambm

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possvel selecionar faixas estreitas da banda do espectro para melhorar a reao de seletividade para misturas complexas (Calatayud e Benito, 1991). As reaes de derivao fotoqumica tm sido usadas para induzir ou amplificar a luminescncia de diversas drogas e outras substncias de interesse clnico-biolgico tais como os antihipertensivos, os antimicrobianos, os antidepressivos, e os antiinflamatrios, entre outros. Com tal procedimento, grande sensibilidade e seletividade podem ser alcanadas nas determinaes analticas dessas substncias, utilizando um procedimento experimental relativamente simples.

2.3. Objetivos do Trabalho

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O objetivo deste trabalho desenvolver um procedimento experimental para induzir fluorescncia em molculas de dois glicocorticides sintticos (prednisolona e triancinolona acetonido) que no possuem fluorescncia natural. Por meio de um tratamento fotoqumico pretende-se obter um fotoproduto luminescente estvel que possa ser utilizado para desenvolver uma metodologia analtica espectrofluorimtrica para anlise de formulaes farmacuticas em vrias apresentaes (comprimidos, injetveis e pomadas). Para alcanar este objetivo, o trabalho foi dividido em etapas: Estudo preliminar das condies necessrias para obteno de derivados fluorescentes. Desenvolver e otimizar um procedimento analtico padronizado que promovesse, em condio tima, intensa fluorescncia dos derivados fotoqumicos dos analitos diretamente em soluo. Obter parmetros analticos de mrito e validar, mesmo que parcialmente, o mtodo analtico. Aplicar o mtodo na analise de medicamentos. Estudar a potencialidade da aplicao do procedimento de induo fotoqumica de fluorescncia com tcnicas de cromatografia lquida.