RMCT 3 Tri 2011

Revista Militar de
Vol. XXVIII - 3o Trimestre de 2011
Cincia e Tecnologia
ISSN 0102-3543
ARTIGOS
ACETILCOLINESTERASE: ALZHEIMER E GUERRA QUMICA........................................................................................................... 03

Elaine da Conceio Petronilho Angelo C. Pinto Jos Daniel Figueroa Villar
COMBUSTVEIS DE AVIAO: PERSPECTIVAS E FUTURO ........................................... 15

Flavio dos Reis Gonalves Luiz Eduardo Pizarro Borges Marco Andr Fraga
LACTATO DESIDROGENASE COMO ALVO MOLECULAR PARA QUIMIOTERAPIA ANTIMALARIAL.................................................................................................................... 24

Aline Alves Oliveira Tanos Celmar Costa Frana
UMA REVISO DE MODELAGEM MATEMTICA EM BIOPROCESSOS. PARTE I: FUNDAMENTOS BSICOS E CLASSIFICAO ............................................... 40
lvaro Jos Boareto Mendes Belkis Valdman Maurcio Bezerra de Souza Jnior
UMA REVISO DE MODELAGEM MATEMTICA EM BIOPROCESSOS. PARTE II: MODELOS MECANICISTAS E REDES NEURONAIS ARTIFICIAIS .................................................................................. 60
lvaro Jos Boareto Mendes Belkis Valdman Maurcio Bezerra de Souza Jnior
Editorial
O
materiais.
s materiais foram, so e continuaro a ser fun-
damentais para o desenvolvimento da nossa civilizao; tanto assim que vrios estgios do progresso humano recebem os nomes de Idade da Pedra, Idade do Bronze, Idade do Ferro e
assim por diante. A Cincia dos Materiais um campo interdisciplinar que envolve as propriedades dos materiais e suas aplicaes a vrias reas da cincia e da engenharia, com nfase na correlao entre a microestrutura e as propriedades macroscpicas dos diversos tipos de
Este nmero da Revista Militar de Cincia e Tecnologia apresenta, atravs de seus artigos, uma pequena amostra das pesquisas que vm sendo desenvolvidas por professores e alunos do Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Materiais do Instituto Militar de Engenharia, que completou 40 anos de existncia em 2010. Chamamos a ateno para a diversidade dos assuntos tratados, que vo desde o uso de nanopartculas para a remoo de manchas de petrleo at a fabricao de contatos transparentes para clulas solares.
Expediente
Publicao de Pesquisa e Desenvolvimento Cientfico-Tecnolgico Do Exrcito Brasileiro
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ACETILCOLINESTERASE: ALZHEIMER E GUERRA QUMICA

Elaine da Conceio Petronilhoa, Angelo C. Pintob e Jos Daniel Figueroa Villara*
a
Grupo de Qumica Medicinal, Departamento de Qumica, Instituto Militar de Engenharia, Praa General Tibrcio, 80, 22290-270, Praia Vermelha, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.. b Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-970, Cidade Universitria, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. * jdfv2009@gmail.com .
ABSTRACT The inhibition of human acetylcholinesterase (AChE) has several important applications in medical treatments, especially in Alzheimers Disease (AD), which is one of the main causes of dementia in the elderly and affects about 35.6 million people worldwide. This disorder leads to decreased activity of cholinergic neurons, a problem that can be treated by increasing the amount of the neurotransmitter acetylcholine (ACh). The best way to increase the concentration of ACh is the inhibition of AChE. AChE drugs inhibitors used for the treatment of AD are donepezil, galantamine, rivastigmine, and tacrine. Another threat to humanity are the chemical warfare agents known as nerve agents, which deserve special attention because of its high lethality and danger. Most nerve agents are organophosphorus (OP) that act mainly by inhibiting AChE which is essential for controlling the transmission of nerve impulses. When inhibited by these compounds, AChE can be reactivated by cationic oximes such as pralidoxime (2-PAM). This review will be a discussion of the structural and biological characteristics of AChE, followed by a review of Alzheimers disease and OP compounds and their application as chemical warfare agents. Keywords: Acetylcholinesterase, Alzheimers disease, organophosphorus compounds. RESUMO A inibio da acetilcolinesterase (AChE) humana tem vrias aplicaes importantes em tratamentos mdicos, especialmente na doena de Alzheimer (DA), que uma das principais causadoras de demncia em idosos e afeta cerca de 35,6 milhes de pessoas em todo o mundo. Esta doena causa a diminuio da atividade dos neurnios colinrgicos, um problema que pode ser tratado aumentando a quantidade do neurotransmissor acetilcolina (ACh). A melhor maneira de aumentar a concentrao de ACh pela inibio da AChE. Os frmacos inibidores da AChE utilizados para o tratamento da DA so donepezil, galantamina, tacrina e rivastigmina. Outra ameaa para a humanidade so os agentes de guerra qumica conhecidos como agentes de nervos, que merecem ateno especial devido a sua alta letalidade e perigo. A
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maioria dos agentes de nervos so organofosforados (OF) que atuam principalmente atravs da inibio da AChE que essencial para controlar a transmisso de impulsos nervosos. Quando inibida por estes compostos, a AChE pode ser reativada por oximas catinicas como a pralidoxima (2-PAM). Esta reviso trata das caractersticas estruturais e biolgicas da AChE, seguida por uma reviso da doena de Alzheimer e compostos organofosforados e sua aplicao como agentes de guerra qumica. Palavra chave: acetilcolinesterase, doena de Alzheimer, compostos organofosforados. INTRODUO A acetilcolinesterase A acetilcolinesterase (AChE) uma enzima pertencente a famlia das colinesterases, sendo responsvel pela finalizao da transmisso dos impulsos nervosos nas sinapses colinrgicas pela hidrlise do neurotransmissor acetilcolina (ACh). A AChE est presente no sistema nervoso central e perifrico (Rang, 2001). No perifrico ela responsvel pela modulao dos impulsos nervosos que controlam os batimentos cardacos, pela dilatao dos vasos sanguneos e pela contrao dos msculos lisos enquanto que no central ela est envolvida no controle motor, na cognio e na memria. A ACh um neurotransmissor formado na regio terminal dos neurnios, chamada de axnio terminal (Figura 1). Ela permanece armazenada em vesculas sinpticas e, quando um impulso nervoso chega no axnio terminal, liberada pelo neurnio para a regio sinptica, onde atrada pelos receptores colinrgicos que esto localizados no prximo neurnio. Quando a ACh interage com os receptores regenera o impulso nervoso no neurnio, levando assim a continuidade da transmisso. Uma vez transmitido, o impulso nervoso importante que o processo de interao da ACh com o receptor seja interrompido, para evitar o excesso de transmisso nervosa, que pode levar a problemas de funcionamento do corpo (Patrick, 2001). O nosso organismo possui a enzima AChE, que recolhe o neurotransmissor ACh e realiza uma forte modificao na sua estrutura molecular converto-a em colina (Ch), que reabsorvida pelo primeiro neurnio para ser reconvertida em ACh, permitindo assim a sua reutilizao na transmisso de impulsos nervosos (Figura 1). A modificao da ACh um processo de hidrlise, como mostrado na Figura 2.
Figura. 1. Esquema do processo de transmisso e controle nervoso nas sinapses.
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Figura. 2. Hidrlise da ACh pela AChE.
A AChE possui uma alta eficincia cataltica, com capacidade de hidrolisar at 6X10 molculas de ACh por molcula de enzima por minuto (Silman, 2005). Estaenzima possui um stio ativo onde existem trs resduos principais de aminocidos, os quais esto envolvidos diretamente no processo de hidrlise da ACh, a serina nmero 200 (Ser200), a histidina nmero 440 (His440) e o cido glutmico nmero 327 (Glu327), como mostrado na Figura 4 (Sussman, 1991). No stio ativo tambm existe uma regio aninica, que serve para interagir com a parte catinica da ACh e que orienta este substrato para a posio necessria para sofrer o processo de hidrlise (Taylor, 1999).
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Figura 3. Esquema simplificado do stio ativo da AChE de T. californicum..
Alm do stio aninico cataltico, existe um segundo stio aninico, conhecido como stio aninico perifrico (peripheral anionic site PAS). Este stio identificado com base na ligao de compostos bis-quaternrios pode estar envolvido na ao de alguns inibidores da enzima ou na inibio por excesso de substrato (Silman, 2005; Nunes-Tavares, 2002). Sendo assim, a ocupao do stio aninico perifrico (PAS) influenciaria a conformao do stio ativo, assim como a afinidade ou configurao dos compostos ligados ao centro ativo. Alm do stio cataltico e do PAS, existe o stio de ligao colina, caracterizado por possuir resduos de triptofano hidrofbicos, alm de grupos aninicos. Este stio pode ser alvo de inibidores, que impediriam a sada do produto de reao. A AChE est envolvida em dois grandes processos: a doena de Alzheimer (DA) e a intoxicao por compostos organofosforados (OF) empregados como agentes de guerra qumica.
DOENA DE ALZHEIMER A DA um dos maiores problemas de demncia que se tem conhecimento. Descoberta em 1907, pelo neuropatologista Alois Alzheimer, esta doena afeta cerca de 35,6 milhes de pessoas atualmente (http://www.folha.com.br/eq802930), na grande maioria, idosos. uma afeco neurodegenerativa progressiva e irreversvel, de aparecimento insidioso, que acarreta vrios distrbios cognitivos como perda de memria, linguagem, razo e habilidade de cuidar de si prprio (Smith, 1999). A DA pode apresentar-se de forma tardia, geralmente de incidncia ao redor dos 60 anos, e, tambm, pode se apresentar de forma precoce com a incidncia ao redor dos 40 anos, que mostra uma recorrncia familiar. Esta patologia pode ser dividida em quatro fases: inicial, moderada, grave e terminal. Na fase inicial a pessoa comea a perceber os primeiros sintomas como alteraes de memria, personalidade e habilidades espaciais e visuais. Na fase moderada, o paciente fica incapaz de aprender e reter informaes, apresenta insnia, agitao e dificuldade de falar e realizar tarefas dirias simples. Na fase grave, o paciente apresenta dificuldade motora progressiva, dificuldade para comer, incontinncia fecal e urinria. E na Fase terminal, o paciente incapaz de andar, falar e apresenta infeces intercorrentes ficando restrito ao leito. Ainda no se conhece a causa especfica desta doena, mas estudos indicam que parece haver certa pr-disposio gentica para sua ocorrncia. Alm do fator gentico, outros estudos apontam como agentes etiolgicos a toxicidade de agentes infecciosos, do alumnio, de espcies reativas de oxignio (ERO) e de aminocidos neurotxicos (Freitas, 2001). Geralmente, a DA dura cerca de 8 a 10 anos, desde os primeiros sintomas at a morte. As regies do crebro como hipocampo e crtex cerebral, que esto associadas s funes mentais como reconhecimento de estmulos sensoriais, memria e pensamento abstrato, so as mais afetadas pelas alteraes bioqumicas causadas pela DA. Uma das maiores evidncias da ocorrncia da doena a deposio do peptdeo -amilide em placas que causam destruio de neurnios por criar um processo inflamatrio crnico nas regies afetadas, alterar a regulao de clcio, essencial para a conduo dos estmulos nervosos, e aumentar a produo de radicais livres, txicos para as clulas nervosas (Demarin, 2011; Viegas Jr., 2004; Good, 1996). Na doena de Alzheimer ocorre a deficincia de neurotransmissores que so responsveis pela transmisso dos estmulos nervosos transmitidos de um neurnio a outro. O principal neurotransmissor a ACh que est envolvida diretamente nos processos motores, cognitivos e de memria. A DA gera a degradao de neurnios diminuindo a atuao da ACh, a qual degradada pela ao de enzimas. Apesar da DA no ter cura, existe um tratamento que tem sido bastante eficaz em diminuir os sintomas desta doena que o uso de frmacos inibidores da AChE (anticolinestersicos) para evitar a degradao da ACh. Em relao ligao que estabelecem com a AChE, os anticolinestersicos podem ser classificados em reversveis, irreversveis e pseudo-irreversveis. Uma das primeiras substncias testadas foi a fisostigmina (1) (Figura 4), que um inibidor reversvel da AChE. Este composto apresentou uma melhora leve da memria em pacientes com DA mas teve seu uso restrito devido a seus efeitos colaterais (Gilman, 2005).
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Figura 4 Fisostigmina, primeiro frmaco usado no tratamento da DA.
Atualmente apenas quatro inibidores da AChE so aprovados pela agncia Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para o tratamento da DA: donepezil (2) (Aricept), galantamina (3) (Reminyl), rivastigmina (4) (Exelon) e tacrina (5) (THA, Cognex), (Figura 5). A tacrina, entretanto, tem uso limitado devido a hepatotoxicidade, levando os pacientes a descontinuarem o tratamento (Viegas Jr., 2004). Pelo fato das substncias atualmente utilizadas para reduzir os sintomas causados pela DA apresentarem efeitos colaterais, mostra-se a necessidade do desenvolvimento de novos frmacos.
Figura 5 Inibidores da AChE utilizados para o tratamento da doena da DA.
ORGANOSFOSFORADOS: INIBIDORES DA ACETILCOLINESTERASE Os Compostos OF so steres ou tiis derivados do cido fosfrico, fosfnico, fosfnico ou fosforamdico, que possuem em sua estrutura um tomo central de fsforo pentavalente, com grupos arila ou alquila ligados diretamente a este, formando fosfinatos (6), ou atravs de um tomo de oxignio ou de enxofre, formando fosfatos (7), fosforotioatos (8), fosfonotioatos (9) e fosfonatos (10) (Figura 6) (Domingos, 2003; Santos, 2007).
Figura 6 Exemplos de compostos OF neurotxicos.
Os primeiros compostos OF foram sintetizados no final da dcada de 1930 por um cientista alemo chamado Gerhard Schraeder, quando este pesquisava inseticidas tendo como base uma estrutura organofosforada. Estes trabalhos deram origem a compostos mais potentes, que depois vieram a ser utilizados como armas qumicas (Domingos, 2003). Esses fosfatos orgnicos inibem a ao de vrias enzimas, principalmente a AChE (Domingos, 2003). Sendo assim, a inibio da AChE gera um acmulo de ACh, provocando um colapso do sistema nervoso central, causando perda do controle muscular, convulses e morte por parada cardiorrespiratria. Existe uma gama de agentes neurotxicos, dentre estes os mais conhecidos so: Tabun (11) (GA), Sarin (12) (GB), Soman (13) (GD), Ciclo-Sarin (14) (GF), e O-etil S-(2-(diisopropilamino)-etil)-metilfosfonotioato (15) (VX), sendo GA, GB, GD, GF e VX os cdigos atribudos pela OTAN para a identificao desses agentes qumicos (Figura 7).
Figura 7 Agentes neurotxicos de guerra mais comuns.
O processo de intoxicao por neurotxicos ocorre no sistema nervoso central e no sistema nervoso perifrico. Os OF tm grande afinidade pela enzima AChE que, uma vez inibida, no ser mais capaz de hidrolisar a ACh. A inibio ocorre no interior do stio ativo, no aminocido serina da trade cataltica, via uma interao com o OF. No caso da AChE humana (HuAChE), o OF liga-se covalentemente a Ser 203. Esta ligao ocorre entre o tomo de fsforo do organofosforado e o tomo de oxignio da serina, com subseqente sada do grupo -X do OF (Ordentlich, 2004), conforme mostrado no esquema mecanstico da Figura 8.
Figura 8 Esquema geral de inibio da AChE, onde -X o grupo de sada do agente OF.
Reativao da AChE Como discutido anteriormente, os compostos organofosforados possuem a capacidade de inibir a AChE pelo processo de fosforilao. Quando isto ocorre, o stio estersico fosforilado pode sofrer regenerao hidroltica espontnea, porm, com uma velocidade lenta ou insignificante. Em 1951, Wilson (Gilman, 2005) mostrou que compostos contendo grupos nucleoflicos, como as oximas (RCH=NOH), hidroxilaminas (NH2OH) e cidos hidroxmicos (RCONH-OH), reativavam a enzima com maior rapidez que a hidrlise espontnea. Wilson (Gilman, 2005) constatou que a AChE fosforilada poderia ter a atividade esterase restaurada por substncias que deslocassem o grupo fosforila da enzima. Esta reativao seletiva poderia ser alcanada por um composto contendo um nitrognio quaternrio e um nuclefilo, onde o nitrognio quaternrio interagisse com o stio aninico cataltico, deixando
o nuclefilo em posio oposta ao tomo de fsforo (Musilek, 2011). Wilson e Ginsburg conseguiram esse feito com a pralidoxima, conhecida com 2-PAM (16) (Figura 9). Esta substncia reativa a enzima 1 milho de vezes mais rpido do que a hidroxilamina. Oximas bis-quaternrias tambm foram testadas e mostraram ser reativadoras potentes da AChE, como por exemplo a HI-6 (17). As estruturas da 2-PAM e da HI-6 so mostradas na Figura 9.
Figura 9 Estruturas da pralidoxima e da HI-6.
Um mecanismo proposto para a reativao da acetilcolinesterase mostrado na Figura 10 e sugere que para a reativao da enzima ser eficiente esta depende da nucleofilicidade da substncia, neste caso do oximato. A oxima efetua um ataque nucleoflico sobre o tomo de fsforo, formando uma fosforiloxima (Kuka, 2006).
Figura 10 Esquema geral de reativao da AChE por oximas.
Envelhecimento da AChE Fosforilada O envelhecimento da enzima fosforilada ocorre por desalquilao do grupo fosfato e a facilidade desta reao depende da estrutura qumica do inibidor. Com a enzima envelhecida a chance de reativao por uma oxima mnima. Na enzima envelhecida, h uma interao forte entre o resduo de histidina protonado do stio cataltico e o tomo de oxignio carregado negativamente do grupo fosfato (Figura 11) (Worek, 2008).
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Figura 11 Processo de envelhecimento da AChE fosforilada.
Tratamento Os princpios de tratamento mdico para pessoas intoxicadas por OF so os mesmos aplicados para qualquer outra substncia txica como: no exposio ao agente txico, criao ou manuteno de ventilao adequada, administrao de antdotos adequados e, por fim, correo de anomalias cardacas (Marrs, 1996). A quimioterapia utilizada para o tratamento da intoxicao com compostos OF inclui o uso de trs tipos de frmacos: (1) uma substncia anticolinrgica, para antagonizar os efeitos do acmulo de ACh nos receptores colinrgicos, (2) um depressor do sistema nervoso central, que atua como um anticonvulsivante, e (3) uma oxima para reativar a AChE inibida (Marrs, 1996; Delfino, 2009). A atropina (17) (Figura 12), o anticolinrgico mais utilizado pois compete com a ACh pelos receptores muscarnicos, bloqueando os efeitos do excesso de ACh. Na classe de depressores do sistema nervoso central, o diazepam (18) (Figura 12) o mais empregado.
Figura 12 Estruturas da atropina e do diazepam.
At o momento, nenhuma oxima apresentou resultados satisfatrios para re-
ativar a AChE inibida por todos os agentes neurotxicos, sendo esta a principal deficincia atual deste tratamento. As principais oximas utilizadas so 2-PAM (15), trimedoxima (TMB-4) (19) e obidoxima (ou toxogonina) (20) (Musilek, 2011; Delfino, 2009), cujas estruturas so mostradas na Figura 13.
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Figura 13 Principais oximas empregadas na atualidade como antdotos para intoxicao por OF.
Assim, a falta de um composto com largo espectro estimulou a sntese de novas oximas. As principais delas so as oximas de Hagedorn, que mostraram uma promissora reativao da AChE inibida pelo agente neurotxico soman (13) (Petroianu, 2008). A eficincia das oximas varia de acordo com a estrutura do composto organofosforado e, geralmente, estas so utilizadas para a reativao da AChE considerando que a enzima fosforilada ainda no esteja envelhecida. Assim a efetividade do tratamento depende da administrao do antdoto imediatamente aps a exposio ao OF, quando a enzima fosforilada ainda no est envelhecida. Existem outros tipos de tratamentos para evitar e diminuir a intoxicao por OFs. Um deles utilizado quando h uma expectativa de exposio aos agentes neurotxicos. Este tratamento consiste numa proteo da AChE por uma pr-exposio a inibidores reversveis, os carbamatos, que se ligam a AChE, impedindo que a enzima se ligue ao OF de modo irreversvel. Outro tratamento, surgido no final do sculo XX, consiste na utilizao de enzimas (colinesterases, fosfotriesterases ou paraoxonases humanas) que degradam os organofosforados na corrente sangunea antes que eles interajam com a AChE, os chamados scavengers (Kuka, 2009). CONCLUSO A doena de Alzheimer um dos principais problemas de demncia e afeta milhes de pessoas em todo o mundo. As substncias atualmente utilizadas para reduzir os sintomas causados pela DA apresentam altos efeitos colaterais, evidenciando, assim, a necessidade do desenvolvimento de novos anticolinestersicos. Em relao aos compostos OF, existem vrios mtodos para o tratamento de intoxicao, mas nenhum deles eficaz contra todos os agentes neurotxicos conhecidos e contra todos os seus efeitos. Tambm, at o momento, no foi reportada nenhuma oxima que seja efetiva contra todos os OFs. Isto demonstra a necessidade do desenvolvimento de novos candidatos a frmacos, que sejam potentes e eficientes contra todos os OFs e com baixo perfil de toxicidade.
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ENVELHECIMENTO DAS FIBRAS DE ARAMIDA UTILIZADA EM COLETES BALSTICOS NVEL III

Andr Lus de Vasconcelos Cardosoa, Joo Marques Morais Mattosa, Jlio Csar Jos Rodrigues Jniora, Iaci Miranda Pereiraa*
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Centro Tecnolgico do Exrcito CTEx, Diviso Blica Laboratrio de Materiais Av. das Amricas, 28705 Guaratiba 23020-470 Rio de Janeiro RJ * iaci@ctex.eb.br
ABSTRACT Personal body armors is an apparatus designed to ballistic protection of the front and the back of the thorax, upper abdomen and the back through a vest consisting of ballistic resistant materials, usually enclosed in a nonremovable cover. Typically, the ballistic panels are produced with fibers of: aramid, polyethylene and high strength polymers. The ballistic protection is established considering the bullet characteristics: the composition, shape, mass, and caliber. In addition, during the vest design phase, the angle of incidence and impact velocity of the projectile should be oversee. Ordinarily, the type IIIA armor is suitable for routine wear, however, weather conditions, ultraviolet radiation, and sweat may reduce the panels performance. Therefore, the present study aims to verify the degradation of fibers employed in 7 years old personal body armors type IIIA by using infrared spectroscopy, scanning electronic microscopy and thermal analysis. Keywords: aramid, degradation, personal body armors and FTIR RESUMO O Colete de Proteo Balstica, nvel de proteo IIIA, um aparato destinado a fornecer proteo a rea frontal, dorsal, e lateral do combatente por meio de painis balsticos, placas balsticas e uma capa em tecido resistente destinada a acomodar os painis e as placas. Tipicamente, os painis balsticos so confeccionados com fibras de aramida, polietileno e polmeros de alta resistncia. A proteo balstica estabelecida considerando as caractersticas do projtil: a composio, a forma, a massa, e o calibre. Ademais, durante a fase de design do colete, o ngulo de incidncia e a velocidade de impacto do projtil devem ser previstos. Frequentemente, a blindagem tipo IIIA apropriada para o desgaste de rotina, no entanto, as condies climticas, a radiao ultravioleta, a umidade e o suor podem reduzir o desempenho dos painis. Assim, o presente estudo tem como objetivo verificar a degradao morfolgica das fibras empregadas em coletes tipo IIIA de 7 anos de idade utilizando espectroscopia de infravermelho, microscopia eletrnica de varredura e anlise trmica. Palavra-chave: aramida, degradao, colete de proteo balstica e FTIR
INTRODUO O colete de proteo balstica ou colete prova de balas um aparato destinado a oferecer proteo a rea frontal, dorsal, e lateral do combatente utilizando painis balsticos, placas balsticas e uma capa em tecido resistente (Norma Exrcito Brasileiro). Os materiais que constituem os painis balstico determinam o nvel de proteo do colete. Estes so planejados conforme a ameaa balstica que devem suportar considerando, entre outras coisas, a composio, a forma, o calibre, a massa, o ngulo de incidncia e a velocidade de impacto dos projteis. Para o Exrcito Brasileiro, diversas normas regulam a: avaliao tcnica, fabricao, aquisio, importao e destruio dos coletes balsticos empregados pelo combatente. Essas normas especificam os requisitos tcnicos e detalham a metodologia dos ensaios de verificao da resistncia do colete quanto a penetrao de projteis de armamentos leves. Tipicamente, as placas balsticas dos coletes utilizados so produzidas com fibras de aramida ou fibras de polietileno de ultra alto peso molecular - PEUAPM. A aramida uma fibra sinttica baseada em uma poliamida de cadeia longa com pelo menos 85% das amidas ligadas a 2 anis aromticos. A orientao das cadeias e as ligaes qumicas secundrias produz um material muito resistente e leve que encontra emprego em diversas aplicaes: pastilha de freio, tecidos para proteo em altas temperaturas, substituio de asbestos, cabos e cordas, tecidos para proteo balstica, etc. Apesar das propriedades notveis, os compostos de aramida esto sujeitos a degradao devido a ao qumica, luz ultravioleta e umidade. Assim, o envelhecimento dos coletes balsticos deve ser considerado durante o planejamento do seu ciclo de aquisio. Contudo, no existem estudos e/ou pareceres tcnicos de domnio pblico que atestem e caracterizem o final da vida do material. No presente trabalho, tem-se por objetivo verificar o estado de degradao da fibra de aramida dos Colete de Proteo Prova de Bala tipo IIIA utilizados pelo Exrcito Brasileiro.
EXPERIMENTAL Os coletes estudados foram recolhidos no 1 Depsito de Suprimentos do Comando Militar do Leste Rio de Janeiro. Estes foram separado nas suas partes diversas: capa, forro e placas balsticas. No caso dos coletes estudados, a placa balstica anterior constitua-se de uma placa rgida de PEUAPM. A placa posterior constitua-se, entretanto, de um compsito de aramida formado por prepregs da fibra. O forro que revestia as placas balsticas foi produzido por lminas flexveis de PEUAPM e lminas de polibenzoxazolos. Finalmente, o revestimento externo do colete, a capa, era formado por um tecido de poliamida sinttica. Como os materiais mais suscetvel a degradao so as fibras de aramida presente nos forros dos coletes, o estudo foi direcionando este material.
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Microscopia Eletrnica de Varredura: A superfcie das amostras foi investigada por microscopia eletrnica de varredura sem recobrimento das amostras. Os experimentos foram realizados em um equipamento Zeiss, modelo EVO-10. Ensaio Termogravimtrico: A termogravimetria foi realizada em uma termobalana modelo TGA 50H da Shimadzu em atmosfera de nitrognio com vazo de 50 mL min-1. Foram utilizados pequenos pedaos dos filmes com cerca de 7 mg. O aquecimento foi efetuado a uma razo de 5oC min-1 a partir da temperatura ambiente at 700oC. Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier As anlises por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) foram realizadas em um espectrofotmetro NICOLET, modelo 6700. Os espectros dos filmes foram obtidos utilizando pastilhas de KBr. Todos os espectros foram obtidos em atmosfera de nitrognio, a partir de 128 varreduras com uma resoluo de 4 cm-1. RESULTADOS E DISCUSSO
A Fig. 1, ilustra o aspecto visual do colete de proteo balstica estudados.
Foi observado que a integridade fsica dos coletes estudados no comprometeu-se devido a degradao da capa ou das costuras que possuam aspecto visual razovel. Entretanto, as placas balsticas e o forro, responsveis pela proteo balstica do colete, estavam em estado precrio de conservao. O exame visual evidenciou que as placas balsticas anteriores apresentaram acentuada delaminao ou descolagem. Delaminaes ou descolagens so ocorrncias indesejveis em materiais compsitos (Mallick, 1997), uma vez que atuam como elementos modificadores das propriedades originais do sistema como um todo. A microscopia eletrnica de varredura foi utilizada para avaliar superfcie do filamento da fibra de aramida dos coletes em estudo. Para efeito comparativo, um filamento de material no degradado foi utilizado como referncia. A Fig. 2a refere-se a um conjunto de
filamentos de uma amostra de referncia, com fibrilas unidas e alinhadas. A Fig. 2b ilustra um conjunto filamentos de aramida obtidos do material degradado em estudo. possvel observar, na Fig. 2b, fibras com diversas fibrilas soltas e emaranhadas, o que provavelmente consequncia do processo de envelhecimento do material.
Figura 2 Micrografias das fibras de aramida: (a) amostra de referncia, (b) feixe pertencente aos coletes estudados
Pode-se verificar nos espectros da Fig. 3 as bandas caractersticas dos compostos da fibra de aramida.
Figura 3 Anlise de FTIR do fio de aramida degradado
Entretanto, sinais de degradao so visveis no espectro. A diminuio do pico tpico dos compostos de PPTA em ~3322 cm-1, amida A (N-H ligado por interao de hidrognio quando C=O e NH are em configurao trans), sugere a presena de umidade (Chatzi, 1986; Xiaoyan, 2011; Chin, 2009). A banda larga entre 3600cm-1 e 3000 cm-1 sugere acoplamento da banda da amida com a banda da gua absorvida e fracamente ligada. Contudo, o acoplamento da banda tambm pode ser consequncia da tcnica utilizada para preparao da amostra. Para trabalhos futuros, pode ser necessrio minimizar e padronizar a utilizao de KBr. O aumento da intensidade do pico da amida I (Chatzi, 1986; Xiaoyan, 2011; Chin,
2009), 1640 cm-1, e seu deslocamento para comprimento de onda inferiores pode ser o resultado da interrupo das interaes de hidrognio entre o grupamento CO e NH promovido pela cisso das cadeias e a oxidao pela radiao UV (Chatzi, 1986; Xiaoyan, 2011; Chin, 2009). A radiao UV tambm responsvel pelo aumento da intensidade do pico de amida II, 1540 cm-1, e amida III, 1319 cm-1, devido a quebra das ligaes C-N (Chatzi, 1986; Xiaoyan, 2011; Chin, 2009). O pico presente em 1420 cm-1 evidncia a hidrlise da cadeia principal de amida para amina e cido carboxlico (Zhang, 2006). A Fig. 4 apresenta a curva termogravimtrica do material estudado. Considerando eventos trmicos de decomposio (temperatura inicial, a metade da temperatura de decomposio, e a temperatura final) observados na Fig. 3 e utilizando dados de literatura, verifica-se reduo da temperatura inicial de decomposio em mais de 50oC (Cai, 2010), sugerindo que esta amostra termicamente mais instvel que a amostra de referncia. A Tab. 1 mostra os resultados obtidos na literatura (Chin, 2009).
Figura 4: Termogramas das amostras de aramida dos coletes estudados. Tabela 1 Temperaturas caractersticas de fibras de alto desempenho (Chin, 2009) Temperatura (oC) Temperatura inicial Metade da temperatura de decomposio Temperatura final Kevlar 49 548,1 592,7 643,7 Kevlar 129 542,4 598,6 660,4 Nomex 423,7 632,24 784,2
A diminuio da estabilidade trmica observada na Figura. 4 pode ser efeito direto da degradao estrutural da fibra discutidos e apontados nas anlises de FTIR. Os processos qumicos que promovem a cisso de ligaes e a interrupo
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de interaes qumicas diminuem a estabilidade da cadeia diminuindo o valor da temperatura inicial de decomposio. CONCLUSES Conclui-se que as fibras polimricas das placas balsticas dos coletes de proteo, nvel de proteo IIIA, apresentam evidncia de degradao qumica aps 7 anos de uso. A constatao de quebra e oxidao das ligaes sugere o comprometimento das propriedades balsticas. Porque a proteo balstica oferecida pelos coletes planejada por meio das propriedades mecnicas e morfolgicas dos materiais que compe os coletes, os equipamentos com mais de 7 anos de uso so inadequados para operaes em condies reais. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
- Cai, G. M.; Yu W. D.; Study on the thermal degradation of high performance fibers by TG/FTIR and Py-GC/MS; J. Therm Anal Calorim. 2010, 2, 757. - Chin, J.; Petit, S.; Forster, A.; Riley, M.; Rice. K.; Effect of Artificial Perspiration and Cleaning Chemicals on the Mechanical and Chemical Properties of Ballistic Materials. J. Appl. Polym. 2009, 113, 567. - http://www.dabst.eb.mil.br/paginas/Legisla%C3%A7%C3%A3o_CLII-Equipamentos.html, acessada em outubro de 2010 - MALLICK, P. K., Composites Engineering Handbook, 4a ed, Marcel Dekker Hill, 1997. - Chatzi, E. G.; Ishida, H.; Koenig, J. L.; An FT-IR Study of the Water Absorbed in Kevlar-49 Fibers; Applied Spectroscopy. 1986, 40, 847. - Xiaoyan, L.; Weidong, Y.; Ning. P. Evaluation of High Performance Fabric Under Light Irradiation; J. Appl. Polym. Sci. 2011, 120, 552. - Zhang, H.; Zhang, J.; Chen, J.; Hao, X.;Wang, S.; Feng, X.; Guo, Y.; Effects of solar UV irradiation on the tensile properties and structure of PPTA fiber. Polym. Deg. Stab 2006, 91, 2761.
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LACTATO DESIDROGENASE COMO ALVO MOLECULAR PARA QUIMIOTERAPIA ANTIMALARIAL

Aline Alves Oliveiraa, Tanos Celmar Costa Franaa* Seo de Engenharia Qumica Instituto Militar de Engenharia; Praa General Tibrcio, 80, 22290-270, Rio de Janeiro/RJ, Brasil. * tanos@ime.eb.br
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ABSTRACT Malaria is a disease that affects millions of people worldwide every year. The Brazilian Army also suffers the consequences of this disease; the main responsible for causalities in the Amazon region. Although there are many drugs to treat malaria, the emergence of resistant strains of its causative agent (protozoa of the genus Plasmodium) have pointed to the need for planning new drugs against new molecular targets. Within this context, the enzyme lactate dehydrogenase has been shown to be a promising target for antimalarial chemotherapy. Keywords: malaria, Plasmodium falciparum, lactate dehydrogenase
RESUMO A malria uma doena que atinge milhes de pessoas no mundo a cada ano e o Exrcito Brasileiro tambm sofre as consequncias dessa doena que a principal responsvel pelas baixas na regio Amaznica. Embora existam muitos frmacos para o tratamento de malria, o surgimento de cepas resistentes dos seus agentes causadores (protozorios do gnero Plasmodium) tem apontado para a necessidade de planejar frmacos contra novos alvos moleculares. Dentro desse contexto, a enzima lactato desidrogenase tem se mostrado um alvo promissor para a quimioterapia antimalarial. Palavras-chave: malria, Plasmodium falciparum, lactato desidrogenase.
INTRODUO A malria uma doena presente em quase todas as regies tropicais e subtropicais do mundo, sendo considerada um grave problema de sade pblica. Em funo de polticas cada vez mais eficientes de controle de vetores, diagnstico e tratamento de pacientes, observou-se nos ltimos anos uma reduo no nmero de casos da doena. A Figura 1 traz os dados mais atuais do nmero de casos de malria disponibilizados pela Organizao Mundial da Sade (OMS) que foram
publicados no ano de 2011, fazendo referncia situao global no ano de 2010. Embora a campanha de erradicao patrocinada pela OMS, a partir de 1960, tenha sido um importante marco no combate a malria (Barata, 1995), ainda so necessrios muitos investimentos e pesquisas na rea, pois ainda foram estimados 216 milhes de casos para o ano de 2010 resultando em 655 mil mortes. O maior nmero de registros da doena ocorre no continente africano onde as mortes estimadas representam 91% do total mundial (WHO, 2011). Alm disso, na frica Subsaariana, a malria a principal responsvel pela morte de crianas menores de cinco anos (WHO, 2010b). A OMS estima ainda que em 2010 cerca de 335 mil brasileiros foram infectados pela malria. Os casos registrados so, quase exclusivamente, na regio Amaznica onde uma srie de fatores como baixa densidade demogrfica, disperso populacional e tipo de habitao favorecem a transmisso da doena e prejudicam o uso de procedimentos de controle (Barata, 1995). Para o Exrcito Brasileiro a malria causa grande preocupao em funo das atividades desenvolvidas na regio Amaznica, uma vez que a doena responsvel por um nmero considervel de baixas em hospitais e afastamentos para tratamento de sade. Por isso a malria um grande obstculo para qualquer atividade que as foras armadas pretendam desenvolver naquela regio (Frana, 2008).
Figura 1 Estimativa do nmero de casos de malria no mundo entre os anos 2000-2010, segundo dados da Organizao Mundial da Sade (WHO, 2011).
No combate malria h duas estratgias de ao: preveno e controle de casos. Para o tratamento so usados medicamentos e tambm transfuses sanguneas (Enayati e Hemingway, 2010). A preveno da doena envolve desde o controle do vetor atravs do emprego de inseticidas como o DDT, amplamente utilizado durante a Segunda Guerra Mundial, at o uso de medicamentos profilticos ou vacinas (Enayati e Hemingway, 2010; Frana, 2008). Atualmente no h nenhuma vacina autorizada para doenas parasitrias como a malria, mas existem estudos para o planejamento de vacinas que tm como alvo um s estgio do ciclo de vida do parasita ou mesmo fases iniciais desse ciclo no hospedeiro humano. A vacina mais efetiva testada atualmente a RTS,S, um hbrido de partculas de protena associado a imunoestimulantes, cujo mecanismo de proteo ainda desconhecido (Hill, 2011; Cohen, 2010; Good e Doolan, 2010).
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ASPECTOS CLNICOS DA MALRIA Os principais sintomas da malria so febre intermitente, dores no corpo, dor de cabea, anemia, ictercia e inchao do fgado e bao. O sistema nervoso central tambm pode ser comprometido quando o paciente apresenta malria cerebral (Frana, 2008). A malria causada pelo parasita do gnero Plasmodium, transmitido ao homem atravs da picada da fmea do mosquito do gnero Anopheles. H diferentes espcies de Plasmodium, entretanto so cinco as principais responsveis pela transmisso da doena ao hospedeiro humano: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, e a espcie P. knowlesi, identificada recentemente (Cox-Singh, 2008; Singh, 2004). O P. falciparum a espcie que provoca a forma fatal da doena, a malria cerebral, e responsvel pela maioria das mortes. Por isso, a malria cerebral tem sido o principal foco das pesquisas para a preveno e tratamento. J as espcies P. vivax e P. ovale podem provocar relapsos clnicos em intervalos regulares, pois o parasita pode permanecer no fgado por anos (Wiesner, 2003). CICLO DE VIDA DO PLASMODIUM O Plasmodium necessita de dois hospedeiros para completar seu ciclo de vida, um vertebrado e outro invertebrado. A infeco de um hospedeiro vertebrado, como o homem, acontece quando este picado pelo mosquito infectado. Nesse momento acontece uma injeo de esporozotos na corrente sangunea que, em seguida, so levados para rgos e tecidos do corpo. No fgado os esporozotos iniciam a reproduo assexuada produzindo dezenas de milhares de merozotos. Estes, por sua vez, so liberados das clulas hepticas, caem na circulao sangunea e invadem os eritrcitos dando origem aos esquizontes (eritrcitos infectados). Dentro de cada eritrcito tambm ocorre a reproduo assexuada produzindo mais merozotos, que so liberados quando os eritrcitos se rompem. O estado febril da malria caracteriza esse momento de ruptura sincronizada dos eritrcitos infectados. Alguns merozotos continuam a invadir novamente os eritrcitos, mas outros podem se diferenciar em gametcitos (estgios sexuais). Quando outro mosquito pica o homem e ingere os gametcitos, um ciclo sexual se inicia. No estmago do mosquito os gametcitos se transformam em gametas que se fundem para formar o zigoto. Cada zigoto se transforma em um oocisto. Divises assexuais nos oocistos produzem centenas de esporozotos, que so liberados quando o oocisto se rompe, e migram para as glndulas salivares do Anopheles, completando assim o ciclo de vida do Plasmodium (Sherman, 1979; Wiesner, 2003). QUIMIOTERAPIAS PARA O TRATAMENTO DA MALRIA Vrios estudos foram desenvolvidos ao longo dos anos na tentativa de propor frmacos cada vez mais eficientes no combate malria. Os primeiros registros indicam a utilizao de cascas da rvore Cinchona calisaya para o tratamento da febre desde o incio do sculo XVII. Somente em 1820 seu ingrediente ativo, a
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quinina (Figura 2), foi isolado e tornou-se um dos primeiros compostos qumicos puros usados para tratar uma doena. O composto azul de metileno foi utilizado em 1891 tambm para tratar a malria, sendo o primeiro frmaco sinttico usado em humanos. Modificaes estruturais nesses compostos permitiram a sntese de outras molculas quinolnicas com potencial antimalarial como a pamaquina e a mepacrina (Figura 2) nos anos de 1925 e 1932, respectivamente (Meshnick e Dobson, 2001). A cloroquina (Figura 2), sintetizada em 1934 e liberada em 1946, um dos frmacos mais utilizados no tratamento da malria em funo da sua eficcia, fcil administrao e baixa toxicidade. A partir da cloroquina, foram desenvolvidos aril amino lcoois, principalmente para a utilizao na Guerra do Vietn, como a mefloquina e a halofantrina (Figura 2). A utilizao da cloroquina como medida profiltica ao ser adicionada ao sal em regies da Amrica do Sul, frica e sia, provavelmente induziu o surgimento dos primeiros casos de resistncia ao frmaco no final de dcada de 1950. Hoje so vrios os registros de cepas de Plasmodium resistentes aos compostos quinolnicos em diversas regies do mundo (Nosten, 1991; Ter Kuile, 1992; Wellems, 2002).
Figura 2 Principais antimalariais quinolnicos e aril amino lcoois j desenvolvidos.
Acredita-se que os frmacos quinolnicos so capazes de impedir o mecanismo de polimerizao do grupo heme a partir da degradao da hemoglobina. Para obter energia necessria a sua sobrevivncia, o parasita ingere a hemoglobina do hospedeiro e a transporta para seu vacolo digestivo. A hemoglobina ento degradada em pequenos peptdeos e o grupo heme liberado. Entretanto, o grupo heme e a hematina, em equilbrio com sua forma dimrica, so txicos para o parasita e podem destruir membranas ou mesmo inibir enzimas (Dorn, 1998). Para contornar esse problema, o Plasmodium converte a hematina hemozona, um polmero no
txico. Para formar a hemozona, o on frrico central de um grupo heme se liga a um tomo de oxignio do grupo carboxilato lateral do grupo heme seguinte. Essa ligao se repete entre os grupos heme, formando assim o polmero (Slater, 1991). Como resultado, a hemozona se acumula nos eritrcitos e ao ser liberada causa a febre (Miller, 1994). O papel dos frmacos quinolnicos justamente impedir que ocorra essa detoxificao do grupo heme e, consequentemente, impedir a produo de hemozona (Chou e Fitch, 1993). Inibidores do ciclo do folato tambm foram planejados para o tratamento da malria, uma vez que inibindo as enzimas que participam desse ciclo, a produo de material gentico do parasita afetada. A pirimetamina e o proguanil so inibidores conhecidos da enzima dihidrofolato redutase (DHFR) enquanto que a sulfadoxina capaz de inibir a dihidropteroato sintase (Nzila, 2000) (Figura 3). Entretanto, h muitos registros de resistncia a essa classe de antimalariais (Costanzo e Hartl, 2011; Sibley, 2001).
Figura 3 Inibidores do ciclo do folato utilizados como antimalariais.
A artemisinina, ingrediente ativo da planta Artemisia annua, foi isolada em 1972, apresentando tambm potente atividade antimalarial ao agir no mecanismo de detoxificao do grupo heme. A partir da artemisinina, uma nova classe de compostos foi planejada para utilizao no tratamento da malria. Dentre os derivados da artemisinina destacam-se dihidroartemisinina, artesunato e artemeter (Figura 4) (Klayman, 1985). O uso desses medicamentos de forma isolada, ou mesmo em combinao com outras classes de antimalariais, tambm induz o surgimento de resistncia e consequente diminuio de sua eficcia em vrias regies do mundo (Dondorp, 2009; Rogers, 2009).
Figura 4 Artemisinina e seus derivados aplicados na quimioterapia antimalarial.
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A fim de evitar o surgimento de resistncia, algumas combinaes de frmacos substituem a monoterapia. A OMS estimula atualmente o uso de terapias combinadas baseadas na artemisinina (ACTs, do ingls artemisinin-based combination therapies) para o tratamento de casos confirmados da malria causada pelo P. falciparum. Para o tratamento da malria causada pelo P. vivax recomenda-se o tratamento com cloroquina nas regies onde no h resistncia a esse frmaco (WHO, 2010a; WHO, 2010c). Novos frmacos antimalariais foram propostos e muitos esto nas fases de testes de desenvolvimento clnico e pr-clnico. Alguns dos novos frmacos tm alvos diferentes dos j conhecidos. Essa estratgia permite superar o problema da resistncia, alm de permitir a busca por um novo antimalarial que seja mais eficaz e seletivo. A fosmidomicina, por exemplo, um inibidor da enzima 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato (DOXP), uma redutoisomerase envolvida na biossntese de isoprenides (Jomaa, 1999). Proteases como a plasmepsina II tambm so estudadas no planejamento de antimalariais (Carcache, 2002; Haque, 1999; Mckay, 2011). Outras enzimas envolvidas nas snteses de cidos graxos, de lipdeos de membrana ou mesmo aquelas envolvidas na gliclise, so tambm alvos propostos para o desenvolvimento de inibidores que possam se tornar potentes frmacos para o tratamento da malria (Waller, 1998; Surolia, 2001; Wengelnik, 2002; Razakantoanina, 2000; Cameron, 2004; Choi, 2007a; Choi, 2007b).
A LACTATO DESIDROGENASE Diversos organismos vivos, como o ser humano, utilizam a via glicoltica para a obteno de energia. Nessa via, aps vrias reaes catalisadas por enzimas, uma molcula de glicose degradada dando origem a duas molculas de piruvato. Durante esse processo, parte da energia livre oriunda da glicose conservada na forma de ATP e NADH (Lehninger, 2006). O piruvato produzido pela via glicoltica pode ter diferentes destinos. Em condies aerbicas, ele oxidado ao grupo acetila da acetil-coenzima A, que posteriormente ser totalmente oxidada a CO2 atravs do ciclo de Krebs. Em processos anaerbicos o piruvato pode ser convertido em etanol (fermentao alcolica) ou em lactato (fermentao ltica). A produo de lactato a partir de piruvato envolve a converso de NADH em NAD+ (Figura 5) e catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) (Lehninger, 2006).
Figura 5 Reao catalisada pela enzima LDH.
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Nos mamferos, a LDH pode ser expressa em diferentes isoformas. As isoformas majoritrias encontradas no Homo sapiens envolvem a forma M, encontrada principalmente em msculos esquelticos e no fgado, e a forma H, caracterstica do msculo cardaco. As isoformas M e H so codificadas por genes diferentes, A e B, respectivamente. Essas isoformas so geralmente encontradas no citosol de clulas somticas, mas podem ocorrer tambm nas mitocndrias. Uma isoforma menos frequente, a forma X encontrada no esperma, tambm foi identificada. As isoformas independentes M e H podem se combinar de formas distintas para formar tetrmeros (H4, MH3, M2H2, M3H e M4) (Granchi, 2010; Read, 2001). Um estudo da LDH humana (HssLDH) desenvolvido por Read e colaboradores (2001) mostra que as isoformas M e H, com 75% de identidade sequencial, apresentam atividades diferentes, mas as regies do stio ativo e a associao de subunidades so indistinguveis. A partir de clculos de potencial eletrosttico, as diferenas nas atividades de cada isoforma puderam ser explicadas pelas variaes dos resduos da superfcie perifrica do stio ativo. H diversas estruturas cristalogrficas de LDH depositadas no Protein Data Bank (PDB) (Berman, 2000) como a de Homo sapiens sapiens (Read, 2001), a de P. falciparum (Dunn, 1996), a de Bacillus steareothermophilus (Piontek, 1990) e de Squalus acanthius (White, 1976). Geralmente essas enzimas formam uma estrutura com dois domnios. O maior deles compreende um motivo estrutural caracterstico de protenas que se ligam a nucleotdeos, denominado Rossmann fold (resduos 20-162 e 248-266). Esse motivo estrutural compreende o stio de ligao do cofator NADH e envolve a repetio de uma sequncia de folhas e -hlices, dispostas na seguinte ordem: ---- (Bellamacina, 1996; Rao e Rossmann, 1973). O outro domnio presente na LDH envolve o stio de ligao do substrato e compreende os resduos de aminocidos 163-247 e 267-331. Os resduos de 1-20 apresentam uma conformao estendida e se dobram sobre outra unidade do tetrmero (Read, 2001). O processo de catlise da LDH envolve primeiramente a ligao do cofator seguida pelo substrato atravs de um processo ordenado. Em seguida, ocorre o fechamento do stio ativo atravs de um loop (resduos 99 a 110). Entretanto, para que o substrato se ligue, necessrio que o resduo cataltico His195 esteja em seu estado protonado (Shoemark, 2007). A protonao da His195 ocorre em funo do resduo Asp168, formando a dade cataltica. Este interage com a His195 estabelecendo uma forma protonada do anel imidazol por meio de uma ligao hidrognio entre o grupo carboxila do Asp168 e o anel imidazol da His195. A catlise enzimtica envolve uma reao de transferncia de hidreto na qual o estado de transio estabilizado pela Arg109. Outro resduo cataltico, a Arg171, responsvel por fixar o substrato atravs de duas fortes interaes entre sua cadeia lateral e o grupo carboxilato do piruvato. A Ile250 tambm importante, pois sua cadeia lateral cria um ambiente apropriado para acomodar o anel nicotinamida do NADH (Granchi, 2010). Alm disso, contatos entre o substrato e os resduos 101-103 do loop so determinantes na especificidade da enzima (Shoemark, 2007; Dunn, 1991; Dafforn, 1997). Alm de ser um alvo para a quimioterapia do cncer, a LDH tem se mostrado ainda um interessante alvo para o tratamento da malria (Dunn, 1996; Granchi, 2010). Durante o seu ciclo assexuado, no interior do eritrcito, o Plasmodium depende da gliclise anaerbica para a sntese de ATP e consequente gerao de
energia (Vander Jagt, 1990). Logo, a interrupo da atividade da LDH impede uma das principais vias pelas quais o parasita produz energia, levando-o a morte. Alm da LDH, qualquer enzima da via glicoltica representa um potencial alvo para o desenvolvimento de frmacos (Brown, 2004). As enzimas LDH dos diferentes parasitas que causam a malria, P. vivax, P. ovale e P. malariae, apresentam de 90 a 92% de identidade com a LDH de P. falciparum (PfLDH), sendo que os resduos catalticos so idnticos. Estudos por modelagem molecular mostram que inibidores do stio do cofator apresentam orientaes similares nas LDH de todas as quatro espcies. Entretanto, h notvel variao nas propriedades cinticas, como valores da constante de Michaelis para o piruvato, lactato, NADH e NAD+, bem como diferentes constantes de dissociao dos inibidores (Brown, 2004). Importantes diferenas entre a PfLDH e a HssLDH contribuem para que a PfLDH seja vista como um potencial alvo para o tratamento da malria (Dunn, 1996). Alm disso, a PfLDH apresenta ainda caractersticas capazes de diferenci-la das LDHs de outros organismos. Uma dessas diferenas est relacionada inibio da enzima por excesso de substrato. Em quase todas as LDHs o excesso de substrato (piruvato) ou o complexo piruvato-NAD+ inibem a atividade enzimtica. Porm, essa inibio no observada para a PfLDH, provavelmente em funo do deslocamento de 1,2 na posio do cofator em relao as LDHs de diferentes mamferos (Dunn, 1996; Vander Jagt, 1981; Read, 1999). Essa caracterstica da PfLDH funo de uma adaptao do parasita para sobreviver nas condies anaerbicas predominantes nos eritrcitos (Read, 1999). Estudos mostram tambm outra caracterstica interessante da PfLDH segundo a qual a enzima muito mais ativa com o 3-acetilpiridina adenina dinucleotdeo (APADH), substncia anloga ao cofator NADH, onde a carboxiamida da nicotinamida substituda por um grupo metila (Figura 6) (Brown, 2004; Berwal, 2008). Esse fato permite que a enzima seja utilizada em testes de parasitemia (Brown, 2004; Makler e Hinrichs, 1993; Makler, 1993).
Figura 6 Representao estrutural do NADH e do APADH.
A PfLDH apresenta ainda outras caractersticas que a tornam um interessante alvo no planejamento de novos frmacos seletivos. H cinco resduos (DKEWN) a mais no loop do stio ativo da PfLDH em relao a HssLDH, ampliando a cavidade
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da regio cataltica (Brown, 2004). Os resduos adicionais do loop do stio ativo da PfLDH so responsveis por conferir uma maior especificidade do substrato em comparao com as isoformas da HssLDH (Shoemark, 2007). Um loop maior na PfLDH traz como consequncia o deslocamento do anel da nicotinamida do cofator acarretando no aumento do volume do stio ativo da PfLDH (Dunn, 1996; Read, 1999). Alm disso, o resduo Ser161 presente no stio ativo, encontrado em todas as outras estruturas de LDH, substitudo pela Leu163 na PfLDH. A Ser161 responsvel por interagir com a poro carboxiamida do anel da nicotinamida do NADH atravs de uma molcula de gua. Na PfLDH essa ligao no ocorre pois h substituio pela Leu163, provocando reduo da inibio por excesso de substrato na enzima plasmodial (Dunn, 1996; Sessions, 1997). Os resduos Thr248 e Ile252 tambm tem correspondentes diferentes na PfLDH, eles so substitudos por resduos de prolina. Entretanto, os resduos Arg109, Asp168, Arg171 e His195 da PfLDH, fundamentais para a catlise enzimtica, so mantidos em todas as outras LDH (Dunn, 1996; Brown, 2004). INIBIO DA PFLDH H trs formas diferentes de inibir a PfLDH dependendo da regio onde o inibidor se liga: no stio de ligao do piruvato, na regio do stio de ligao entre piruvato e cofator ou no stio de ligao da adenina do NADH (Conners, 2005). Portanto, existem classes distintas de inibidores de PfLDH. O gossipol e seus derivados, por exemplo, se ligam na regio entre a nicotinamida do cofator e o piruvato enquanto que os cidos oxmicos se ligam no stio do piruvato (Choi, 2007a; Choi, 2007b; Conners, 2005; Sessions, 1997). O gossipol, um aldedo polifenlico, um produto natural extrado de sementes de algodo e capaz de inibir de forma no seletiva a LDH por competio com o cofator (Brown, 2004; Yu, 2001). O gossipol tem duas formas opticamente ativas geradas pelo atropoisomerismo. Esse tipo de estereoisomerismo caracterstico de sistemas onde h uma ligao simples cuja rotao impedida em funo de uma barreira energtica suficientemente elevada. O atropoisomerismo do gossipol acontece em funo da restrio rotacional em torno da ligao entre os dois carbonos do sistema binaftila, dando origem a duas formas opticamente ativas: (aS)-(+) e (aR)-(-) (Figura 7) (Santos, 2007). Shelley e colaboradores (1999) demonstraram que o enantimero aR apresenta maior atividade antitumoral em comparao ao enantimero aS e mistura racmica.
Figura 7 Representao estrutural dos atropoismeros do gossipol. esquerda, o enantimero aS e direita o enantimero aR.
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O gossipol apresenta atividade biolgica para diferentes fins como contraceptivo (Wu, 1989), anti-viral (Radloff, 1986; Royer, 1991) e antimalarial (Heidrich, 1983; Vander Jagt, 1984). Porm, apresenta alta toxicidade, provavelmente em funo dos grupos aldedos presentes em sua estrutura. Diversos derivados do gossipol so sintetizados na busca por compostos com menor toxicidade e maior atividade biolgica que possam ser utilizados como antimalariais (Deck, 1998; Razakantoanina, 2000; Vander Jagt, 1984; Yu, 2001). Outra classe de inibidores de PfLDH, capazes de competir pela regio de ligao do substrato enzimtico, foi desenvolvida com base em compostos azis. Alguns compostos dessa classe, alm de propriedades inibitrias para a PfLDH, apresentam tambm seletividade para essa enzima. Quatro compostos utilizados para o desenvolvimento de outros inibidores, possuem uma poro farmacofrica comum, tendo um grupo hidroxila na posio 3 do anel azol e um grupo carboxila na posio 4 (Figura 8). As estruturas primrias dos compostos baseados em azis incluem 1,2/1,5-isoxazis (X = N, Z = CH e Y = O e X = CH, Z = N e Y = O), 1,2,5-oxadiazis (Y = Z = N e Y = O), 1,2,5-tiodiazis (Y = Z = N e Y = S) e triazis (X = Y = Z = N) (Cameron , 2004).
Figura 8 Representao estrutural geral de compostos baseados em azis.
O cido oxmico (Figura 9) e seus derivados constituem outra classe de potenciais antimalariais. O cido oxmico um anlogo do piruvato e compete pelo stio de ligao deste. Por apresentar atividade antimalarial, alm da seletividade em comparao HssLDH, vrios derivados N-substitudos foram sintetizados (Choi, 2007a; Choi, 2007b; Yu, 2001).
Figura 9 Representao estrutural do cido oxmico.
Choi e colaboradores (2007b) propuseram uma nova classe de derivados do cido oxmico que possuem em sua estrutura o grupo cromeno. Essa estrutura permite que os compostos assumam conformaes similares ao NADH no stio ativo da LDH, competindo tambm pela regio de ligao do substrato. Alm de apresentar facilidade sinttica, o grupo cromeno capaz de interagir com a regio da enzima na qual o grupo difosfato do NADH interage. Os inibidores desenvolvidos apresentaram atividade antimalarial, alm de seletividade em relao HssLDH. Apresentaram tambm atividade para a malato desidrogenase do P. falciparum (PfMDH) (EC 1.1.1.37), uma enzima capaz de catalisar a mesma reao da PfLDH quando esta
tem sua atividade reduzida. Em funo de todas essas caractersticas, os derivados do cido oxmico que contm o grupo cromeno tm se mostrado muito promissores para o planejamento de novos antimalariais. ESTUDOS DA LDH POR MODELAGEM MOLECULAR Para compreender como os derivados do cido oxmico interagem com a PfLDH, Choi e colaboradores (2007b) fizeram estudos por acoramento molecular. As tcnicas de modelagem molecular so muito importantes no estudo de inibidores enzimticos, como os derivados do cido oxmico. A partir dos estudos tericos, vrias informaes relevantes obtidas ajudam no planejamento de novos compostos. Estudos por ancoramento molecular na PfLDH sugerem outros compostos, desta vez anlogos ao NADH, que tambm so promissores antimalariais (Penna-Coutinho, 2011). Cortopassi e colaboradores (2011) propuseram ainda um novo mecanismo de inibio da PfLDH no qual o stio ativo da enzima bloqueado pelo complexo formado entre frmacos quinolnicos e o grupo heme. Nesse trabalho foram realizados estudos por ancoramento e dinmica molecular (DM). As tcnicas de modelagem molecular aplicadas a LDH permitem compreender melhor a estrutura e o comportamento dinmico dessa enzima, contribuindo para a busca por novos antimalariais.
CONSIDERAES FINAIS A malria uma doena que causa grande preocupao mundial. Para o Exrcito Brasileiro, tambm no diferente, pois a doena responsvel por um nmero considervel de baixas na regio Amaznica. Por isso de extrema importncia realizar estudos direcionados para o planejamento de novos antimalariais. Alm de infectar milhes de pessoas, a malria merece ateno no que diz respeito aos frmacos j comercializados. Muitos deles tiveram seu potencial reduzido em funo do surgimento de cepas de Plasmodium resistentes. Por isso, a busca por novos alvos moleculares para o tratamento da malria uma alternativa interessante no planejamento de frmacos. A enzima PfLDH tem se mostrado um alvo promissor, uma vez que sua inibio leva o parasita a morte. Alm disso, as vrias diferenas entre essa enzima e sua correspondente humana permitem a proposio de inibidores eficazes e seletivos que podem vir a se tornar potentes antimalariais.
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UMA REVISO DE MODELAGEM MATEMTICA EM BIOPROCESSOS. PARTE I: FUNDAMENTOS BSICOS E CLASSIFICAO

lvaro Jos Boareto Mendesa,b*, Belkis Valdmana, Maurcio Bezerra de Souza Jnior a Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia Av. Athos da Silveira Ramos, 149 Bloco E Sala E-209, 21941-909, Ilha do Fundo, Rio de Janeiro/ RJ, Brasil. b Seo de Engenharia Qumica SE5 Instituto Militar de Engenharia; Praa General Tibrcio, 80, 22290-270, Rio de Janeiro/RJ, Brasil. *boaretomendes@yahoo.com.br
a
ABSTRACT Biochemical fermentation systems are highly sensitive to changes in abnormal operating conditions. Get the maximum product yield implies maintaining operating conditions within the fermenter close to pre-specified trajectory. Moreover, the complexity, efficiency and reliability of modern industrial systems increase continuously, imposing the need for continued development of tools for monitoring and process control. Thus, the mathematical models becomes important in the optimization, monitoring and control of biotechnological processes. The aim of this paper is to present a review on mathematical modeling of bioprocesses. Due to the length of the subject, we chose to split the article into three parts. In the first part it is treated environmental, economic and general aspects, broad foundation and classification of mathematical models. The second part describes mecanicist models and artificial neural network. The third part describes cibernetic and hybrid models. In particular, greater emphasis is given to the fermentation processes for production of bioethanol, because it involves technology of great strategic interest national and global, since it aims to obtain energy from renewable sources and environmentally less harmful. This review is not intended to exhaust the complex and intricate area of knowledge related to the mathematical modeling, even though only on the field of bioprocesses. Keywords: Bioprocess Modeling, Bioethanol Production, Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis RESUMO Sistemas fermentativos so altamente sensveis a mudanas sob condies anormais de operao. Obter um produto com o mximo de rendimento implica, portanto, em manter as condies de operao dentro do fermentador bem prximas de uma trajetria pr-estabelecida. Alm disso, a complexidade, eficincia e confiabilidade dos sistemas industriais modernos aumenta continuamente, im40 3o Trimestre de 2011
pondo a necessidade do desenvolvimento contnuo de ferramentas de monitoramento e controle de processos. Sendo assim, os modelos matemticos se tornam importantes na otimizao, no monitoramento e no controle de bioprocessos. O objetivo desse trabalho apresentar uma reviso sobre a modelagem matemtica de bioprocessos. Dado o amplo espectro do assunto, optou-se por dividir o artigo em trs partes. Na primeira parte so abordados aspectos ambientais, econmicos e gerais, alm de tratar de fundamentos bsicos e classificao de modelos matemticos. A segunda parte atm-se descrio de alguns dos modelos matemticos existentes, especificamente modelo fermenolgico e redes neuronais artificiais e a terceira parte descreve os modelos ciberntico e hbridos. Particularmente, maior nfase foi dada aos processos fermentativos associados produo de bioetanol, por se tratar de assunto de grande interesse estratgico nacional em termos de obteno de energia a partir de fontes renovveis e ambientalmente menos impactante. No obstante, tal interesse no se limita ao Brasil, atraindo significativa ateno mundial, independente do grau de desenvolvimento econmico da nao. importante ressaltar que a presente reviso no tem a pretenso de abranger e/ ou esgotar a totalidade da complexa e intrincada rea do conhecimento atinente ao assunto modelagem matemtica, mesmo que somente focado no campo de bioprocessos. Palavras-chave: Bioprocess Modeling, Bioethanol Production, Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis
INTRODUO Aspectos econmicos e ambientais O desenvolvimento de processos para a obteno de energia a partir de fontes sustentveis recorrente. Fatores como a eminncia da extino dos combustveis fsseis e gerao de poluentes fazem com que esta preocupao gere um grande nmero de trabalhos, os quais ocupam extenso espao na literatura cientfica. Desta forma, a produo de etanol como uma alternativa s fontes de energia oriundas de combustveis fsseis tem sido um assunto de grande interesse desde a crise petrolfera dos anos 1970. Portanto, existe uma forte necessidade de produo de etanol com eficincia, com baixo custo das matrias-primas e tambm baixo consumo de energia (Tao, 2005). O Brasil , mundialmente, o pas com a maior tecnologia de processo fermentativo para produo de lcool e possui mercado garantido, devido ao lcool anidro adicionado gasolina - obrigatrio por lei nacional em substituio ao chumbo - ou hidratado para uso como combustvel. O desenvolvimento do motor multicombustvel para automveis, iniciado em 1994, aumenta ainda mais o mercado nacional. Alm disso, a indstria sucroalcooleira autossustentvel em uso de energia alm de sua produo ser ecologicamente adequada, por reduzir os gases geradores do efeito estufa provenientes da queima de combustveis fsseis no pas numa taxa prxima de 20% (Porto, 2005). A Unio da Indstria de Cana-de-acar (UNICA) e o Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento elaboraram a estatstica de licenciamento de automveis e comerciais leves por tipo de combustvel a partir dos dados da Associao Nacional dos Fabricantes de Veculos Automotores (ANFAVEA). Essa comparao da quantidade de veculos comercializados no pas e os diferentes combustveis no perodo de 20 anos (1979 a 2009) apresentada na Tabela 1.
Tabela 1 - Estatstica de licenciamento de automveis e comerciais leves por tipo de combustvel. MESES 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
AUTOMVEIS E COMERCIAIS LEVES
GASOLINA 905.706 626.467 344.467 365.434 78.618 33.482 28.655 61.916 31.190 77.312 260.821 542.855 546.258 498.927 764.598 1.127.485 1.557.674 1.621.968 1.801.688 1.388.734 1.122.229 1.310.479 1.412.420 1.283.963 1.152.463 1.077.945 697.004 316.561 245.660 217.021 221.709
LCOOL 3.114 240.643 136.242 232.575 579.328 565.536 645.551 697.049 458.683 566.482 399.529 81.996 150.982 195.503 264.235 141.834 40.706 7.647 1.120 1.224 10.947 10.292 18.335 55.961 36.380 50.949 32.357 1.863 107 84 70
BICOMBUSTVEL
TOTAL 908.820 867.110 480.709 598.009 657.946 599.018 674.206 758.965 489.873 643.794 660.350 624.851 697.240 694.430 1.028.833 1.269.319 1.598.380 1.629.615 1.802.808 1.389.958 1.133.176 1.320.771 1.430.755 1.339.924 1.237.021 1.457.273 1.541.465 1.748.758 2.248.857 2.546.352 2.874.077
48.178 328.379 812.104 1.430.334 2.003.090 2.329.247 2.652.298
Obs: 1) Os dados at 2004 referem-se a vendas internas no atacado. Os dados a partir de 2004 fazem referncia ao nmero de veculos licenciados; 2) Inclui somente os veculos do Ciclo Otto (no esto contabilizados os comerciais leves movidos a diesel). 3) Fonte: ANFAVEA; UNICA e MAPA. http://www.unica.com.br/dadosCotacao/estatistica, acessado em 11 Ago 2011.
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Neste contexto, a indstria de bioetanol tem se desenvolvido rapidamente nos ltimos anos para lidar, novamente, com o esgotamento dos combustveis fsseis (Fu, 2009). Essa afirmao pode ser corroborada pela estatstica apresentada pela UNICA e pelo MAPA para o volume de litros de etanol total (anidro + hidratado) produzido no Brasil por safra, englobando as ltimas 19 safras. A Figura 1 apresenta a mencionada estatstica. A UNICA ressalta que os dados da safra 2008/2009 para a Regio Norte-Nordeste referem-se posio final em 30/08/09.
Figura 1 Estatstica da produo de etanol total (anidro + hidratado) no Brasil em mil litros nas ltimas 19 safras. Fonte: UNICA e MAPA. http://www.unica.com.br/dadosCotacao/estatistica, acessado em 11 Ago 2011.
Aspectos gerais do processo fermentativo Nos processos fermentativos de bioetanol, Saccharomyces o gnero de levedura largamente utilizada, seja para uso carburante ou para obteno de bebidas alcolicas. Os fatores que consagram esse microrganismo como o mais indicado para esse fim esto relacionados aos atributos desejados para a conduo de um processo de produo de lcool por esse gnero de fungo (Andrietta, 2006; Glazer, 2007). No entanto, embora as leveduras tenham muitos atributos como produtoras ideais de etanol, apresentam limitaes significativas, estando as principais relacionadas a um restrito grupo de substrato para uso e a uma limitada tolerncia concentrao de lcool presente no meio de fermentao. Assim, a limitao em fermentar uma diversidade de substratos baratos e disponveis o principal obstculo enfrentado nas tentativas de reduzir o custo da produo de lcool em processos que empregam Saccharomyces (Glazer, 2007). Nesse esforo de otimizao e melhoria da produo de etanol, o gnero bacteriano Zymomonas surge com uma especial habilidade, sendo uma alternativa atraente atual demanda mundial por combustvel. Quando comparada com a levedura Saccharomyces cerevisiae, as Zymomonas revelam alto grau de produtividade especfica, elevada tolerncia ao etanol e menor produo de biomassa (Santos, 2009). No obstante, nos ltimos 15 anos Zymomonas mobilis tem se mostrado como um microorganismo promissor para produo indus-
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trial de etanol, devido tambm as suas caractersticas cinticas e de produtividade superiores quando comparadas com estas mesmas caractersticas em leveduras (Daugulis, 1997; Ernandes, 2009). O etanol produzido recuperado em 90% a 95% do rendimento terico para Saccharomyces cerevisiae e em 97% para Zymomonas mobilis. O rendimento terico de 51,1% por peso, conforme equao estabelecida por Gay-Lussac em 1810 para converso fermentativa de glicose em etanol por levedura (Eq 1) (Sprenger, 1996; Glazer, 2007; Ernandes, 2009): (Eq. 1) Apesar de sua promissora adequao ao processo, uma desvantagem associada fermentao contnua empregando Zymomonas mobilis a ocorrncia de oscilaes peculiares na concentrao de substrato, na concentrao celular e na concentrao de produto sob certas condies de processo (Lee, 1980; Jbses, 1986; Ghommidh, 1989; Bruce, 1991; Jarzebsk, 1992; Daugulis, 1997). Jones (1999) tambm identificou esse perfil oscilatrio nas variveis de processo de fermentao alcolica quando se emprega Saccharomyces cerevisiae. Daugulis (1997) constatou que o comportamento oscilatrio significava a existncia de perodos de tempo durante os quais ocorria decrscimo na produtividade de etanol e, por conseguinte, um alto nvel de resduo de substrato. Isto implicava em uma alta perda de substrato, o que circunstncia inaceitvel para as condies de processo. Em 2008, Patnaik tambm reportou que muitos sistemas microbianos exibem comportamento oscilatrio em condies realistas, no entanto, essas culturas com oscilaes recebem menor ateno face aos sistemas monotnicos. Neste contexto cita o perfil oscilatrio de bactrias e leveduras em culturas operadas em modo contnuo. Alm disso, sistemas de fermentao bioqumicos so altamente sensveis s mudanas anormais em condies operacionais. Para assegurar que o mximo rendimento possvel de produto seja obtido necessrio garantir que as condies dentro do fermentador permaneam essencialmente programadas ao redor de uma trajetria pr-especificada. Em muitos sistemas de fermentao industrial, operadores de processo usam sua experincia e conhecimento do processo fermentativo para detectar potenciais problemas e fazer modificaes quando necessrio. No entanto, a importncia do controle eficaz no pode ser subestimada porque o desempenho de uma fermentao muito dependente da capacidade de manter o sistema operando suavemente. Uma fermentao livre de maiores transtornos seguramente mais produtiva que uma sujeita a perturbaes significativas. Ento, quanto mais cedo um potencial problema para o sistema puder ser detectado, menos severa ser sua influncia no processo e a ao corretiva resultante ser mais comedida (Lennox, 2000; Montague, 2000; Venkatasubramanian, 2003). Assim sendo, o contnuo aumento da complexidade, eficincia e confiabilidade dos modernos sistemas industriais necessita de um constante desenvolvimento no monitoramento e controle do processo. Por conseguinte, na viso de Freire (1999), modelos matemticos so importantes ferramentas para a otimizao e controle de processos biotecnolgicos.
Nesse vis, pode-se afirmar ser irrefutvel que o desenvolvimento e estudo de modelos matemticos apropriados que possibilitem maior compreenso e melhorias do processo por simulao, otimizao e implementao de malhas de controle em bioprocessos altamente desejvel. Adicionalmente, tais modelos podem ser usados em esquemas de monitoramento e diagnsticos de processos, podendo ser executados enquanto os processos so conduzidos, permitindo a deteco precoce de comportamentos anormais. O objetivo deste trabalho apresentar uma reviso bibliogrfica acerca de modelagem matemtica em bioprocessos, inserindo-a no contexto econmico e ambiental e tratando dos fundamentos bsicos, da classificao e da descrio de alguns modelos disponveis na literatura. Dada ao amplo espectro do assunto, optou-se por dividir o artigo em trs partes. Na primeira parte so abordados aspectos ambientais, econmicos e gerais, alm de tratar de fundamentos bsicos e classificao de modelos matemticos. A segunda parte atm-se descrio de alguns dos modelos matemticos existentes, especificamente modelo fenomenolgico e redes neuronais artificiais e a terceira parte descreve os modelos ciberntico e hbrido. Particularmente, maior nfase foi dada aos processos fermentativos associados produo de bioetanol, por se tratar de assunto de grande interesse estratgico nacional em termos de obteno de energia a partir de fontes renovveis e ambientalmente menos impactante. No obstante, tal interesse no se limita ao Brasil, atraindo significativa ateno mundial, independente do grau de desenvolvimento econmico da nao. importante ressaltar que a presente reviso no tem a pretenso de abranger e/ou esgotar a totalidade da complexa e intrincada rea do conhecimento atinente ao assunto modelagem matemtica, mesmo que somente focado no campo de bioprocessos. FUNDAMENTOS BSICOS DE MODELAGEM MATEMTICA Na etapa de modelagem matemtica de processos, independente da rea de concentrao (qumica, biologia, fsico-qumica, bioqumica, engenharia, psicologia ou economia) busca-se a proposio de um conjunto de relaes entre as variveis capaz de representar de forma adequada, dentro da preciso requerida, cada caso em particular. Este conjunto de relaes chamado de modelo e, no caso especfico da modelagem matemtica, constitudo por equaes algbrico-diferenciais. Schwaab (2007) descreveu o modelo como sendo uma estrutura que tenta descrever de forma aproximada a realidade. Esta descrio aproximada funo da necessidade do modelo basear-se em um conjunto de observaes experimentais, as quais so corrompidas por erros de medidas. Os erros de medidas tambm so designados como incertezas experimentais. Logo, na oportunidade da concepo do modelo, nem todas as variveis podem ser controladas e/ou medidas precisamente durante os experimentos. Um modelo matemtico um conjunto de relaes entre as variveis em um sistema em estudo e geralmente pode predizer as variveis de sada e o estado do sistema a partir das variveis de entrada. Estas relaes so normalmente expressas na forma de equaes matemticas, mas tambm podem ser especificadas
como expresses lgicas (ou relaes de causa/efeito), as quais so usadas na operao de um processo. Assim, as equaes de balano especificam como os materiais fluem dentro e fora do volume de controle e como so convertidos no interior deste volume. Essa converso interna no volume de controle representada pela equao de taxa (tambm chamada de cintica) e, juntamente com o balano de massa, especificam o modelo completo (Nielsen, 2003). Segundo Gordillo (1996), a elaborao do modelo, juntamente com sua aplicao na simulao, rene uma srie de vantagens na hora de conhecer e melhorar o processo, tais como: (a) entender o comportamento do sistema, j que abrange as evolues que seguem as diferentes variveis, de modo a formular um modelo; (b) a explorao do modelo mediante simulao ajuda a planejar o experimento, j que em pouco tempo se pode obter uma viso de quais variveis afetam o processo e, portanto, estabelecer o tempo de durao para atingir os objetivos propostos; (c) nesse sentido, a predio da evoluo do processo permite detectar em que momento a operao vai mudar sua trajetria, de modo que se possa tomar decises a tempo de corrigir e dirigir o processo para a produo tima. O modelo, portanto, permite projetar estratgias de operao e controle; (d) finalmente, uma aplicao menos direta, contudo tambm til, a sua utilizao didtica, j que permite traar diferentes situaes do processo e, portanto, facilitar sua compreenso e estudo, o que de forma experimental seria muito mais difcil e demorado de se levar a termo. Alm disso, pode se acrescentar s consideraes de Gordillo (1996) que a forma experimental para fins didticos seria tambm mais dispendiosa quando comparada aplicao de modelos. Neste contexto, encontram-se na literatura diversos conceitos e classificaes desta ferramenta imprescindvel para o estudo desses processos. A combinao do balano de massa, incluindo as equaes cinticas de taxa e o modelo do reator, perfazem uma descrio matemtica completa do processo fermentativo e esse modelo pode ser usado para simular como as variveis de sada dependem do conjunto de variveis de entrada. No entanto, projetar um modelo matemtico envolve diversas etapas, dentre as quais a primeira e mais importante a definio da complexidade do modelo. Para essa tarefa deve se definir o nmero de reaes a serem consideradas no modelo e a estequiometria para essas reaes (Nielsen, 2003). A Figura 2 ilustra as etapas envolvidas na elaborao do modelo matemtico.
Figura 2 Etapas para modelagem matemtica de processos fermentativos. Adaptado de Nielsen (2003).
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A Figura 2 mostra que se as simulaes empregando o modelo so consideradas estatisticamente representativas dos dados experimentais o modelo aceitvel. Caso contrrio, se o ajuste no significativo dentro do nvel de significncia estatstica selecionado, mesmo para o conjunto de parmetros estimado que propicia o melhor ajuste, torna-se necessrio revisar o modelo cintico e passar atravs do ciclo de modelagem novamente (Nielsen, 2003). oportuno destacar que o balano de energia tambm deve ser considerado na etapa de modelagem, muito embora no sejam tratados recorrentemente no estudo de processos fermentativos. Como exemplo, Nascimento (1983) verificou que o calor em fermentao alcolica removido pelo emprego de espargimento de gua na superfcie da dorna, utilizao de serpentinas internas com circulao de gua ou jaquetas externas e etc. Contudo a autora relata no ter encontrado poca nenhum trabalho que abordasse as equaes envolvidas nas taxas de calor liberado durante a fermentao e o calor trocado com os meios externos de aquecimento e resfriamento. Para este mesmo tipo de processo Rivera (2006) comentou que mudanas nas condies operacionais so muito comuns devido a oscilaes nas caractersticas da matria-prima, variao do microrganismo dominante e de pequenos desvios de temperatura em funo da caracterstica exotrmica da fermentao alcolica. Estas flutuaes afetam a cintica e, por conseguinte, provocam perda de produtividade e de converso, podendo deslocar o processo das condies timas de operao. Todavia, apesar de constatada a influncia da temperatura nas condies reacionais, Rivera (2006) verificou a existncia de poucos trabalhos na literatura cientfica abordando o efeito dessa varivel nos parmetros cinticos e, dentre estes estudos, no h a determinao da relao para descrever estes parmetros em funo da temperatura. CLASSIFICAO DE MODELOS MATEMTICOS Segundo Schwaab (2007), o modelo pode ser apresentado de vrias formas, a depender do propsito do pesquisador, das limitaes das observaes experimentais e da complexidade do fenmeno a ser investigado. Algumas dessas formas so: (a) Modelo Matemtico - prope que as relaes entre as diversas variveis de um problema podem ser descritas de forma matemtica precisa. Permitem fazer previses quantitativas sobre o comportamento futuro do sistema em estudo; (b) Modelo Conceitual - estabelece vnculos qualitativos entre as vrias variveis do problema, sem necessariamente estabelecer vnculos matemticos quantitativos precisos, dada a complexidade e/ou impossibilidade de mensurao das variveis envolvidas no processo. Como exemplo podem ser citados: (b1) Cincias humanas: Complexo de dipo; (b2) Engenharia: Princpio de Lavoisier conservao da massa; Primeira Lei da Termodinmica conservao da energia; e Leis Fundamentais de Newton para o Movimento conservao da quantidade de movimento; (c) Modelo Fsico: A Planta Piloto constitui-se em modelos fsicos reais, quase sempre em escala muito inferior escala dos sistemas estudados, utilizadas para fazer experimentao e estudos que podem ser vinculados ao comportamento dos sistemas reais de interesse. empregada quando inconveniente ou impossvel
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realizar experimentos diretamente no sistema estudado, tendo em vista a possibilidade de testes experimentais mal-sucedidos resultarem em acidentes ou em desvios de metas de produo, como ocorre, por exemplo, em ambientes fabris e em ambientes naturais onde possam comprometer a sade do ecossistema e resultar em catstrofes ambientais. Dentre as formas descritas no pargrafo anterior, muitas vezes conveniente a classificao dos modelos em grupos distintos conforme os conjuntos de ferramentas e tcnicas matemticas disponveis para anlise. Nesta acepo de classificao, a Figura 3 apresenta a proposta de esquema dos grupos recorrentes na literatura.
Figura 3 Proposta de classificao dos modelos em grupos distintos conforme os conjuntos de ferramentas e tcnicas matemticas disponveis na literatura.
Em consonncia com a classificao proposta na Figura 3, a seguir so apresentadas as diversas abordagens encontradas na literatura cientfica. Para Himmelblau (1970), modelos so empregados em todos os campos, considerando ser provavelmente impossvel incluir sob uma nica definio as diversas conotaes dos modelos existentes no mundo. No entanto, para o trabalho de descrio de processos, este autor se ateve aos modelos determinsticos, tambm chamados de modelos de elementos, e aos modelos estocsticos ou randmicos. Nos modelos determinsticos cada varivel e parmetro podem ser atribudos a um nmero fixo definido ou a uma srie de nmeros fixos, para qualquer conjunto de condies dadas. J nos modelos estoctiscos a incerteza introduzida. Assim, neste ltimo modelo, as variveis ou parmetros usados para descrever as rela-
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es de entradas-sada do processo e a estrutura dos elementos no so precisamente conhecidos. Na abrangncia dos modelos determinsticos e estocsticos, Himmelblau (1970) props que trs tipos muito gerais de modelos podem ser escritos para um processo, sendo: (a) Modelos de fenmeno de transporte - usam princpios fsico-qumicos. Como exemplo cita as equaes fenomenolgicas de converso, as quais so equaes de continuidade descrevendo as converses de massa, de momento e de energia; (b) Modelos de balano populacional - usam balanos populacionais. Distribuio de tempo de residncia e outras distribuies de idade so exemplos para este tipo de modelo; (c) Modelos empricos - usam dados empricos para o ajuste. So polinmios usados para ajustar os dados experimentais. Numa outra viso, Schwaab (2007) props os modelos distinguidos como: (a) Modelos Tericos e Empricos - nos modelos tericos as equaes que relacionam as diversas variveis do problema derivam de pressupostos tericos fundamentais como as leis de conservao de massa, de energia e de quantidade de movimento. J nos modelos empricos as equaes utilizadas para descrever as relaes observadas entre as variveis do problema so postuladas, no havendo a princpio qualquer pressuposto terico que justifique a relao concebida; (b) Modelos Lineares e No Lineares (implcitos e explcitos) - os modelos so ditos lineares quando apresentam relaes lineares entre as variveis consideradas no problema e quando satisfazem as propriedades de linearidade, caso contrrio, so classificados como no lineares. Estes modelos ainda podem ser considerados explcitos ou implcitos, conforme a possibilidade de resoluo direta ou necessidade de aplicao de mtodos numricos, respectivamente; (c) Modelos Determinsticos e Estocsticos - os modelos determinsticos associam a cada experimento um resultado bem definido, enquanto os modelos estocsticos associam a cada condio experimental um conjunto possvel de resultados, cada qual com certa probabilidade; (d) Modelos a Parmetros Concentrados e a Parmetros Distribudos - quanto forma da variao espacial das variveis. Os modelos a parmetros concentrados so assim designados se as variveis espaciais so desprezveis e as propriedades no mudam com a posio. Por outro lado, os modelos a parmetros distribudos tm lugar quando as variaes espaciais so relevantes; (e) Modelos Estacionrios e Dinmicos - tomando por base a dependncia temporal, os modelos so ditos dinmicos quando uma ou mais variveis variam no tempo e so chamados de estacionrios quando as variveis no mudam em funo do tempo. De acordo com Valdman (2008) os modelos matemticos representam o comportamento dinmico do processo segundo as caractersticas das equaes diferenciais e algbricas que o compem, de forma a definir os mtodos e tcnicas usadas para determinar a sua soluo. Nesta concepo, designaram-nos como: (a) Modelos agrupados so os constitudos por equaes diferenciais totais, obtidas pela aplicao das leis fundamentais, sendo o tempo a varivel independente. Neste caso, os processos so tratados como tendo todas as variveis agrupadas e uniformes dentro do volume considerado para a aplicao das leis da continuidade de massa e de energia; (b) Modelos distribudos - aqueles onde as equaes diferenciais componentes so parciais e, geralmente, a varivel tempo e outra va3o Trimestre de 2011 49
rivel dimensional (comprimento) so as variveis independentes. Nestes casos as variveis do processo so tratadas como variaes distribudas ao longo do volume total dos equipamentos considerados. As leis fundamentais so aplicadas, em geral, para volumes infinitesimais ao longo de uma das dimenses principais do equipamento; (c) Modelos lineares - aqueles nos quais as equaes diferenciais e algbricas no contm nenhum termo no linear. A no linearidade do termo caracterizada, por exemplo, por produtos de variveis dependentes, variveis em expoentes ou radicais e etc. Neste caso, os coeficientes de todos os termos das equaes diferenciais so constantes ou funes da varivel independente; (d) Modelos no lineares - os que apresentam as equaes diferenciais e algbricas do modelo contendo pelo menos um termo no linear. Assim, este termo contm um coeficiente ou uma funo de outra varivel dependente do modelo. Segundo Nielsen (2003), na combinao do balano de massa, incluindo as equaes cinticas de taxa e o modelo do reator, os modelos podem ser de estado estacionrio e transientes ou dinmico. Os modelos de estado estacionrio consistem em um conjunto de equaes algbricas que relacionam as variveis de sada s variveis de entrada. J os modelos transientes ou dinmicos englobam um conjunto de equaes diferenciais, onde, para um biorreator ideal, as variveis de sada so descritas como funes de tempo para o conjunto de variveis de entrada e para os valores iniciais das variveis de sada. No obstante, de uma forma geral, os modelos cinticos de processos fermentativos podem tambm ser divididos aproximadamente em quatro grupos, dependendo do nvel de detalhes do modelo (Oliveira, 2004; Coelho, 2001; Schmidell, 2001). Nessa linha de definio, tm-se: (a) Modelos estruturados e no estruturados - quanto ao nmero de componentes usados na representao celular. Os modelos estruturados levam em conta que a biomassa no um composto simples, visto que no interior das clulas ocorre uma srie de reaes envolvendo uma infinidade de substncias. Esse tipo de modelo em particular fornece uma melhor descrio das condies transientes em relao ao modelo no estruturado convencional. Por outro lado, os modelos no estruturados no consideram nenhuma organizao interna das clulas e sempre expressam a concentrao do microorganismo em termos de biomassa. Esses modelos so geralmente simples e as descries matemticas so baseadas em observaes da cintica do microrganismo; (b) Modelos segregados e no segregados - quanto heterogeneidade da populao microbiana. Os modelos segregados consideram a biomassa segregada em unidades estruturadas e funcionais, as clulas. Assim, a varivel fundamental o nmero de clulas. Estas so consideradas como unidades discretas e a populao vista como heterognea. J nos modelos no segregados assume-se que a biomassa est distribuda homogeneamente por todo o sistema. Desta forma, a varivel fundamental a concentrao celular e as clulas so representadas pela propriedade mdia da populao, ou seja, a populao considerada homognea. Esta diviso dos modelos tem por base a forma com que o bioprocesso abordado para o desenvolvimento dessa ferramenta (Schmidell, 2001; Nielsen, 2003). A Figura 4 mostra esquematicamente a variao da complexidade destes diferentes tipos de modelo.
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Figura 4 Variao de complexidade dos tipos modelo. A complexidade aumenta do canto superior esquerdo para o inferior direito. Adaptado de Nielsen (2003).
Ainda nesta linha de distino entre os modelos apresentados na Figura 4, Nielsen e colaboradores (2003) dividem os modelos matemticos para processos fermentativos em: (a) Cintica de crescimento no estruturada - modelos no estruturados so adequados para condies de estado estacionrio, mesmo quando h a incorporao de padres complexos de crescimento. Alm disso, este tipo de modelo propicia ajuste adequado para um conjunto restrito de dados e raramente pode ser empregado em condies experimentais significativamente diferentes. (a1) Modelos caixa preta (empricos): a mais simples apresentao matemtica, onde todas as reaes celulares so englobadas em uma nica reao global. Isto implica que os coeficientes de rendimento para crescimento celular, consumo de substrato e formao de produtos so constantes, assumindo-se a hiptese de uma constante distribuio de fluxos atravs de diferentes vias celulares e de distintas condies de crescimento. Neste caso, o modelo cintico transforma a descrio da taxa especfica de crescimento em uma funo das variveis do sistema; (a2) Modelos de reaes mltiplas: nestes modelos os fatores de converso no so constantes. J se considera alguma estrutura bioqumica no modelo cintico, movendo de no estruturado e no segregado em direo ao estruturado e no segregado, contudo ainda so basicamente no estruturados, uma vez que a influncia celular continua sendo expressa em funo da concentrao das clulas; (a3) Influncia da temperatura e pH: so includas como outras variveis de processo com incidncia na cintica de crescimento, sendo normalmente mantidas constantes ao entorno de seus valores timos. So tambm chamadas de parmetros de cultura para distingui-las das outras variveis, as quais mudam ao longo do processo fermentativo (concentraes reacionais, taxa de agitao e etc). (b) Modelos estruturados simples - em linhas gerais essa classe de modelos pode ser considerada como uma melhoria dos modelos no estruturados por meio da incorporao, pelo menos qualitativamente, de mecanismos bsicos do comportamento celular. Dessa forma, podem ter algum poder de predio, adquirindo habilidade para descrever processo de crescimento em diferentes condies utilizando o mes3o Trimestre de 2011 51
mo conjunto de parmetros como, por exemplo, em otimizao de processos. Nos modelos estruturados simples, componentes da biomassa so englobados dentro de poucas variveis chaves, esperando que sejam representativas do comportamento celular. Por esse motivo, a atividade microbiana torna-se funo no somente das variveis abiticas que podem mudar com constantes de tempo muito pequenas. Assim, so tambm funes da composio celular, dependendo da histria da clula, ou seja, das condies ambientais experimentadas pela cultura no passado. Os componentes celulares includos no modelo representam grupos de diferentes enzimas, metablitos ou outros componentes celulares. As reaes celulares consideradas nesses modelos so, portanto, empricas, porque elas no representam diretamente a converso entre os componentes. Da mesma forma, a cintica das reaes individuais normalmente descrita com o emprego de expresses empricas, de forma a ajustar os dados experimentais com um pequeno nmero de parmetros. Para tanto, expresses do tipo Monod so freqentemente usadas, uma vez que resumem algumas caractersticas fundamentais da maioria das reaes celulares, isto , sendo de primeira ordem baixa concentrao de substrato e de ordem zero alta concentrao de substrato. A despeito de sua natureza emprica, modelos estruturados simples so normalmente baseados em mecanismos celulares bem estabelecidos, sendo hbeis para simular certas caractersticas experimentais. (b1) Modelos de compartimento: a biomassa dividida em alguns compartimentos ou grupos moleculares. H a necessidade de escolher esses compartimentos com cuidado, devendo os componentes celulares com funes similares ser colocados no mesmo compartimento (por exemplo, todo material de membrana e outros componentes bastante inativos em um compartimento; todo material ativo em outro compartimento). Muitos modelos so baseados na diviso da clula em uma parte ativa e uma inativa. Ramkrishna e colaboradores (1967) apresentaram um dos primeiros modelos compartimentados, considerando a clula dividida em dois compartimentos: um compartimento G composto de cidos nuclicos e um compartimento D com enzimas. Toda a biomassa foi considerada ativa, uma vez que tanto o material gentico quanto as protenas so envolvidas no processo de crescimento. Contudo, ambos os compartimentos G e D podem ser degradados pela ao de um inibidor no especificado e tornar-se assim materiais inativos, sendo importante para a descrio das clulas mortas ao final do processo em batelada; (b2) Modelos cibernticos: para simplificar a complexidade da simulao do crescimento celular em mltiplos substratos, Ramkrishna (1982) desenvolveu um conceito de modelagem adequado para descrever o crescimento em mltiplas fontes de carbono e de energia. A abordagem por modelagem ciberntica baseia-se na hiptese que, enquanto a modelagem detalhada do processo regulador complicada, possvel a interpretao funcional da clula como sendo guiada pela estratgia de alocao tima de recursos (Ramkrishna, 1984). No existe nenhuma forma direta de confirmar se realmente microrganismos otimizam a alocao de seus recursos para o crescimento, dessa forma os modelos cibernticos devem ser aceitos na mesma base de outros modelos estruturados simples. (c) Modelos mecanicistas (ou fenomenolgicos) - modelos mecanicistas, tambm chamados de fenomenolgicos, incluem certa quantidade de informaes sobre o mecanismo celular existente, sendo normalmente criados no nvel molecular, assim como os modelos de
cintica enzimtica. Desta forma, tornam-se desejveis para avaliar a importncia relativa de diferentes processos celulares, visto o envolvimento de muitas estruturas reguladoras complexas. Esses modelos matemticos so bem adequados para tal finalidade, posto que permitem a integrao de informaes de diferentes experimentos, as quais somente podem ser obtidas por meio de anlises quantitativas. Todavia, ainda impossvel que o modelo descreva todos os processos envolvidos no crescimento celular, logo nem todos os processos so identificados e, mesmo que o fossem, a capacidade de processamento dos computadores no poderia controlar o grande nmero e complexidade dos modelos envolvidos nessa situao. (c1) Modelos geneticamente estruturados: tem por objetivo a quantificao da transcrio de gene com base no conhecimento da funo promotora. Entre os mais estudados promotores est o lac-promotor de Escherichia coli, o qual toma parte na regulao da expresso dos genes envolvidos no consumo de lactose (lactose permease e -galactosidase). O lac-promotor de grande interesse industrial para conduzir a expresso dos genes heterlogos que codificam protenas recombinantes em Escherichia coli. A verdadeira fora do modelo geneticamente estruturado no est ligada ao modelo de crescimento global, mas preferencialmente na possibilidade oferecida de analisar a influncia de parmetros especficos do modelo no processo, como a importncia de diferentes constantes de equilbrio. Como em muitas indstrias de enzimas exibem uma regulao complexa, estes modelos podem tambm ser usados para aumentar o conhecimento da expresso da codificao do gene da enzima de interesse. (c2) Modelos de clula nica: as caractersticas individuais da clula so consideradas e eventos particulares durante o ciclo celular podem ser estudados. As vantagens dos modelos de clula nica so: - possibilidade de descrever explicitamente a geometria celular e deste modo examinar seu potencial efeito no transporte de nutrientes; - incluir no modelo eventos temporais durante o ciclo celular; - considerar arranjos espaciais dos componentes intracelulares; - facilidade de incluir vias bioqumicas e modelos de controle metablico. No entanto, embora a meta final seja descrever todos os processos na clula, atualmente somente possvel representar poucos processos chaves. (d) Modelos estruturados morfologicamente - para alguns sistemas microbianos a diferenciao de clulas na cultura desempenha importante papel em sua performance global, pois a cintica de crescimento e a produtividade so afetadas pela presena de mais de um tipo de clula. Estes modelos com estrutura morfolgica j apresentam certo grau de segregao, sendo relevantes para a descrio do crescimento de fungos filamentosos, onde a diferenciao celular est relacionada com a extenso das hifas. Ento, as clulas so divididas em um nmero finito de estados e a converso entre os diferentes estados celulares determinada por uma seqncia de reaes morfolgicas empricas, descritas por um conjunto de reaes intracelulares. Contudo, os mecanismo por trs da maior parte das converses morfolgicas so amplamente desconhecidos, no permitindo descrever detalhadamente essas mudanas morfolgicas por modelos mecanicistas bem definidos e, portanto, reaes morfolgicas empricas tm sido empregadas. No obstante, esses modelos morfolgicos tambm so aplicveis para a descrio de outros sistemas celulares como bactrias contendo plasmdeos instveis e na ex-
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plicao do comportamento oscilatrio exibido em certas condies por culturas de leveduras. (d1) Modelos de cultura de levedura com oscilao: ao contrrio da diviso celular simtrica em bactrias, onde h a formao de duas clulas quase idnticas, a diviso celular em leveduras assimtrica formando a clula me e a clula filha, as quais so distintas. O ciclo celular de brotamento de levedura mostrado na Figura 5.
Figura 5 Ciclo celular de brotamento em levedura. Adaptado de Nielsen (2003).
Analisando a Figura 5, verificam-se os tempos e as fases do brotamento da levedura. A clula filha convertida em clula me dentro do tempo de crescimento tc, passando a seguir por um perodo de amadurecimento ta para o surgimento de um novo broto. Depois, decorrido mais um perodo de tempo de brotamento tb, o broto atinge um tamanho crtico e ocorre a diviso celular. Na diviso celular forma-se a cicatriz de broto, onde se acredita no poder haver um novo brotamento. O ciclo de brotamento para levedura composto por fases caractersticas, como apresentadas na Figura 5: (1) em tc + ta para a clula filha e em ta para a clula me ocorre a fase de amadurecimento, designada como fase G1. Nesta fase a clula se prepara para o brotamento (por exemplo, forma sua reserva de carboidrato); (2) em tb acontece o brotamento propriamente dito em trs fases consecutivas: (2.1) fase S onde os cromossomos so duplicados; (2.2) fase G2 quando a clula se prepara para a diviso; (2.3) fase M onde ocorre a diviso celular. Assim, o metabolismo da clula filha e o da clula me so muito diferentes, sendo necessria a aplicao do modelo morfologicamente estruturado para a correta descrio da cintica de crescimento global e, desta forma, descrever o fenmeno de oscilaes espontneas observadas em variveis de processo como oxignio dissolvido, concentraes de etanol e glicose, taxas de consumo de oxignio e de formao de CO2 e de variveis intracelulares (NAD e DNA) (Nielsen, 2003). (d2) Modelo de crescimento de fungos filamentosos: o crescimento de fungos filamentosos difere muito do observado em microrganismos unicelulares. Nos fungos as clulas esto conectadas em estrutura de hifas. Dentro dessa estrutura multicelular todas as clulas podem contribuir no processo de crescimento produzindo protoplasma, contudo o crescimento das hifas ocorre somente nas pontas. Portanto, o nmero de pontas no miclio uma caracterstica morfolgica varivel. Megee (1970) formulou o primeiro modelo morfologicamente estruturado para descrever o crescimento e formao de produto em Aspergillus awamori, considerando cinco formas morfolgicas separadas no modelo: (1) ZA comportamento apical nas hifas
em crescimento ativo; (2) ZH comportamento subapical nas hifas em crescimento ativo; (3) ZC desenvolvimento de conidiforos; (4) ZB esporos pretos; (5) ZM esporos maduros. Este modelo descreve diversas observaes gerais concernentes ao crescimento do fungo estudado e constitui um bom exemplo do emprego de modelos morfologicamente estruturados na descrio de sistemas muito complexos. No obstante, uma desvantagem deste modelo o grande nmero de parmetros, mas para simulaes de crescimento submerso pode-se negligenciar a formao de esporos e considerar somente o crescimento ativo das hifas e contornar a super parametrizao do modelo. Em alguns processos, dado as suas caractersticas especficas, no se consegue, pela aplicao de uma tcnica de modelagem isoladamente, a descrio do fenmeno com acurcia suficiente para permitir sua operao dentro das condies exigidas. Nesses casos recorrente na literatura a combinao de tcnicas de modelagem, aproveitando os pontos fortes de cada uma de forma a compensar as limitaes individuais. A essa juno de duas ou mais tcnicas para diferentes aspectos de um sistema microbiano d-se o nome de modelagem hbrida (Patanaik, 2009). Esta tcnica de modelagem tambm chamada de caixa-cinza (Zorzetto, 2000; Komives, 2003; Boareto, 2005). Este ltimo autor avalia que os modelos cognitivos so freqentemente superiores aos modelos mecanicistas para um reator no ideal. A modelagem hbrida tem sido reconhecida como uma alternativa quanto a custo e efetividade para anlise de bioprocessos (Oliveira, 2004; Zorzetto, 2000; Henriques, 1999; Psichogios, 1992; Boareto, 2005).
CONCLUSO A necessidade de desenvolvimento de processos para obteno de energia a partir de fontes sustentveis recorrente na literatura. A produo de bioetanol e outros biocombustveis desponta como tecnologia vivel e necessria devido a fatores como a eminente extino dos combustveis fsseis e premncia em minorar o impacto ambiental. Assim, existe uma forte demanda para produo de etanol com eficincia, com baixo custo das matrias-primas e com baixo consumo de energia. A otimizao e a melhoria da produo passam pela busca de novos catalizadores biolgicos. Na produo de etanol o gnero bacteriano Zymomonas surge como alternativa por se destacar em relao levedura tradicional Sccharomyces cerevisiae, visto possuir maior grau de produtividade especfica, elevada tolerncia ao etanol e menor produo de biomassa, alm de caractersticas cinticas e de produtividade superiores. O etanol produzido recuperado em 90% a 95% do rendimento terico para Saccharomyces cerevisiae e em 97% para Zymomonas mobilis. Sistemas de fermentao bioqumicos so altamente sensveis s mudanas anormais em condies operacionais e a cada dia tornam-se mais complexos. Ento, para atingir o mximo rendimento possvel de produto, torna-se necessrio garantir, dentro da significncia estatstica desejada, a permanncia das condies
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de processo prximas a valores pr-estabelecidos. Isto implica em constante desenvolvimento do monitoramento e controle do processo. A permanente evoluo dos processos biotecnolgicos, garantindo a otimizao de rendimento, produtividade e conseqente reduo da gerao de resduos exige a constante elaborao de ferramentas que permitam o monitoramento, deteco de falhas e diagnstico para permitir a implementao de malha de controle eficaz. Nestes termos, a modelagem matemtica reveste-se de importncia como instrumento capaz de inferir a varivel independente como funo das variveis dependentes fixadas na partida do processo. Assim, a elaborao do modelo, juntamente com sua aplicao na simulao, rene uma srie de vantagens na hora de conhecer e melhorar o processo. Os modelos so empregados em todos os campos, sendo provavelmente impossvel incluir em uma nica definio as diversas vertentes existentes na literatura. Nesta primeira parte, das trs que compem esta reviso, abordaram-se os aspectos ambientais e econmicos, os aspectos gerais do processo fermentativo, os fundamentos bsicos de modelagem matemtica e a classificao de modelos matemticos, dando maior nfase aos processos fermentativos para produo de bioetanol, por envolver tecnologia de grande interesse estratgico. No escopo da abordagem na rea de modelagem foram descritas as caractersticas, aplicao e limitaes das inmeras tcnicas apresentadas. Essa descrio permite conhecer a aplicao mais adequada de cada tcnica de modelagem, possibilitando o discernimento de sua melhor adequao para cada processo em estudo. Para facilitar a visualizao foi proposto um esquema classificando os modelos dentro de distintos grupos, conforme os conjuntos de ferramentas e tcnicas matemticas disponveis para anlise. O conhecimento da tcnica mais adequada fundamental na tarefa de modelagem matemtica por favorecer o perfeito delineamento das etapas. Desta forma, pode-se assim desenvolver o modelo matemtico com capacidade de representar o processo dentro da significncia estatstica determinada e assumir a hiptese do modelo perfeito. Nesse sentido, a filosofia permanente no campo da modelagem implica na tendncia de utilizao dos modelos mais simples com capacidade de representar convenientemente o processo em detrimento aos mais complexos, evitando a demanda de tempo na formulao e a exigncia de esforo computacional excessivo, que muitas vezes pode implicar na no convergncia para a soluo do problema. A segunda parte desta reviso descrever os mtodos de modelagem fenomenolgica e por redes neuronais artificiais. Por fim, a terceira parte tratar, aos mesmos moldes, dos modelos cibernticos e hbridos.
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UMA REVISO DE MODELAGEM MATEMTICA EM BIOPROCESSOS. PARTE II: MODELOS MECANICISTAS E REDES NEURONAIS ARTIFICIAIS
lvaro Jos Boareto Mendesa,b,*, Belkis Valdman, e Maurcio Bezerra de Souza Jnior,*. Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia Av. Athos da Silveira Ramos, 149 Bloco E Sala E-209, 21941-909, Ilha do Fundo, Rio de Janeiro/ RJ, Brasil. b Seo de Engenharia Qumica Instituto Militar de Engenharia; Praa General Tibrcio, 80, 22290-270, Rio de Janeiro/RJ, Brasil. * boaretomendes@yahoo.com.br
ABSTRACT In bioprocesses the complexity varies according to the morphological changes of cells, the rheological characteristics of the fermentation broth and numerous other interfering factors. This requires raising the level of detail of the mathematical model, implying the inclusion of equations for the description of metabolic pathways, of intracellular reactions and various abiotic variables, requiring deeper knowledge of the microbial system, often unavailable. In the first part of this review, the mathematical modeling subject was contextualized within the industrial production process, invoking the strategic relevance of bioethanol production, when the basic fundamentals and classification of mathematical models in the context of fermentation processes were discussed. In this second part, we describe mechanistic models and artificial neural networks. The methodologies of models nominated above are described, with the most important definitions, discussing about recurrent applications in the literature and outlining an application example. Moreover, the main advantages and drawback of each technique are discussed. About RNA, we discuss the foundations of neural models too, training methods for MLP and RBF networks and architectures most often used in chemical engineering are shown. The third part of this work will focus on cybernetic and hybrid modeling. Keywords: Bioprocess Modeling, Mecanicist Model, Artificial Neural Networks; Artificial Intelligence; Intelligent Model
RESUMO A complexidade dos bioprocessos varia de acordo com as modificaes morfolgicas das clulas, as caractersticas reolgicas do caldo de fermentao e numerosos outros interferentes. Isso requer um aumento no nvel de detalhamento do modelo matemtico implicando na incluso de equaes para a descrio dos caminhos metablicos, das reaes intracelulares e diversas variveis abiticas,
requerendo um conhecimento mais profundo do sistema microbiano, que geralmente no est disponvel. Na primeira parte dessa reviso a modelagem matemtica foi contextualizada dentro do processo de produo industrial, invocando a relevncia estratgica da produo de bioetanol, quando os fundamentos bsicos e a classificao dos modelos matemticos foram discutidos. Nessa segunda parte ns descrevemos modelos mecansticos e redes neurais. Essas metodologias de construo de modelos so descritas, com suas definies mais importantes e a discusso sobre as recorrentes aplicaes na literatura e seus exemplos de aplicao. Alm disso, as principais vantagens e desvantagens de cada tcnica so discutidas. Para as RNA abordam-se tambm os fundamentos dos modelos neuronais e os mtodos de treinamento para as redes MLP e RBF. Alm disso, as redes de arquitetura mais utilizadas na engenharia qumica tm suas principais aplicaes enunciadas. A terceira parte dessa reviso ser focada em modelagem ciberntica e hbrida. Palavras-chave: Modelagem de bioprocessos, Modelo mecanicista, Redes neurais; Inteligncia artificial; Modelo inteligente. LISTA DE SMBOLOS
(a) Modelo fenomenolgico (Daugulis, 1997) a b D De Ki Ks Kmp P Pe Pma Pmb Pme SMBOLOS Parmetro para taxa especfica de crescimento instantnea (adimensional) Parmetro para taxa especfica de crescimento instantnea (adimensional) Taxa de diluio para substrato (h-1) Taxa de diluio para etanol exgeno (h-1) Fator de inibio para taxa especfica de crescimento dinmica (adimensional) Parmetro de inibio de substrato para taxa especfica de crescimento (g L-1) Parmetro de saturao de substrato para taxa especfica de crescimento (g L-1) Parmetro de saturao de substrato para taxa de produo de etanol (g L-1) Concentrao de etanol (g L-1) Concentrao de etanol exgeno (g L-1) Limite de inibio de etanol para taxa especfica de crescimento instantnea (g L-1) Limite mximo de inibio de etanol para crescimento celular (g L-1) Limite mximo de inibio de etanol para produo de etanol (g L-1)
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(a) Modelo fenomenolgico (Daugulis, 1997) Pob Qp Qpmax S Sf Si SMBOLOS Limite de inibio de etanol para taxa especfica de crescimento instantnea (g L-1) Taxa especfica de produo de etanol (g g-1h-1) Taxa especfica mxima de produo de etanol (g g-1h-1) Concentrao de substrato (glicose) (g L-1) Concentrao de substrato na linha de alimentao (glicose) (g L-1) Limite inferior de inibio por substrato de taxa especfica de crescimento (g L-1) Tempo atual (h) Concentrao de celular (g L-1) Mdia ponderada de 1 ordem da taxa de mudana da concentrao de etanol (g L-1h-1) Coeficiente de rendimento para formao de etanol (g g-1) Mdia ponderada de 2 ordem da taxa de mudana da concentrao de etanol (g L-1h-1) SMBOLOS GREGOS Expoente de inibio por etanol para a taxa de produo de etanol (adimensional) Parmetro histrico ponderado para a taxa de mudana de concentrao de etanol. Indica a magnitude do tempo LAG para o atraso do efeito de inibio (h-1) Tempo no passado quando ocorre a mudana na concentrao de etanol, a qual causa a mais significativa influncia na performance da clula (h) no tempo atual t (h) Parmetro do fator de inibio da taxa de mudana da concentrao de etanol (adimensional) Parmetro do fator de inibio da taxa de mudana da concentrao de etanol (adimensional) Varivel de contagem para adio de etanol exgeno (adimensional) Tempo histrico (h) Mdia ponderada da taxa de mudana da concentrao de etanol anterior (h-1) Taxa de crescimento especfica instantnea (h-1) Taxa especfica de crescimento dinmica (h-1) Taxa de crescimento especfica instantnea na concentrao de etanol instantnea zero (h-1)
X W YP/S Z 1/
w (S,P) (S,P,Z) max
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(b) Rede Neuronal Artificial SMBOLOS funo de ativao gaussiana para a camada escondida de rede neuronal de funes de bases radiais centro da funo de ativao gaussiana de rede neuronal de funes de bases radiais vetor de centros armazenados da funo de ativao gaussiana de rede neuronal de funes de bases radiais centro do vizinho mais prximo da funo de ativao gaussiana de rede neuronal de funes de bases radiais elementos do vetor de centros armazenados da funo de ativao gaussiana de rede neuronal de funes de bases radiais gradiente para calcular a direo de busca erro global da rede neuronal erro para cada padro de treinamento p apresentado rede neuronal quando referida a um neurnio denota funo de ativao ou funo de transferncia funo de ativao gausiana nmero ndice designao do j-simo neurnio de uma camada k+1 designao da camada de unidades neuroniais anterior camada k+1 designao da camada de unidades neuroniais seguinte nmero de neurnios na camada escondida nas redes neuronais de funo de bases radiais camada de sada da rede neuronal unidades de soma lineares da camada de sada de rede neuronal de funes de bases radiais nmero de neurnios na camada escondida nmero de neurnios na camada de entrada nmero de neurnios na camada k nmero de neurnios na camada de sada dimenso do vetor de entradas nas redes neuronais de funo de bases radiais
ak(x) c ck ckP cik E E Ep () pj i j k K+1 L L M nh ni nk nL N
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(b) Rede Neuronal Artificial SMBOLOS nmero total de padres de treinamento padro de treinamento nmero de vizinhos mais prximos ckp nas redes de bases radiais sada predita pela rede neuronal direo de busca para otimizao ou sada da rede neuronal direo de busca na iterao k direo de busca na iterao k+1 sada predita pela rede neuronal para o padro de treinamento p direo inicial de busca para otimizao sada ou ativao de um neurnio i da camada k, para um padro p resposta do j-simo neurnio de acordo com a funo de ativao oriunda da camada k+1 resposta do j-simo neurnio de acordo com a funo de ativao oriunda da camada de sada sinal de sada de um neurnio L na camada de sada sada alvo sada alvo de um neurnio l da camada de sada, para um padro p forma vetorial das variveis independentes de otimizao (pesos e biases) forma vetorial das variveis independentes de otimizao nas condies iniciais (pesos e biases) forma vetorial das variveis independentes de otimizao (pesos e biases) na iterao k forma vetorial das variveis independentes de otimizao (pesos e biases) na iterao k+1 peso entre o neurnio j da camada k+1 e o neurnio i da camada anterior fator peso entre a sada da camada escondida e a camada de sada de rede neuronal de funes de bases radiais vetor de entradas nas redes neuronal de funo de bases radiais camada de sada de rede neuronal de funes de bases radiais
Np p P s s sk sk+1 sp so spi,k Spj,k+1 Spj,L SpnL,L t tpl w w0 wk wk+1 wjik wkj x yj
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(b) Rede Neuronal Artificial SMBOLOS SMBOLOS GREGOS termo de momento taxa de aprendizagem limite interno de ativao do j-simo neurnio na camada de sada para redes de bases radiais (bias) limite interno de ativao do j-simo neurnio na camada k+1 (bias) limite interno de ativao do j-simo neurnio na camada de sada (bias) nvel de ativao do j-simo neurnio nvel de ativao do j-simo neurnio para um padro de treinamento na camada k+1 nvel de ativao do j-simo neurnio para um padro de treinamento na camada de sada Centro da funo de ativao gaussiana funo degrau linear fator escala para redes de bases radiais fator escala para redes de bases radiais
j j,k+1 j,L j,k+1 pj,k+1 pj,L ji j k
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AI ANN Bias BP CER Entner-Doudorof Feedforward GRNN MLP MLST PNN PSP RBF RMS RNA Inteligncia artificial (Artificial Intelligence) Artificial neural networks Limite interno de ativao de uma unidade neuronal retropropagao (backpropagation) velocidade de produo de gs carbnico Rota metablica empregada por Zymomonas mobilis para fermentao alcolica Diz-se das RNA cuja alimentao de dados histricos seguem do incio para o final para frente Rede neuronal de regresso generalizada (general regression neural network) Perceptron muticamada (multilayer perceptron) Modelo de sries temporais lineares Rede neuronal probabilstica (probabilistic neural network) Funo potencial ps-sinptico Funo de bases radiais (radial of bases function) Raiz da distncia mdia dos quadrados Rede(s) neuronal(ais) artificial(ais) ou Rede neural artificial ANN
INTRODUO O desenvolvimento de modelo avanado para monitoramento de biorreator, otimizao e estratgia de controle algumas vezes condicionado pela etapa de modelagem. Nesse contexto, os modelos para bioprocessos so freqentemente simplificados em demasia, particularmente no que concerne descrio de subsistemas de populaes celulares (Oliveira, 2004). Essa tendncia de utilizao de modelos mais simples em detrimento aos mais complexos est de acordo com a filosofia permanente no campo da modelagem matemtica, onde se busca sempre o modelo mais simplificado que possa representar convenientemente o processo, evitando a demanda de tempo em sua formulao e a exigncia de esforo computacional excessivo (Boareto, 2005). No obstante, a busca da simplicidade ao modelar traz ambigidade entre os conceitos do modelo eficiente e do modelo simples (Boareto, 2005). Deste modo, Oliveira (2004) constata que para alguns processos estacionrios, modelos simples podem produzir resultados com acurcia suficiente, contudo, para processos operados em batelada alimentada - altamente dinmicos, negligenciar a estrutura intracelular e a heterogeneidade celular resultar invariavelmente em insuficiente estimao ou capacidade de predio do modelo. Coelho (2001) tambm verificou a possibilidade de discrepncias entre a predio do modelo e os dados experimentais, devido grande complexidade e incerteza caractersticas dos biopro66 3o Trimestre de 2011
cessos reais. Tal complexidade e incerteza so inerentes descrio das taxas cinticas, geralmente representadas por expresses semi-empricas que procuram abarcar fenmenos de inibio por substrato e produtos, represso catablica e limitao por substrato. Assim, o mais importante elemento na modelagem matemtica de processos fermentativos definir a estrutura do modelo, que implica em especificar sua complexidade e, deste modo, tem-se como regra que o modelo seja to simples quanto possvel, mas no o mais simples (Nielsen, 2003). Essa regra implica que os mecanismos bsicos sejam sempre includos e que a estrutura do modelo seja determinada por seu objetivo. Na segunda e terceira parte desta reviso bibliogrfica sero abordados os modelos matemticos mais comumente citados na literatura atinente a bioprocessos, ou seja, os fenomenolgicos (mecanicista), as RNA, os cibernticos e os hbridos. Nesta segunda parte, so descritos os modelos mecanicistas e as RNA. As metodologias de cada modelo acima nominado so descritas, apresentando as definies mais importantes, discorrendo sobre as aplicaes conforme citado na literatura pertinente, bem como um exemplo de aplicao mostrado. Ademais, as principais vantagens e limitaes de cada tcnica so discutidas. Para as RNA abordam-se tambm os fundamentos dos modelos neuronais, os mtodos de treinamento para as redes MLP e RBF. As redes de arquitetura perceptron multicamada, funo de bases radiais, lineares, bayesianas (neuronais probabilsticas e neuronais de regresso generalizada), mais utilizadas na Engenharia Qumica, tm suas principais aplicaes enunciadas.
MODELO MECANICISTA O termo designativo mecanicista do ingls mechanicist refere-se doutrina do mecanicismo, a qual admite que determinado conjunto de fenmenos, ou mesmo toda a natureza, se reduz a um sistema de determinaes mecnicas. Concebe, ainda, o movimento como determinado por lei causal rigorosa, negando todo o tipo de finalismo ou de qualidade oculta para a determinao dos fenmenos naturais (Ferreira, 1975). Esses modelos tambm so designados como fenomenolgicos, por descreverem os fenmenos do sistema empregando equaes matemticas. Patnaik (2009a) trata o modelo mecanicista como modelo convencional. Os modelos mecanicistas utilizam sistemas de equaes diferenciais e algbricas, exigindo conhecimento amplo e geral sobre o sistema a ser modelado. Oliveira (2004) verificou que freqentemente modelos celulares no estruturados e no segregados so as nicas opes de escolha para a modelagem matemtica de processos biotecnolgicos, seja pela falta de conhecimento bsico ou pela complexidade excessiva dos processos biotecnolgicos. Nesta mesma linha, Coelho (2001) relatou que o levantamento de modelos estruturados dependente de um grande conhecimento sobre o metabolismo do microrganismo e, por esta razo, os modelos no estruturados tm sido mais utilizados para propsitos prticos.
Jbses (1986) props um modelo estruturado em dois compartimentos considerando a clula dividida em compartimentos contendo grupos especficos de macromolculas (por exemplo, protenas, DNA e lipdios). Montesinos (1997) desenvolveu um modelo matemtico estruturado acoplado com uma metodologia para estimao de variveis de estado e parmetros para aplicao no processo de produo de lipase por Candida rugosa para operao em batelada e contnuo, apresentando resultados satisfatrios. Daugulis (1997) relatou a proposio recente de diversos modelos para representar o comportamento oscilatrio de Zymomonas mobilis em processos contnuos de produo de etanol. Neste contexto citou o modelo proposto por Ghommidh (1989), que posteriormente foi expandido por Jarzebski (1992) pela incluso de limitao de substrato e inibio pelo produto, conceituando a populao celular em trs estados: (1) clulas viveis com capacidade de reproduo e produo de etanol; (2) clulas no viveis capazes de produzir etanol, mas sem capacidade de reproduo; e (3) clulas mortas incapazes de reproduzir e produzir etanol. Assim, com equaes de balano de massa apropriadas, o modelo foi hbil para representar o comportamento oscilatrio dos dados experimentais obtidos. No entanto, os experimentos necessrios para a determinao do estado das clulas consumiam muito tempo. Freire (1999) props um modelo no estruturado para a representao do processo de produo de lipase por Penicillium restrictum em um fermentador operado em descontnuo. O autor relatou que a produo de enzima por Penicilliun apresenta alguns desafios para a modelagem matemtica devido a mudanas na morfologia da biomassa que ocorrem durante o cultivo e as complexas caractersticas reolgicas do caldo fermentativo, alm de outros fatores interferentes. Um modelo matemtico que representasse o processo de sntese de ster em um sistema bifsico usando lipase imobilizada de Mucor circinelloides foi desenvolvido por Antezak (2001). Os resultados obtidos pelos autores mostraram que a proposta de um modelo matemtico no estruturado respondeu com alta preciso o rendimento de sntese de ster. Segundo Pinheiro (2005) muitos relatos de comportamentos oscilatrios em fermentao contnua podem ser encontrados na literatura. Destacam que a maior parte do fenmeno oscilatrio est associada com Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis. Ainda segundo os autores, o modelo matemtico mais desenvolvido foi o proposto por Li (1995 apud Pinheiro, 2005). Ranzan (2009) fez uma reviso sobre modelos matemticos propostos na literatura para fermentaes contnuas empregando Zymomonas mobilis e glicose como substrato, referindo-se aos modelos propostos por Jbses (1986), Ghommidh (1989), Jarzebski (1992) e Daugulis (1997). Por fim, fez anlise detalhada dos modelos estudados por Jbses (1986) e Daugulis (1997) utilizando anlise de bifurcao. No esforo de modelagem em seu trabalho, Camlo (2009) implementou o modelo fenomenolgico de Daugulis (1997) para representar o comportamento oscilatrio exibido no processo de produo de etanol quando do emprego de Zymomonas mobilis. A autora relatou dificuldade em estimar parmetros, mesmo pelo emprego de diferentes tcnicas. Nesta condio, sugeriu uma determinao mais
precisa dos fatores que desencadeiam as oscilaes, levando em conta a rota bioqumica da bactria Zymomonas mobilis e, assim, redefinir os parmetros mais importantes. Daugulis (1997) sugeriu um modelo mecanicista no estruturado, baseado nas variveis macroscpicas de processo, tais como concentrao celular, consumo de substrato e formao de etanol. Para tanto, analisou prvios trabalhos de Li (1995) com Zymomonas mobilis. Ento, para proceder modelagem, basearam-se na constatao de que o efeito inibitrio histrico da concentrao de etanol (etanol produzido no processo) era insignificante, enquanto o efeito de inibio provocado por uma taxa ascendente de variao na concentrao de etanol (etanol exgeno adicionado) era bastante intenso. Desta forma, ao reconhecer que as clulas so incapazes de responder instantaneamente s mudanas no seu ambiente, o autor postulou a existncia de um atraso a ser considerado entre o momento no qual as clulas sofrem uma mudana em seu ambiente reacional e o momento no qual h sua resposta metablica efetiva. Este modelo proposto por Daugulis (1997) consta de trs equaes diferenciais estabelecidas do balano de massa, duas equaes diferenciais resultantes da diferenciao de Z (t) e W (t) em relao a t, oito equaes algbricas e mais uma funo tangente hiperblica, conforme descrito abaixo: Taxa de crescimento celular: (Eq. 1) Taxa de consumo de substrato: (Eq. 2) Taxa de formao de produto: (Eq. 3) Derivada da mdia ponderada da taxa de mudana de concentrao de etanol de 2 ordem:
(Eq. 4)
Derivada da mdia ponderada da taxa de mudana de concentrao de etanol de 1 ordem: (Eq. 5) Mdia ponderada da taxa histrica de mudana da concentrao de etanol de 2 ordem: (Eq. 6)
O tempo histrico (): (Eq. 7) tempo no passado quando ocorre a mudana na concentrao de etanol, a qual causa a mais significativa influncia na performance da clula (h) no tempo atual t (h). Peso para a taxa histrica de mudana da concentrao de etanol:
Onde
(Eq. 8) Funo hiperblica continuamente diferencivel, para aproximar o efeito de Z(t) sobre o crescimento celular:
.....[adimensional]
(Eq. 9)
Mdia ponderada da prvia taxa de variao da concentrao de etanol de 1 ordem: (Eq. 10) Peso para a taxa histrica de mudana da concentrao de etanol de 1 ordem: (Eq. 11) Taxa dinmica especfica de crescimento relacionada taxa instantnea especfica de crescimento pelo fator de inibio:
]
(Eq.12)
Velocidade especfica de crescimento celular, com inibio pelo produto e pelo substrato
(Eq. 13)
(Veeramallu, 1990): A taxa especfica de produo: (Eq. 14)
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Camlo (2009) estudou o comportamento dinmico das principais variveis de estado (concentrao celular, decaimento de glicose e formao de etanol) em fermentao alcolica catalisada por Zymomonas mobilis, tendo glicose como substrato. Para seu estudo, a autora empregou anlise de bifurcao e o modelo mecanicista proposto por Daugulis (1997). Ao estudar o modelo de Daugulis (1997), Camlo (2009) considerou que a taxa especfica de produo (Qp) retirada da literatura (Lee, 1983; Luong, 1985 apud Daugulis, 1997), vincula totalmente o consumo de glicose produo de etanol, no considerando parte do consumo para o crescimento celular, estando em desacordo com a rota de Entner-Doudoroff, o que segundo a autora, no permitiu o ajuste do modelo implementado em sua pesquisa. No prosseguimento de seu estudo e face ao no ajuste do modelo mecanicista empregado, Camlo (2009) formulou tambm modelos lineares (MLST Modelo de Sries Temporais Lineares) para aplicaes de monitoramento e controle, empregando os dados on line de concentrao celular obtida, considerando a ferramenta til para predio do comportamento oscilatrio. Essa srie de fatores complicadores para a modelagem matemtica de bioprocessos, descrita nos pargrafos anteriores, comumente acarretam a insero de grande quantidade de parmetros de ajuste na maioria das vezes difceis de estimar, alm do acoplamento do sistema de equaes, tornando sua soluo difcil e por muitas vezes impossvel para a preciso requerida (Boareto, 2005). Esta dificuldade de estimao pode estar relacionada aos efeitos correlacionados advindos do grande nmero de parmetros, o que torna alguns desses parmetros no significativos estatisticamente. Embora o desenvolvimento de modelos matemticos apropriados que possibilitem a simulao, otimizao e implementao de malhas de controle do processo seja altamente desejvel, a literatura cientfica reporta que o desenvolvimento de modelos matemticos fenomenolgicos simples com acurcia suficiente para a descrio de bioprocessos uma tarefa difcil, dada a sua alta no linearidade e complexidade (Glassey, 1994; Hussain, 1999; Henriques, 1999; Zorzetto, 2000; Vlassides, 2001; Patnaik, 2003; Oliveira, 2004). Modelos mecanicistas (convencional) de sistemas microbianos so derivados da analogia com reaes qumicas. No entanto, falham ao retratar algumas caractersticas da dinmica microbiana, as quais diferem das observadas nas reaes qumicas. Alm disso, a interao entre a fluidodinmica e o metabolismo cria novo modelo de comportamento celular, o qual dificilmente descrito por modelos fenomenolgicos. Essas dificuldades so mais pronunciadas para fermentaes complexas em biorreatores grandes, onde mais de um substrato usado e apresenta homogeneizao no uniforme (Patnaik, 2009a). Assim, dada a limitao da aplicao de modelos fenomenolgicos bioprocessos que exijam maior complexidade em sua descrio, a literatura descreve outras ferramentas empregadas separadamente ou combinadas. Abaixo, encontram-se descritas algumas delas, tais como RNA.
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REDES NEURAIS ARTIFICIAIS: INTELIGNCIA ARTIFICIAL O paradigma das RNA (Artificial Neural Netwokrs - ANN) resultante de pesquisas em Inteligncia Artificial (AI - Artificial Intelligence), as quais tentam aprender e modelar o comportamento do crebro. Neste contexto, existem trs principais ramos da AI, quais sejam: sistemas especialistas, redes neuronais e sistemas de lgica Fuzzy (Haykin, 1999; Baughman, 1995). Na literatura, como nomenclatura na lngua portuguesa, ANN so designadas comumente como Redes Neurais Artificiais, Redes Neuronais Artificiais ou Redes Neuroniais Artificiais (RNA). Sem entrar no mrito da discusso sobre a nomenclatura mais apropriada, cumpre relatar que o Dicionrio Aurlio Buarque de Holanda Ferreira descreve o termo NEURAL como sendo relativo a ou prprio de nervo; o termo NEURONIAL - correspondente a neurnico, como relativo ou pertencente aos neurnios; e o termo NEURONAL, apesar de recorrente na internet, no encontrado no dicionrio consultado (Ferreira, 1975). Neste trabalho as ANN so referidas como RNA. Os sistemas especialistas operam simbolicamente, numa escala macroscpica, processando smbolos no numricos e nomes. Requerem o conhecimento das relaes e no se atm a como essas relaes se desenvolvem (Haykin, 1999; Baughman, 1995). Ainda, segundo De Souza Jr. (2001), nesse processamento simblico, o conhecimento - conjunto de informaes sobre um domnio particular - extrado e representado simbolicamente por regras. RNA, por outro lado, usam processamento subsimblico, caracterizado por interaes microscpicas que eventualmente se manifestam como comportamento macroscpico, simblico, inteligente (Haykin, 1999; Baughman, 1995). De Souza Jr. (2001) complementou quando recorreu considerao de que nem todas as informaes captadas pela mente humana so facilmente representadas por regras (processo simblico). Assim, as redes neuronais surgem como o modo de reproduzir esse mecanismo cognitivo onde se consegue reconhecer padres e caractersticas relevantes em um conjunto de dados. A lgica Fuzzy surgiu do desejo de quantificar sistemas baseados em regra. O raciocnio baseado em regra fundamentado em representao qualitativa do conhecimento e a lgica Fuzzy nos permite uma abordagem quantitativa com a representao qualitativa. Essa abordagem prov um modo para quantificar certos qualificadores tais como aproximadamente, freqentemente, raramente, vrios, poucos e muitos (Baughman, 1995). A Figura 1 correlaciona caractersticas dos sistemas especialistas, das Figura 1 Correlao de caractersticas de sistemas de inteligncia artificial. Adaptado de Kosko (1991) RNA e da lgica Fuzzy.
apud Baughman (1995).
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No obstante, a metodologia da modelagem de bioprocessos por RNA est inserida dentro do campo da modelagem emprica. Essa tcnica tambm conhecida como modelagem caixa-preta. As vantagens das RNA em relao a outras tcnicas computacionais podem se descritas como: (a) a informao distribuda sobre um campo de neurnios, propiciando-lhe maior flexibilidade quando comparada ao processamento simblico; (b) habilidade em aprender frente situao que provoque impreciso no sistema; (c) habilidade para armazenar uma quantia grande de informao e acess-las facilmente (knowledge indexing); (d) melhor para processamento de sistemas com rudos, incompletos ou inconsistentes; (e) imita o processo de aprendizado humano (tentativa e erro); (f) capacidade de determinar automaticamente as relaes essenciais de um conjunto de dados de entrada - sada; (g) potencial para uso on-line pois, apesar de poder requer longo tempo para treinamento para, uma vez treinada, pode calcular o resultado de uma dada entrada com muita rapidez (Baughman, 1995). Baughman (1995) tambm apresentou as principais limitaes das RNA, dentre as quais tem-se: (a) pode necessitar de longo tempo de treinamento; (b) necessita de grande quantidade de dados para o treinamento (Henriques, 1999); (c) no garante resultados timos, pois o treinamento dos biases pode levar a preciso da rede para alguma regio de operao, sendo imprecisas em outras regies. Assim no garante 100% de confiabilidade, vez que est limitada aos dados de treinamento, o que, segundo Lennox (2001), pode ser contornado com o procedimento de validao com conjunto de dados distinto dos de treinamento. Conforme descrito por Linko (1992) e Zorzetto (2000), os modelos desenvolvidos aplicando tcnicas de RNA, tambm chamados de caixa-preta, no exigem o conhecimento do fenmeno fsico envolvido no processo, bastando-lhe apenas os dados experimentais. Cruz (1998) aplicou separadamente modelos fenomenolgicos e RNA para a descrio do processo de produo da Cefalosporina C com Cephalosporium acremonium, discorrendo sobre a viabilidade de aplicao de tcnicas de RNA para o monitoramento, deteco de falhas e simulao, haja vista o comportamento no linear do processo ter sido descrito de forma adequada por essa ferramenta computacional. Em sua concluso verificou que, apesar de ambos os modelos (neuronal e fenomenolgico) terem descrito satisfatoriamente as caractersticas principais do processo, a rede neuronal se sobressaiu ao dispensar a difcil etapa de estimao de inmeros parmetros de ajuste. Henrique (2000) relatou que RNA tm sido intensivamente utilizadas em aplicaes de Engenharia Qumica. Assim, desenvolveu em seu trabalho metodologia para identificar e eliminar parmetros redundantes e insignificantes que aumentam a complexidade das redes e diminuem sua acurcia. Segundo Lennox (2001), uma vez que o desempenho dos algoritmos para monitoramento e controle de processos dependente da preciso dos modelos utilizados em seu interior, as RNA tm potencial para prover benefcios a esses algoritmos quando aplicados a sistemas no lineares. Este autor obtiveram sucesso
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quando aplica as RNA em seu trabalho para a modelagem, monitorao e controle de processos. Vlassides (2001) empregou uma rede neuronal artificial para a anlise sensorial de vinhos. A rede treinada foi de topologia feedforward com uma camada escondida - empregando funo de ativao sigmoidal, e funes de ativao linear para as demais camadas. O autor observou que a rede neuronal estudada foi capaz de predizer os atributos qumicos e sensoriais do vinho. Komives (2003) discutiu que modelos empricos podem variar de muito simples - para a estimao de simples varivel fundamental, a muito complexo - para a estimao e controle do estado total do processo. Observam tambm que, dada impreciso na predio dos dados de sada, quando as RNA so empregadas fora do domnio dos dados histricos usados no treinamento (espao amostral), no apresentam boa propriedade de extrapolao; h, portanto, dificuldade de validao deste mtodo para processos farmacuticos. No entanto, Linko (1992) e Glassey (1994) obtiveram anteriormente resultados satisfatrios com a utilizao de modelos estruturados em tcnicas de redes neuronais para estimao e predio no controle de fermentao de glucoamilases e superviso de bioprocesso de Escherichia coli recombinante, respectivamente. Esses resultados significativos aplicando modelos baseados nos princpios de RNA, segundo os autores, so oriundos da habilidade das redes neuronais em aprenderem relaes no lineares complexas sem requerer detalhado conhecimento do processo, o que as tornam viveis para condies de comportamento pouco conhecido, que, alis, so deveras recorrentes em processos biotecnolgicos. Nessa mesma linha Hussain (1999) relatou que considerando o potencial das redes neuronais em aprender pelo exemplo, elas oferecem um mtodo de custo aceitvel para o desenvolvimento de modelos de processos teis. Cita ainda que elas tambm tm a habilidade de aprender comportamento dinmico freqentemente complexo de um sistema fsico. Boareto (2006) desenvolveu uma rede do tipo Percptron Multicamadas (MLP) para a representao de processo produtivo de lipase em batelada alimentada. Concluiu ser a rede adequada para a descrio da produo de lpase e alm disso discorreu sobre a possibilidade de sua aplicao como sensor virtual ao longo de uma fermentao, fornecendo - a partir de informaes da taxa de formao de gs carbnico (CER), biomassa e vazo de alimentao de substrato predio da atividade das enzimas, sendo tambm apropriado para emprego no desenvolvimento de modelos hbridos-neuronal/fenomenolgico. Fundamentos dos modelos neuronais Existe um nmero variado de tipos de RNA que podem ser aplicadas para a modelagem de bioprocessos, sendo definidas por sua topologia e pela anatomia de seus neurnios. Conforme o tipo de RNA empregada, o mtodo de aprendizado definido (Lennox, 2001). RNA multicamadas so compostas por seqncias de neurnios justapostos em camadas - entrada, escondida e sada - e interligados entre si por interconexes. Os neurnios constituem as unidades de processamento matemtico da rede. A forma como os neurnios esto interconectados define sua topologia ou
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arquitetura (Baughman, 1995; Haykin, 1999; De Souza Jr., 2003). Como exemplo pode-se citar o emprego de RNA de topologia multicamada com conexes feedforward, contendo trs camadas, quais sejam, uma camada de entrada, uma camada escondida e uma camada de sada. Nas redes intercamadas a sada de um neurnio alimenta a entrada do neurnio da outra camada e na conexo feedforward os sinais se propagam para frente (De Souza Jr., 2003; Lennox, 2001; Baughman, 1995). A Figura 2 apresenta esquematicamente a RNA em questo.
Figura 2 - RNA de topologia multicamada, com conexes feedforward contendo trs camadas (Baughman, 1995).
Definida a topologia da rede, o funcionamento de um neurnio numa rede multicamada pode ser estudado. Um neurnio j qualquer da camada k+1 recebe um conjunto de informaes Spi,k, onde i=l,...nk - correspondentes s sadas ou ativaes dos nk neurnios da camada anterior - ponderadas, cada uma, pelo peso wjik correspondente a sua conexo. O neurnio soma essas entradas ponderadas e o valor resultante comparado a um limite interno de ativao, chamado de bias representado por . O resultado dessa comparao constitui o nvel de ativao do j-simo neurnio, o qual, ento, produz uma resposta Spj,k+1 de acordo com uma funo de ativao (De Souza Jr. 1993; Baughman, 1995; Haykin, 1999). A Figura 3 esquematiza o j-simo neurnio descrito.
Figura 3 - J-simo neurnio da camada k+1.
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Os termos apresentados na Figura 3 so especificados a seguir. As entradas do j-simo neurnio so ponderadas conforme descrito pela equao 15: (Eq. 15) O nvel de ativao do j-simo neurnio definido por:
(Eq. 16) A equao que descreve como uma funo de ativao vel de ativao do j-simo neurnio dada a seguir: aplicada ao n-
(Eq. 17) Segundo Bakshi (1993), dois tipos de funes de ativao so comumente usadas para a ativao dos neurnios: global e local. As funes de ativao globais produzem uma sada ativa para um amplo intervalo de valores de entrada, e fornecem uma aproximao global para os dados empricos. As funes de ativao locais so aquelas que produzem uma sada ativa apenas na vizinhana imediata dos seus dados de entrada, ou seja, na vizinhana do seu centro de ativao. A topologia definida para a RNA, bem como a funo de transferncia aplicada no nvel de ativao dos neurnios, define o tipo de rede. As funes de ativao esto descritas abaixo (Baughamn, 1995; Haykin, 1999; De Souza Jr., 2001). As funes de ativao globais podem ser: Funo linear: (Eq. 18) Funo degrau limiar: para: para: Funo de ativao sigmoidal: (Eq. 21) Funo de ativao tangente hiperblica: (Eq. 22) A funo de ativao local :
(Eq. 19) (Eq. 20)
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Funo de ativao gausiana: (Eq. 23)
Portanto, como ser detalhado frente, as funes de ativao globais do tipo sigmoidal e tangente hiperblica so aplicveis para as redes do tipo MLP (Multilayer Perceptron) chamadas de Perceptron multicamada. A funo de ativao local do tipo gausiana aplicvel para redes do tipo RBF (Radial of Bases Function) chamada redes de funo de bases radiais ou simplesmente redes de bases radiais. Tipos de RNA Dentre as inmeras arquiteturas de RNA existentes, Baughman (1995), Karim (1997) e De Souza Jr. (2003) apresentaram as mais comuns no universo da Engenharia Qumica: (a) Rede Perceptron Multicamadas: a arquitetura de redes mais popular. Usa uma funo PSP (potencial ps-sinptico) linear e, usualmente, uma funo de ativao no-linear. Rede do tipo MLP pode ser usada em problemas de regresso e em problemas de classificao. (b) Funo de Bases Radiais: tem uma camada de entrada, uma camada escondida de unidades radiais e uma camada de sada de unidades lineares. Redes RBF so utilizadas tipicamente para problemas de diagnstico de falhas e classificao. Treinam relativamente rpido, no entanto, tendem a serem maiores que as MLP e, portanto, executam mais devagar. (c) Redes lineares: tm apenas duas camadas. Uma camada de entrada e uma de sada, a ltima tendo funes PSP de ativaes lineares. (d) Redes Bayesianas: h 2 tipos de redes bayesianas: Redes Neuronais Probabilsticas (PNN) e Redes Neuronais de Regresso Generalizada (GRNN). (d1) As PNN que so usadas apenas para tarefas de classificao e tm trs ou quatro camadas. H uma camada de entrada, uma camada de unidades radiais, e uma camada de unidades de classificao linear. (d2) As GRNN, empregadas apenas para tarefas de regresso, tm exatamente quatro camadas: uma camada de entrada, uma camada de centros radiais, uma camada de unidades de regresso, e uma camada de sada. (e) Redes Mapeamento Auto Organizvel de Caractersticas: tm uma camada de entrada e uma camada de sada de unidades radiais. So usadas principalmente para fins de classificao, como exemplo as redes treinadas pelos mtodos de Kohonen. Mtodo de treinamento de RNA Os mtodos de treinamento so divididos basicamente em supervisionados e no supervisionados (Baughman, 1995; Haykin, 1999; De Souza Jr., 2001). Nos mtodos supervisionados, existe um professor que orienta o aprendizado. Para tanto, padres com dados de entrada e sada (dados histricos) so apresentados rede, de modo que ela modifica as suas interconexes (pesos e biases) a fim de obterem uma sada alvo. J nos mtodos no supervisionados, a rede apresentada aos dados, des-
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cobre alguma propriedade e aprende a refleti-la nas suas sadas. No existe o professor, ou seja, no h o conjunto de dados de entrada e sada para determinar o comportamento da rede. A RNA autnoma. As redes MLP podem ser treinadas por um dos seguintes algoritmos subpervisionados: Gradiente Conjugado Descendente, Quasi-Newton, Levenberg-Marquardt, Back Propagation, Quick Propagation ou Delta-bar-Delta (De Souza Jr., 2001). As redes RBF so treinadas em trs estgios: (a) Localizao de centros - Os centros armazenados em uma camada escondida radial so otimizados primeiramente, (tipicamente) usando tcnicas de treinamento no supervisionadas. Os centros podem ser localizados pelos algoritmos: Sub-Sampling, K-means, treinamento Kohonen, ou Learned Vector Quantization. Estes algoritmos estabelecem os centros para refletir o agrupamento dos dados. (b) Estabelecimento dos desvios - O espalhamento dos dados refletido nos desvios radiais (armazenados no bias). Os desvios podem ser estabelecidos pelos algoritmos Explicit, Isotropic e K-nearest neighbor. (c) Otimizao linear - Uma vez estabelecidos os centros, a camada de sada linear usualmente otimizada usando a tcnica Pseudo-Inverse (otimizao por mnimos quadrados). Pode-se tambm usar Gradiente Conjugado Descendente, Quasi-Newton, Levenberg-Marquardt, Back Propagation, Quick Propagation, ou Delta-bar-Delta. Alternativamente, uma RBF usada para classificao pode usar funes de erro de entropia e funes de ativao logstica ou softmax. Neste caso, algoritmos de treinamento iterativos devem ser usados. Treinamento de RNA pelo mtodo de retropropagao Ao se tentar reproduzir os mecanismos de cognio humanos, treinam-se as redes neuronais pelo uso de exemplos. Entre os mtodos de treinamento das RNA, o da retropropagao se destaca pela simplicidade e larga utilizao (De Souza Jr., 1993). O mtodo de retropropagao, dentre todos os mtodos de treinamento de redes neuronais, tem sido desde a sua concepo o mais comumente utilizado (Karim, 1997; De Souza Jr., 2001). O objetivo do treinamento por retropropagao ajustar os pesos e biases da rede, modificando-os at que a aplicao de um conjunto de entradas produza a sada da rede que corresponda s sadas desejadas ou alvos. Para isso, apresentam-se muitos exemplos de dados histricos RNA. Treinar a rede, neste caso, corresponde a minimizar a funo objetivo no linear que d o erro entre as sadas s - preditas pela rede - e as sadas alvos t para Np padres em funo dos pesos e biases, que so as variveis independentes de otimizao. A fundamentao matemtica do mtodo encontra-se descrita em diversas referncias (Baughman, 1995; De Souza Jr., 1993; Haykin, 1999). Fonseca (1998) descreveu a metodologia da tcnica de treinamento por retropropagao, abordando os conceitos e, do ponto de vista de otimizao, a funo objetivo com a condio necessria para o mnimo, alm de variantes do mtodo. Os itens a), b) e c) a seguir apiam-se em sua descrio. a) Conceitos sobre retropropagao
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Segundo De Souza Jr. (1993), as redes treinadas pelo mtodo backpropagation so multicamadas, no apresentam conexes laterais (entre neurnios da mesma camada) e os seus sinais so feedforward, ou seja, dado um vetor de entrada, o vetor de sada calculado em um passo do tipo para frente (forward) que calcula os nveis de atividade de cada camada por vez, usando os nveis de atividade j computados nas camadas anteriores. Para as redes feedforward, esse mtodo calcula o gradiente do erro, aplicando de uma maneira direta a regra da cadeia do clculo elementar, como ser visto adiante. Logo, as funes de ativao dos neurnios da rede precisam ser funes continuamente diferenciveis. Vrias funes no lineares podem ser usadas no mtodo, sendo a sigmoidal (Equao 21) a mais empregada (Grossberg, 1976; Hopfield, 1984; Rumelhart, 1986). H tambm resultados na literatura (Hecht-Nielsen, 1989) que provam que qualquer funo contnua pode ser aproximada para qualquer grau de acurcia usando uma rede neural backpropagation com trs camadas, desde que exista um nmero suficiente de neurnios sigmoidais na camada escondida. Com essa motivao, Fonseca (1998) adotou no desenvolvimento de seu trabalho a funo sigmoidal como funo de ativao dos neurnios internos. A derivada f(x) da funo sigmoidal f em relao a x - aqui x representando um peso ou um bias - dada por: (Eq. 24) O padro de redes treinadas por retropropagao mais popular atualmente emprega apenas uma camada escondida. b) Descrio do mtodo pelo ponto de vista de otimizao b.1) Funo objetivo e condio necessria para mnimo A Figura 4 apresenta uma rede neuronal feedforward com trs camadas com os pesos e os biases das interconexes e neurnios. Treinar a rede, neste caso, corresponde a minimizar a funo objetivo no
Figura 4 - Rede neuronal feedforward com 3 camadas (De Souza Jr., 1993).
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linear (Equaes 25 e 26) que d o erro entre as sadas t - preditas pela rede, e as sadas alvos t para Np padres - adotando a nomenclatura de De Souza Jr. (1993), explicitada na Figura 4 - em funo dos pesos e dos biases, que so as variveis independentes de otimizao (W na forma vetorial): (Eq. 25)
onde: (Eq. 26) Os mtodos de otimizao multidimensional indiretos - que usam a informao do gradiente para calcular a direo de busca - empregam a condio necessria para um ponto extremo (Edgar, 1988): E ( W ) = 0 (Eq. 27) O clculo do gradiente da funo objetivo em relao aos pesos e aos biases ser apresentada posteriormente, pois antes preciso apresentar toda a nomenclatura para os sinais da rede. No mtodo retropropagao padro, Rumelhart (1986) minimizou a funo objetivo (Equao 26) usando a estratgia de otimizao do gradiente descendente, na qual a direo local da busca o negativo do gradiente, com tamanho do passo fixo ( chamado, neste contexto, taxa de aprendizagem). Assim, para a k-sima iterao: (Eq. 28)
onde positivo e, geralmente tem magnitude menor que 1 (De Souza Jr., 1993). Os passos de um treinamento por retropropagao so compostos de duas fases: na 1 fase a entrada sp apresentada e propagada para frente atravs da rede, at computar os sinais de sada que so comparados com as sadas alvos tpl, obtendo-se um erro; na 2 fase em que o erro Ep propagado para trs e os pesos vo sendo atualizados (De Souza Jr., 1993). Essas duas fases so apresentadas a seguir. Porm, antes de aplic-las deve-se inicializar os pesos das interconexes e os biases com nmeros aleatrios pequenos, de modo a evitar problemas como simetria (que haveria caso se comeasse com pesos iguais) e saturao (produzida por pesos grandes). Rumelhart (1986) adotou pesos iniciais aleatrios no intervalo entre -1 e 1. b.2) Fase 1: passagem para frente (forward) Para cada padro p (p=1,2,...,Np), tem-se um conjunto de entradas Spj,0 (j=1,2,... ni) - onde ni corresponde ao nmero de neurnios na camada de entrada - e um conjunto de sadas desejadas tpl (l=1,2,...nL) - onde nL corresponde ao nmero de neurnios na camada de sada. Apresenta-se um padro p, por vez, rede. A descrio da varredura da rede pelos sinais enumerada abaixo:
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(1) A passagem pela primeira camada de neurnios produz as seguintes ativaes: (Eq. 29) onde j=1,2,...,ni, e f dada pela funo de ativao sigmoidal (Equao 21); (2) Na sada da camada escondida tm-se as seguintes ativaes:
(Eq. 30)
(Eq. 31)
onde j= 1, 2,...nh; tal que f dada pela funo de ativao sigmoidal (Equao 21) e nh corresponde ao nmero de neurnios na camada escondida; (3) Na sada da rede tem-se:
(Eq. 32)
(Eq. 33)
onde j= 1, 2,...nh; tal que f dada pela funo de ativao sigmoidal (Equao 21). b.3) Fase 2: propagao do erro para trs (backpropagation) O erro obtido na sada da rede propagado para trs para atualizar os pesos e os biases. Primeiro corrigem-se os valores dos pesos entre a camada escondida e a camada de sada e depois, entre a camada escondida e a camada de entrada (Bhat, 1990). Como afirmado anteriormente, isto feito pelo mtodo gradiente descendente (Equao 28) no caso do mtodo retropropagao padro. Na implementao do backpropagation podem-se atualizar os pesos aps a apresentao de cada padro (aprendizagem por padro) ou aps a apresentao de todos os padres (aprendizagem por poca ou batelada) (McClelland, 1988; Leonard, 1990). Apresenta-se a seguir o clculo dos elementos de (De Souza Jr., 1993). Para os pesos wji2 entre a camada escondida e a camada de sada, calcula-se - pela regra da cadeia do clculo elementar- a derivada: (Eq. 34) Para os biases da ltima camada, calcula-se tambm pela regra da cadeia: (Eq. 35) Para os pesos wjil entre a camada de entrada e a camada escondida, calcu3o Trimestre de 2011 81
la-se - pela regra da cadeia - a derivada:
(Eq. 36) onde os valores de wji2 utilizados so os da iterao anterior (Bhat, 1990). Para os biases da camada escondida, tambm, pela regra da cadeia generalizada, calcula-se:
(Eq. 37)
onde os valores de wli2 utilizados so os da iterao anterior (Bhat, 1990). Repetem-se os passos das Fases 1 e 2 at que o erro (Equao 25) seja suficientemente pequeno. Logo, enquanto houver diferena entre as sadas da rede e os valores alvos para um dado padro, essa diferena vai dar um sinal de erro que propagado de volta (da o nome retropropagao) pela rede e usado para gerar mudana nos pesos. Depois do treinamento, a rede est pronta para ser usada. Tem-se, ento, apenas a fase em que as entradas passam atravs da rede para frente, correspondendo s Equaes 29 a 33. c) Variantes do mtodo O mtodo do gradiente descendente com passo fixo, adotado no mtodo por retropropagao padro, ineficiente (Edgard, 1988). Tem-se muita dificuldade de convergncia em funo da escolha do tamanho do passo fixo . Passos pequenos conduzem a uma convergncia extremamente lenta - principalmente perto da soluo (Watrous, 1987) - e passos grandes, levam a oscilaes nas variveis independentes de otimizao (pesos e biases). Com o intuito de evitar essas oscilaes nos pesos, pode-se somar ao lado direito da Equao (28) um termo de momento (Rumelhart, 1986; McClelland, 1988). (Eq. 38) Todavia, a modificao acima pode no ser suficiente para resolver o problema de oscilaes, para tomado fixo. Dessa forma, apareceram na literatura vrios trabalhos com propostas que objetivavam superar as dificuldades de convergncia no treinamento via backpropagation. De Souza Jr. (1993) se deteve longamente na reviso das vrias modificaes do mtodo por retropropagao, comparando-as e chegando a propor uma nova
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formulao (baseada no mtodo de Newton e na hessiana analtica). Desta forma, o leitor interessado numa lista mais ampla de mtodos poder consultar aquela referncia. Aqui ser apresentado apenas o mtodo largamente empregado do gradiente com direes conjugadas (Leonard, 1990), no qual e so ajustados dinamicamente. Neste mtodo, a direo de busca sK+1 na iterao k+1 gerada recursivamente como segue: (Eq. 39) (Eq. 40)
(Eq. 41)
onde o vetor de pesos WK+1 foi determinado usando-se uma busca unidimensional (interpolao quadrtica) para (Edgard, 1988): (Eq. 42) Este mtodo - ao fazer os ajustes automticos de e - pode eliminar as oscilaes do gradiente descendente com passo fixo, convergindo de forma mais confivel. Isto s custas de apenas uma pequena quantidade adicional de informao (o gradiente da iterao anterior) a ser armazenada (Edgard, 1988). Mtodo de treinamento para RNA do tipo RBF A camada escondida a mais importante na rede funo de bases radiais. Seus neurnios atendem a uma nica propriedade de ser simetricamente radial (Baughman, 1995). Baughman (1995), Haykin (1999), De Souza Jr. (2001) e Costa (2005) descreveram a sistemtica envolvida no treinamento de redes RBF, a qual apresentada na seqncia. As redes de bases radiais possuem trs camadas: uma camada de entrada linear, uma camada escondida no linear e uma camada de sada linear como pode ser visualizado na Figura 5.
Figura 5 - Representao esquemtica de uma rede neural de base radial, adaptado de Costa (2005).
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A camada de entrada possui N neurnios, onde N a dimenso do vetor de . entradas As conexes da camada de entrada, que no so ponderadas, conduzem os sinais de entrada para a camada escondida que possui L neurnios. So utilizadas funes gaussianas como funes de ativao da camada escondida (Equao 43).
(Eq. 43)
onde k=(1,2...,L). As funes de ativao (Equao 43) possuem centros, que so denominados c. Essas funes possuem um valor mximo em seus centros e decrescem monotonicamente com o aumento da distncia verificada em relao ao centro c. Assim, cada neurnio da camada escondida uma funo radial, ou seja, cada neurnio da camada escondida possui uma finita regio de ativao dada pela funo de ativao gaussiana descrita na Equao 43. Esta regio de ativao determinada em funo da distncia Euclidiana verificada entre o vetor de entradas x e o seu centro ck, ponderada pelo fator de escala designado pela constante . A Figura 6 apresenta o comportamento da funo de ativao gaussiana, considerando um valor fixo para o centro Ck do neurnio L da camada escondida e diferentes valores para o fator de escala . Figura 6 - Comportamento da funo de ativao gaussiana considerando um valor fixo para Ck e diferen-
tes valores para ck .
Os sinais que deixam a camada escondida so conduzidos camada de sada composta por M unidades de soma lineares. Cada conexo entre a camada escondida e a camada de sada possui um peso associado wkj. As RBF no utilizam nenhum valor de sada desejado para que se possa ajustar (treinar) as conexes da camada de entrada com a camada escondida. Para desenvolver a rede RBF, deve-se primeiro determinar os valores dos vetores de centros armazenados ck com elementos Cik=(i=l,...,N;k=1,...L) e a largura
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da funo gaussiana . Para obter o valor de centros armazenados ck utilizado o adaptive K-means clustering algorithm e para a largura da funo gaussiana, , utilizado o esquema P-nearest neighbor heuristic, que a raiz da distncia mdia dos quadrados (RMS) entre o centro do grupo ck e o centro dos P vizinhos mais prximos (ckp). A Equao 44 apresenta a forma do clculo. (Eq. 44) Uma vez estabelecidos os centros, os valores da matriz de pesos wk j so ajustados utilizando uma tcnica de regresso linear Pseudo-inversa (PI) - otimizao por mnimos quadrados, se os neurnios da camada de sada forem lineares, ou o mtodo backpropagation, se forem sigmoidais. A Equao 45 apresenta o clculo, na camada de sada, onde o fator peso wk j , entre a sada do neurnio da camada escondida ak e a camada de sada yj , treinada aps o procedimento de agrupamento K-means ter sido completado. Sendo k = (1,2,...L) e j = (1,2,...M) . (Eq. 45)
Onde representa a funo de transferncia de sada dos neurnios e os biases internos.
CONCLUSO Na literatura cientfica encontram-se propostos vrios modelos mecanicistas para aplicao em bioprocessos, cuja complexidade varia em funo das mudanas morfolgicas das clulas, das caractersticas reolgicas do caldo fermentativo e de inmeros outros fatores interferentes. Essa mudana de complexidade faz com os modelos variem, de uma forma geral, de no estruturados a estruturados e de no segredados a segregados. Tal fato impe o aumento do nvel de detalhamento do processo, implicando na insero de equaes para a descrio de rotas metablicas, de reaes intracelulares e das diversas variveis abiticas, exigindo, portanto, conhecimento mais aprofundado do sistema microbiano, muitas vezes no disponvel. Alm disso, o aumento do nmero de equaes invariavelmente eleva a quantidade de parmetros, por vezes de difcil estimao. Esses parmetros e outros termos esto inseridos em mais de uma equao, ocasionando o acoplamento destas. Assim, o excesso de parmetros provoca a super-parametrizao, conduzindo perda da significncia estatstica desses parmetros devido ao aumento da correlao na matriz de covarincia dos erros. Este evento, associado ao acoplamento do conjunto de equaes leva a dificuldade de convergncia, e no poucas vezes, a no convergncia para uma soluo com a acurcia desejada. Desta forma, relatado na literatura cientfica os bices para a elaborao de modelos mecanicistas simples com preciso suficiente para representar processos
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biotecnolgicos altamente dinmicos, de elevada complexidade e no linearidade, onde negligenciar a estrutura intracelular e a heterogeneidade celular resulta invariavelmente em insuficiente capacidade de predio dos mesmos. Contudo, discorre tambm sobre a adequao de modelos simples em produzir resultados com acurcia suficiente para alguns processos em estado estacionrio. Nesta condio, alternativas de tcnicas de modelagem so propostas, cada qual com suas vantagens e desvantagens, adequando-se segundo as caractersticas peculiares de cada processo. Deste modo, nesta segunda parte da reviso so tambm tratadas as RNA e, na terceira parte, abordam-se os modelos cibernticos e hbridos, selecionados dentre muitas outras disponveis. A rede neuronal artificial um mtodo de modelagem emprica e est inserida no campo da inteligncia artificial, usando processamento subsimblico como proposta de reproduo do mecanismo cognitivo por meio do reconhecimento de padres e caractersticas relevantes em um conjunto de dados. Devido a esta propriedade, talvez uma das principais vantagens das RNA seja a de no exigir o conhecimento explicito do fenmeno fsico, qumico, bioqumico e etc envolvido no processo, bastando-lhes apenas os dados experimentais para aprenderem relaes no lineares complexas implcitas. Essa peculiaridade auxilia em contornar a dificuldade em compreender a complexidade e no linearidade dos processos biotecnolgicos, tornando-as viveis para condies de comportamento pouco conhecido. Todavia, as redes apresentam desvantagens, dentre as quais a mais acentuada possa estar relacionada a sua inadequao para extrapolao, tornando-se imprecisas quando empregadas fora do domnio de seus dados histricos utilizados no treinamento. As RNA apresentam inmeras arquiteturas, que definem seu tipo e aplicao mais adequada. Dentre os tipos mais utilizados no universo da Engenharia Qumica tem-se: (a) perceptron multicamada (MLP), normalmente empregadas em problemas de regresso e de classificao; (b) funo de bases radiais (RBF), tipicamente empregadas em deteco de falhas e diagnstico e tambm para classificao; (c) redes lineares, podem ser empregadas em sistemas lineares ou linearizados; (d) redes bayesianas do tipo neuronais probabilstica (PNN) usadas somente para tarefas de classificao e as neuronais de regresso generalizada (GRNN) empregadas apenas para problemas de regresso; (e) redes de mapeamento auto organizvel, principalmente aplicadas para fins de classificao. Dadas as caractersticas especficas de cada mtodo abordado nesta parte da reviso, a literatura vasta em discorrer sob os melhores resultados na representao de processo biotecnolgicos quando as RNA so empregadas em comparao ao desempenho dos modelos mecanicistas. Contudo, frente filosofia de modelagem matemtica, deve-se recorrer aplicao mais simples, a qual resulte em predio dentro da significncia estatstica requerida. Logo, as duas ferramentas ora descritas apresentam-se como recursos disponveis e viveis, cabendo ao usurio definir a mais adequada frente complexidade do sistema a ser representado.
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Rua Ramon Franco, 26 - Urca - CEP 22290-290 - Rio de Janeiro - RJ Tel.: +55 21 3873 7700 http://www.frf.br
tambm preciso saber aplicar. No basta querer, preciso tambm saber fazer. Goethe
No basta saber,
FORTALEZA DE SO JOO
CONCEPO DA REVITALIZAO DO COMPLEXO DESPORTIVO
OBRAS A CARGO DA FUNDAO RICARDO FRANCO

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Revista Militar de

Vol. XXVIII - 3o Trimestre de 2011

ACETILCOLINESTERASE: ALZHEIMER E GUERRA QUMICA........................................................................................................... 03

COMBUSTVEIS DE AVIAO: PERSPECTIVAS E FUTURO ........................................... 15

LACTATO DESIDROGENASE COMO ALVO MOLECULAR PARA QUIMIOTERAPIA ANTIMALARIAL.................................................................................................................... 24

s materiais foram, so e continuaro a ser fun-

Publicao de Pesquisa e Desenvolvimento Cientfico-Tecnolgico Do Exrcito Brasileiro

ACETILCOLINESTERASE: ALZHEIMER E GUERRA QUMICA

Figura. 1. Esquema do processo de transmisso e controle nervoso nas sinapses.

Figura. 2. Hidrlise da ACh pela AChE.

Figura 3. Esquema simplificado do stio ativo da AChE de T. californicum..

Figura 4 Fisostigmina, primeiro frmaco usado no tratamento da DA.

Figura 5 Inibidores da AChE utilizados para o tratamento da doena da DA.

Figura 6 Exemplos de compostos OF neurotxicos.

Figura 7 Agentes neurotxicos de guerra mais comuns.

Figura 9 Estruturas da pralidoxima e da HI-6.

Figura 10 Esquema geral de reativao da AChE por oximas.

Figura 11 Processo de envelhecimento da AChE fosforilada.

Figura 12 Estruturas da atropina e do diazepam.

At o momento, nenhuma oxima apresentou resultados satisfatrios para re-

ENVELHECIMENTO DAS FIBRAS DE ARAMIDA UTILIZADA EM COLETES BALSTICOS NVEL III

A Fig. 1, ilustra o aspecto visual do colete de proteo balstica estudados.

Figura 3 Anlise de FTIR do fio de aramida degradado

LACTATO DESIDROGENASE COMO ALVO MOLECULAR PARA QUIMIOTERAPIA ANTIMALARIAL

Figura 2 Principais antimalariais quinolnicos e aril amino lcoois j desenvolvidos.

Figura 3 Inibidores do ciclo do folato utilizados como antimalariais.

Figura 4 Artemisinina e seus derivados aplicados na quimioterapia antimalarial.

Figura 5 Reao catalisada pela enzima LDH.

Figura 6 Representao estrutural do NADH e do APADH.

Figura 8 Representao estrutural geral de compostos baseados em azis.

Figura 9 Representao estrutural do cido oxmico.

UMA REVISO DE MODELAGEM MATEMTICA EM BIOPROCESSOS. PARTE I: FUNDAMENTOS BSICOS E CLASSIFICAO

48.178 328.379 812.104 1.430.334 2.003.090 2.329.247 2.652.298

Figura 5 Ciclo celular de brotamento em levedura. Adaptado de Nielsen (2003).

w (S,P) (S,P,Z) max

ak(x) c ck ckP cik E E Ep () pj i j k K+1 L L M nh ni nk nL N

Np p P s s sk sk+1 sp so spi,k Spj,k+1 Spj,L SpnL,L t tpl w w0 wk wk+1 wjik wkj x yj

j j,k+1 j,L j,k+1 pj,k+1 pj,L ji j k

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

(Veeramallu, 1990): A taxa especfica de produo: (Eq. 14)

Figura 3 - J-simo neurnio da camada k+1.

(Eq. 19) (Eq. 20)

Funo de ativao gausiana: (Eq. 23)

la-se - pela regra da cadeia - a derivada:

tes valores para ck .

Onde representa a funo de transferncia de sada dos neurnios e os biases internos.

OBRAS A CARGO DA FUNDAO RICARDO FRANCO

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