A R T I G O T C N I C O C I E N T F I C O

Imobilizao de Protenas do Veneno do Escorpio Tytius Serrulatus em Blenda Condutora de Polianilina-Poli(Metacrilato de Hidroxietila)
Lvio Bruno, Guilherme Barra, Herman Mansur, Rodrigo L. Orfice Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais, UFMG Resumo: Biossensores tm a funo de detectar e analisar tanto quantitativa como qualitativamente a presena de uma certa molcula em um determinado meio, isto com resposta em tempo real e sem etapas intermedirias de processo. Para isso, o biossensor possui sempre em seu conjunto um sistema de reconhecimento biolgico que o diferencia de qualquer outro tipo de sensor. O objetivo deste trabalho foi desenvolver hidrogis condutores a partir da combinao de polianilina com hidrogel poli(metacrilato de hidroxietila) e avaliar alguns aspectos associados possvel utilizao deste como base de um biossensor capaz de detectar a presena de fraes txicas do antgeno do veneno do escorpio Tytius Serrulatus. Hidrogis condutores foram sintetizados a partir da mistura, em diferentes propores, de polianilina e poli(metacrilato de hidroxietila) em um solvente comum. A condutividade eltrica (mtodo de quatro pontas), capacidade de inchamento e morfologia (microscopia eletrnica de varredura) foram avaliadas para blendas com diferentes composies. Antgenos relativos ao veneno do escorpio Tytius Serrulatus foram incorporados s blendas condutoras a partir do inchamento dos hidrogis por solues aquosas contendo as molculas de interesse. A imobilizao e bioatividade das biomacromolculas nos hidrogis foram constatadas atravs de ensaio imunoabsorvente ELISA cujos resultados foram avaliados por espectroscopia na regio do ultravioleta-vsivel. Os resultados mostraram que a incorporao de baixos contedos de Pani (20% em massa) em hidrogis de poli(metacrilato de hidroxietila) foi suficiente para a produo de materiais com elevada condutividade eltrica e grande capacidade de inchamento. Molculas associadas ao veneno do escorpio Tytius Serrulatus foram imobilizadas com sucesso nos hidrogis condutores e mantiveram suas capacidades funcionais. Palavras-chave: Biossensor, polianilina, blendas condutoras, escorpio. Proteins Associated with the Venom of the Tytius Serrulatus Scorpion Immobilized within Polyaniline-Poly(Hydroxyethyl Methacrylate) conducting blends Abstract: Biosensors can detect and analyze quantitatively and qualitatively the presence of a given molecule in a specific environment. Biosensors always have a biological recognition system that distinguishes them from any other kind of sensor. The goals of this work were to develop conductive hydrogels from the combination of polyaniline and poly(hydroxyethyl methacrylate) and to evaluate some important aspects related to the possibility of using these materials as matrices in biosensors that would detect toxic fractions of antigens associated with the venom of the Tytius Serrulatus scorpion. Different conductive blends from poly(hydroxyethyl methacrylate) and polyaniline were produced by dissolving the polymers in a common solvent. The electrical conductivity, morphology and swelling ability were measured the four-probe measuring system, scanning electron microscopy and weight gain in water, respectively. Immobilization and bioactivity of molecules associated with the venom of the Tytius Serrulatus scorpion were evaluated by combining the ELISA immunoassay method and ultraviolet-visible spectroscopy. The results showed that even low concentrations of polyaniline led to high values of electrical conductivity and swelling. The biological tests indicated that the immobilization and bioactivity of the biomacromolecules associated with the venom of the Tytius Serrulatus scorpion were successfully achieved within the conductive hydrogel. Keywords: Biosensor, polyaniline, conductive blends, scorpion.

Introduo
Um biossensor um aparato de deteco de molculas com caractersticas singulares. Ele possui uma estrutura dividida em trs partes como na Figura 1. A primeira responsvel pela deteco e formada por uma biomolcula com

suas funes biolgicas ativas imobilizada numa matriz que lhe serve de base fsica e proteo contra desnaturao. A segunda parte constituda de um transdutor de sinais que funciona como um estgio que interpreta os eventos biolgicos, ocorridos na etapa de deteco, e os transforma em sinais eletrnicos. A terceira parte diz respeito sada de dados

Autor para correspondncia: Rodrigo L. Orfice, Laboratrio de Engenharia de Polmeros e Compsitos, Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais, UFMG, Rua Esprito Santo 35/206, CEP: 30160-030, Belo Horizonte, MG. E-mail: rorefice@demet.ufmg.br

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Figura 1. Esquema de um biossensor segundo Caruso [1].

que modela os sinais eletrnicos do transdutor para os tornar legveis em uma interface humana qualquer como um medidor, um display ou tela de computador ou laptop. Apesar do biossensor no possuir ainda uma definio padro poderemos resumir todo o esquema supramencionado com a definio dada por CARUSO (1997): O consenso daqueles que trabalham no campo do biosensoriamento que o biossensor um aparato analtico que explora a deteco biolgica ou sistema de reconhecimento para a uma molcula ou biomolcula alvo, em conjuno com um transdutor fisico-qumico, que converte o evento de reconhecimento biolgico em um sinal de sada utilizvel[1]. Segundo LUPPA (2001) o imunossensor uma variao de um biossensor[2]. Nos ltimos anos, os biossensores foram propostos para participarem em uma srie de aplicaes em diversas reas. Pode-se citar algumas como: Diagnstico clnico - Hoje o diagnstico clnico depende da anlise bioqumica que passa por vrias etapas que podem ser eliminadas com o uso de biossensores, pois quanto mais cedo se identifica uma certa patologia mais fcil de trat-la. Os biossensores do diagnstico em tempo real. Monitoramento intensivo da sade Tal fato muito importante para pacientes que esto sob cuidados intensivos, e por isso a resposta imediata de qualquer variao do quadro clnico vital. Industria de alimentos - Para identificar qualquer tipo de contaminao no armazenamento e processamento necessria uma deteco precisa de agentes que possam ameaar a sade. Controle do meio ambiente - Os biossensores tambm so teis no monitoramento contra gases txicos perto ou dentro de indstrias que oferecem perigo ou mesmo ambientes suscetveis a grandes cargas de poluio urbana. No controle de infeces hospitalares e salas limpas Tanto em indstrias, como a de semicondutores, quanto em ambientes hospitalares o controle de partculas e agentes de infeco importante papel que pode ser desempenhado pelos biossensores. Defesa da populao civil Devido s ameaas de armas biolgicas e qumicas do terrorismo internacional, indispensvel agentes de deteco como os biossensores para a defesa da populao exposta a esse tipo de situao, como ocorreu recentemente com o bacillus antracis (Antrax) nos Estados Unidos. Em vista disso, em seu plano de combate ao terrorismo, o governo americano dispensou recentemente
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Figura 2. Monitoramento Eletrnico do acoplamento das molculas.

vrios milhes de dlares para pesquisa de formas de deteco destes tipos de arma, incluindo os biossensores. Um dos materiais que vem sendo testados na formulao de biossensores so as blendas formadas por polmeros condutores, que transmitem e amplificam sinais eletrnicos, combinados com outros que possuem boa afinidade com molculas biolgicas[3,4]. O objetivo principal proporcionar um stio favorvel a imobilizao de biomolculas sem que acontea a sua desnaturao fisiolgica. O segundo objetivo desempenhar a funo de transduo e emisso de dados. Na prtica, a proposta se resume em monitorar a mudana do potencial eletrnico que ocorre quando a biomolcula imobilizada se acopla ou reage com sua molcula especfica correspondente (analito), como numa ligao chave fechadura. A Figura 2 ilustra a essncia do processo. Nessa investigao, prope-se a verificao da capacidade da blenda condutora constituda pelos polmeros poli(metacrilato de hidroxietila) (PHEMA) e polianilina (Pani) em absorver e reter em sua estrutura a conjugao de protenas formadas pela frao txica do antgeno do veneno do escorpio Tytius Serrulatus bem como seu anticorpo correspondente. O objetivo dessa avaliao produzir um substrato condutor de eletricidade e imobilizador de biomolculas que servir de transdutor e elemento detector respectivamente para um futuro biossensor que vai medir a concentrao de veneno desse escorpio em um determinado meio. Um dispositivo como esse extremamente necessrio em vista das estatsticas das ocorrncias de picadas desse tipo de escorpio em Minas Gerais e em outras partes do Brasil. O Tytius Serrulatus responsvel por cerca de 10.000 casos anuais, notificados oficialmente nas zonas rurais, com taxa de mortalidade de 1,1%, na sua maioria de crianas[5]. At o momento, o mtodo usado para identificao deste tipo de veneno tem sido ensaios imunohistoqumicos[6]. Esses ensaios apresentam normalmente algumas dificuldades, como longo tempo de realizao e as muitas etapas de processo. O monitoramento eletrnico da interao entre antgeno e anticorpo relacionado a esse veneno favorecer o diagnstico rpido da picada desse escorpio. Isso facilita o tratamento do paciente ao identificar a quantidade de veneno bem como sua imunidade natural ao mesmo, permitindo a definio da dosagem da medicao a ser administrada. Tudo isso aumenta significativamente as chances de recuperao. A escolha a priori de blendas condutoras como base na formulao de biossensores se justifica pela potencial capaci157

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dade de combinar condutividade eltrica (oriunda dos polmeros condutores) com habilidade de interagir com solues aquosas contendo biomacromolculas (hidrogis). reportado em literatura que polmeros condutores[7], em geral, como a Pani, so potenciais ideais candidatos a participarem na formulao de biossensores [8]. Da mesma maneira, o PHEMA bastante utilizado como matriz para imobilizao de protenas[9]. Sendo um hidrogel, o PHEMA forma uma rede que encapsula em sua estrutura as biomolculas presentes na soluo em que est exposto atravs do fenmeno de inchamento. Alm disso, o inchamento do hidrogel disponibiliza stios contendo a biomolcula imobilizada, o que permite maior oportunidade para interao entre a molcula imobilizada e aquela que pretende ser detectada (aumento da sensibilidade de deteco). Neste trabalho, as duas caractersticas evidentes destes dois polmeros, isto , a boa capacidade de imobilizao e a possibilidade de transduo de sinal, foram consideradas para produzir uma blenda a qual ser base na formulao de um futuro biossensor.

Experimental
Sntese dos polmeros A polianilina foi sintetizada segundo o protocolo de McDiarmid et al[10]. Este mtodo consiste na obteno da polianilina, utilizando-se um excesso de anilina, onde a razo molar entre o agente oxidante, persulfato de amnio (APS) e a anilina (Ani) foi de 0,25. A anilina utilizada foi previamente destilada sob vcuo. O PHEMA foi sintetizado atravs da polimerizao radicalar do monmero 2-metacrilato de hidroxietila tendo como iniciador o 4,4Azo Bis (4 cido cianovalrico) (Aldrich) em etanol 95%. O meio da reao foi mantido 80 C por 90 minutos. Aps a sntese, o solvente foi retirado com vcuo dinmico. Sntese das blendas Os dois polmeros previamente sintetizados foram misturados em solvente comum, no caso o dimetil sulfxido (DMSO). A mistura em propores diferentes de Pani e PHEMA foi mantida a 80 C por 30 minutos e depois quantidades diferentes de agente reticulante diclohexil4,4 diisocianato (MDI) foram adicionadas mistura para criar as ligaes cruzadas. O agente reticulante MDI reage os grupos hidroxila do PHEMA formando ligaes cruzadas do tipo uretano entre as cadeias polimricas. A mistura foi vazada em placas de Teflon onde ocorreu a evaporao do solvente e a formao de filmes da blenda. Depois de secas, as blendas foram colocadas em uma soluo de 1M de HCl para a protonao. Imobilizao das protenas e ensaio ELISA As protenas, a serem imobilizadas nas blendas, foram dosadas em sua concentrao segundo o mtodo de Lowry[11]. Amostras de blendas, na forma de filmes com a massa em torno de 3,0 mg, foram expostas solues contendo fraes txi158

cas de antgenos relacionados com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus. Tais fraes do veneno, assim como os respectivos anticorpos, foram extrados, purificados e produzidos no Instituto de Cincias Biolgicas da UFMG [5]. As solues tinham as concentraes de 10g/mL para os anticorpos e 100ng/ml para as fraes do antgeno em soluo de tampo de incubao. Em cada uma das solues, as amostras obedeceram ao seguinte procedimento: imerso por uma hora em temperatura de 37 C e posteriormente overnight a 4 C. Aps cada imobilizao, as blendas foram exaustivamente lavadas em soluo de lavagem para eliminao de resduos que foram agregados com o procedimento anterior. Aps esse procedimento, as amostras foram submetidas ao imunoensaio ELISA. Esse ensaio consiste em expor a molcula imobilizada (antgeno) ao seu anticorpo para viabilizar uma ligao especfica entre os dois, tipo chave e fechadura. Depois disso, caracteriza-se esse bioevento com outro anticorpo marcado com uma peroxidase, que absorve na regio do visvel, e que por isso pode ser monitorada pela espectroscopia na regio do visvel. O ensaio ELISA foi feito segundo protocolo de Olrtegui[6]. Posteriormente, a intensidade dessa colorao, que revela a quantidade de ligaes, pde ser quantificada por uma espectroscopia na regio do ultravioleta-visvel. A Figura 3 mostra um desenho esquemtico de um ensaio ELISA.

Caracterizao
Ensaio de inchamento A estrutura em rede dos hidrogis de PHEMA tem como caracterstica reter grandes quantidades de gua ou fluidos biolgicos, provocando uma variao dimensional no material que denominado como inchamento. O inchamento (swelling) tem sido muito usado para imobilizar biomolculas sem danific-las. Depois de sintetizadas, as blendas secas foram

Figura 3. Esquema ilustrativo do imunoensaio ELISA sanduche no material (IgG = imunoglobulina G = anticorpo).

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pesadas aps serem mergulhadas por 24 horas em gua destilada. Antes do ensaio de inchamento, as amostras foram submetidas a um processo de extrao em gua visando a eliminao de eventuais resduos remanescentes da sntese dos polmeros. A estabilizao da massa durante a extrao foi usada como indicao da eliminao completa dos resduos no acoplados aos polmeros. Ensaio de condutividade Ensaios de condutividade foram feitos atravs do mtodo de quatro pontas. Para amostras de baixa resistividade foi usado o Eletrmetro Keithley 224 A, para alta resistividade foi empregado o Eletrmetro Keith 617. Amostras com diversas propores de Pani em PHEMA tiveram condutividade eltrica avaliada. Microscopia eletrnica de varredura A microscopia eletrnica de varredura (MEV) foi utilizada para investigar o grau de homogeneidade do material. importante observar que a Pani deve estar bem dispersa na mistura para fornecer valores elevados de condutividade eltrica. O equipamento utilizado foi o JSM5410 da JEOL . Todas as amostras foram observadas com um aumento de 2000X e, antes de serem observadas, foram metalizadas com uma fina camada de ouro. Foram observadas a superfcie natural dos materiais e tambm as regies de fratura geradas nas amostras. Espectroscopia na regio do ultravioleta-visvel para amostras slidas A espectroscopia na regio do ultravioleta-visvel foi usada para indicar a presena e bioatividade das protenas associadas ao veneno de escorpio ligadas na estrutura dos materiais. A comparao do material no submetido imobilizao de protenas e outro passando por esse procedimento e tambm pelo teste ELISA permite a princpio, acompanhar os processos de imobilizao das protenas na blenda e a interao antgeno-anticorpo.

Figura 4. Grfico da variao do inchamento de blendas Pani-PHEMA em relao porcentagem em massa de Pani, para um mesmo valor de agente reticulante (5%) presente no PHEMA.

Morfologia das blendas: microscopia eletrnica de varredura As fotomicrografias das Figura 5 e 6 mostram as superfcies natural e de fratura para blendas com diferentes contedos de Pani. O grau de homogeneidade de distribuio dos (A)

Resultados e Discusso
Ensaio de Inchamento A Figura 4 mostra os resultados dos ensaios de inchamento para blendas Pani-PHEMA com diferentes propores entre os polmeros. Este resultado demonstra que MDI se mostrou bem sucedido como agente reticulante do sistema, quando usado em uma concentrao igual a 5% em massa de PHEMA. A introduo progressiva de Pani no hidrogel de PHEMA reduziu significativamente os valores de inchamento, evidenciando a reduzida contribuio da Pani para a impregnao das blendas por fluidos aquosos. A combinao de Pani e PHEMA em um reticulado semi-interpenetrante permitiu alcanar valores elevados de inchamento que a priori podem favorecer uma mais eficiente interao entre polmeros e biomacromolculas, resultando numa maior eficincia de deteco para um eventual biossensor.
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(B)

Figura 5. Fotomicrografia da Blenda PHEMA 80%-Pani 20%. (A) Superfcie de fratura e (B) superfcie natural (2000 X).

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Tabela 1. Medidas de condutividade das amostras PHEMA puro, blenda PHEMA-Pani e Pani pura.

(A)

Pani.HCl (%) 0 5 10 20 40 50 100

Condutividade El trica (S/cm) 1.4 x 10-14 3.2 x10-5 4.4 x 10-5 1.4 x 10-3 1.0 x 10-3 2.2 x 10-2 3.2 x 10-2

(B)

mtodo de quatro pontas. O objetivo foi relacionar a condutividade com valores aceitveis de inchamento das blendas. Conforme pode ser observado pela Tabela 1, a blenda atinge um valor de condutividade eltrica prxima Pani reprotonada com HCl, para a concentrao de 50% em massa. O limiar de percolao das blendas foi calculado a partir da teoria de percolao, resumida na equao 1[12, 13]. (1) Onde c uma constante, t o expoente crtico, f a frao volumtrica do polmero condutor e fp corresponde a frao volumtrica do polmero condutor no limiar de percolao. Neste trabalho, o limiar de percolao foi expresso em termos da massa do polmero condutor (Pani). Com os resultados da Tabela 1 foi feita uma curva de log versus log (f fp). Os valores de fp e t foram respectivamente de 0,4 e 2,0, apresentando um coeficiente de correlao de 0,98. Segundo a teoria clssica da percolao, o expoente crtico (t) representa o nmero mdio de contatos por partcula na concentrao crtica e seu valor deve estar entre 1,5 e 2,0. O limiar de percolao deste sistema (0,4) pode ser considerado como um excelente resultado obtido quando comparado com a literatura [13, 14]. Espectroscopia na regio do ultravioleta-visvel: determinao da interao entre biomacromolculas e blendas condutoras Aps a imobilizao de antgenos relacionados com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus, foi usada a espectroscopia na regio do ultravioleta-visvel por reflexo para investigar o evento da imobilizao e bioatividade das biomolculas. Tais aspectos foram realados atravs do emprego do ensaio ELISA no qual se acopla, a um par antgeno-anticorpo, um segundo anticorpo marcado (o qual absorve na regio do visvel e assim pode ser facialmente detectado). As Figuras 7 e 8 mostram os espectros na regio do ultravioleta-visvel para o PHEMA puro (Figura 7) e para a blenda Pani-PHEMA com 20% em massa de Pani (Figura 8). Pode-se observar, na comparao dos espectros nas Figuras 7 e 8, que as amostras submetidas imobilizao (ensaio ELISA) tm alterao sensvel entre compriPolmeros: Cincia e Tecnologia, vol. 14, n 3, p. 156-161, 2004

Figura 6. Fotomicrografia da Blenda PHEMA 50%-PANI 50%. (A) Superfcie de fratura e (B) superfcie natural (2000 X).

componentes da blenda permite avaliar o nvel de interao entre os polmeros obtidos durante a sntese. Separao de fase em nveis macro ou microscpicos pode resultar em instabilidade dimensional e mecnica durante o inchamento da blenda em contato com solues aquosas contendo protenas. Alm disso, macro ou micro-segregaes entre os componentes da blenda podem resultar em reduzida condutividade eltrica, caso no haja conectividade entre os domnios ricos no polmero condutor (Pani). Os resultados de microscopia eletrnica de varredura mostraram que para as amostras com at 20% de Pani (Figura 5), e no aumento de 2000x, foi impossvel identificar os domnios ricos em PHEMA ou Pani, indicando um grau de homogeneidade elevado. Para composies acima de 25% de Pani, domnios ricos de Pani se tornam mais evidentes (pores mais escuras nas micrografias), sugerindo um processo de separao de fase mais severo. Ensaio de condutividade Medidas de condutividade eltrica da blenda para vrias propores de PHEMA e Pani foram realizadas usando o
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Figura 7. Espectro na regio do ultravioleta-visvel de PHEMA antes (a) e aps (b) imobilizao de protenas relacionadas com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus.

reticulante MDI se mostrou adequada para produo de redes semi-interpenetrantes entre os dois polmeros. A partir da variao das concentraes do agente reticulante e de Pani nas blendas foi possvel a produo de materiais com amplas faixa de condutividade eltrica e capacidade de inchamento, quando em soluo aquosa. A blenda com 20% em massa de Pani e 5% em massa de agente reticulante exibiu condutividade eltrica e capacidade de inchamento consideradas adequadas para viabilizar a combinao de dois aspectos essenciais para a eficincia de um biossensor: capacidade de interagir com macromolculas atravs do inchamento da matriz e elevada condutividade eltrica para permitir o monitoramento de eventos biolgicos. Protenas relacionadas com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus foram imobilizadas com sucesso em blendas Pani-PHEMA atravs do inchamento dessas em solues contendo as protenas. Antgenos associados ao veneno do escorpio mantiveram sua bioatividade mesmo aps imobilizao, como demonstrado a partir da interao especfica deste antgeno com o seu anticorpo. Assim sendo, a blenda formada pela combinao de PHEMA e Pani apresenta uma srie de aspectos favorveis que motivam o teste desses materiais como base na formulao de um biossensor, capaz, por exemplo, de ser usada na deteco e quantificao de antgenos relacionados com o veneno de escorpio.

Agradecimentos
Figura 8. Espectro na regio do ultravioleta-visvel da blenda PHEMA20%Pani antes (a) e aps (b) imobilizao de protenas relacionadas com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus.

Os autores agradecem ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa.

mentos de onda 200 e 250 nm, regio esta na qual absorvem vrios grupamentos qumicos presentes em aminocidos como tiol, amina, aromticos, entre outros. Fica, assim, indicada a presena de protenas (antgenos e anticorpos) imobilizadas nos materiais associadas ao veneno do escorpio Tytius Serrulatus. Na regio de comprimento de onda entre 300 e 400 nm, que a regio na qual o anticorpo marcado com peroxidade (ensaio ELISA) absorve, houve tambm notvel alterao nos espectros antes e aps a imobilizao tanto para o PHEMA puro (Figura 7), como para blenda Pani-PHEMA (Figura 8). Tais resultados mostram que no s a imobilizao como tambm a ligao especfica antgeno-anticorpo, relacionados com o veneno do escorpio Tytius Serrulatus, foram alcanadas com sucesso. Assim, no foi notada alterao na bioatividade de antgenos relacionados com o veneno de escorpio, quando da imobilizao destes nos polmeros, demonstrando que os materiais testados e o processo de imobilizao usado permitem a confeco de substratos aptos a incorporarem sem danificao as protenas relacionadas com veneno do escorpio Tytius Serrulatus.

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Concluses
Blendas polimricas baseadas na combinao de polianilina e poli(metacrilato de hidroxietila) foram sintetizadas com composies variando entre 0 a 100% de Pani. A utilizao de agente
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Enviado: 03/11/03 Reenviado: 25/03/04 Aprovado: 23/04/04

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