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Criopreservao do smen equino: uma reviso

Cryopreservation of equine semen: a review G.C. Oliveira1, B.M.M. Oliveira, E.C.C. Celeghini, C.B. Fernandes, C.B. Mattos
Departamento de Reproduo Animal, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, SP, Brasil. 1 Correspondncia: guilhermecain@hotmail.com

Resumo A criopreservao de smen equino tem se difundido cada vez em territrio nacional. Os processos de congelao e descongelao levam a efeitos deletrios sobre o espermatozoide, diminuindo sua taxa de motilidade e vigor e, consequentemente, influenciando sua morfologia. Estudos vm sendo realizados em busca do melhor crioprotetor ou associao de crioprotetores para minimizar os danos sofridos sobre os espermatozoides equinos. Nesta reviso de literatura, foram explorados aspectos fundamentais para a criopreservao do smen equino, com nfase para choque trmico, composio de membrana plasmtica, efeitos da congelao de diluidores e, principalmente, de crioprotetores. Palavras-chave: criopreservao, choque trmico, equino. Abstract Cryopreservation of equine semen is becoming more widespread in the country, but the process of freezing and thawing leads some deleterious effects on sperm, thereby decreasing its rate of motility and strength, that influences in the morphology of sperm. Therefore, studies are being conducted looking for the best cryoprotectant or combination of cryoprotectants to minimize the damage on sperm horses. In this literature review were explored key aspects for the cryopreservation of equine semen, highlighting the issues, thermal shock, the composition of the plasma membrane, effects of freezing extenders, mainly cryoprotectants. Keywords: cryopreservation, equine, heat-shock. Introduo A inseminao artificial, biotecnia da reproduo mais importante e mais utilizada para melhoramento gentico animal, teve incio em 1957 com a primeira gestao equina gerada por espermatozoides criopreservados (Pickett e Amann, 1993). Essa tcnica tem grande aplicao por necessitar de poucos machos selecionados para a produo de espermatozoides para a inseminao de centenas de fmeas por ano, por diminuir a transmisso de patgenos via coito, por exigir menos do garanho e por facilitar a reproduo pela facilidade de transporte do smen equino para diferentes regies do pas, sem a necessidade de transportar a gua, possibilitando melhor aproveitamento de garanhes geneticamente superiores. Em 225 ciclos, durante trs temporadas, por meio da inseminao com smen fresco (78,7%), Mattos e Cavalheiro (1988) obtiveram taxa de prenhez superior obtida mediante monta natural (65,3%). Amann e Pickett. (1987), no entanto, verificaram que a inseminao com o smen congelado proporcionou taxa de prenhez 75% inferior s obtidas com o smen fresco. Alguns estudos comprovam que a utilizao de smen fresco ou resfriado tem taxa de fertilidade maior se comparados com o smen congelado. Isso devido ao processo de criopreservao, que possui alguns efeitos deletrios sobre os espermatozoides. Para melhorar a taxa de prenhez, utiliza-se uma concentrao maior de espermatozoides, que seria de 300 a 500 x 106 de espermatozoides totais, ou seja, cinco a oito palhetas descongeladas por inseminao artificial, maximizando, assim, a utilizao do smen congelado e minimizando os efeitos deletrios da criopreservao, o que cada vez mais vem aumentando os ndices de fertilidade na reproduo animal (Squires et al., 1999). Os meios utilizados para a diluio do smen para a criopreservao so compostos por substncias que atuam contra os efeitos deletrios das oscilaes da temperatura; em geral, utilizam-se gema de ovo, leite desnatado, acares, eletrlitos e glicerol em diferentes concentraes. Para melhor proteo do espermatozoide, so adicionados aos diluidores alguns tipos de crioprotetores que diminuem os efeitos agressivos da congelao e descongelao, como o glicerol, que vem sendo muito utilizado devido aos resultados positivos demonstrados. Porm, sua utilizao deve ser ponderada, pois pesquisas recentes demonstram toxicidade, o que reduz a taxa de fertilidade da inseminao.

_________________________________________ Recebido: 27 de julho de 2010 Aceito: 15 de janeiro de 2013

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Este trabalho relata a importncia da criopreservao do smen equino, enfatizando os agentes crioprotetores. Aspectos fundamentais para a criopreservao do smen equino Para que o espermatozoide fecunde o ovcito, so necessrios, pelo menos, alguns atributos aps o descongelamento, como metabolismo do espermatozoide para a sua produo de energia, motilidade progressiva, enzimas acrossomais ntegras, que so de extrema importncia para a penetrao do ovcito, e protenas de membrana plasmtica, fundamentais para a sobrevivncia do espermatozoide no trato reprodutivo feminino.(Pickett e Amann, 1993). A fim de que a criopreservao do smen equino seja bem-sucedida, essencial a interao do crioprotetor, do diluidor, da curva de resfriamento e do aquecimento no processo de criopreservao. Se for realizada de maneira correta, a criopreservao minimiza os efeitos deletrios, como o choque trmico, a formao de cristais de gelo e a desidratao celular (Jasko, 1994). Choque trmico Consideram-se choque trmico as mudanas que ocorrem nos espermatozoides quando so rapidamente resfriados da temperatura corporal para a temperatura de zero grau (Jasko, 1994). O choque trmico pode provocar alguns danos irreversveis aos espermatozoides, como movimentos anormais, circulares, para trs, rpida perda da motilidade, danos ao acrossoma e membrana plasmtica, o que levaria a um aumento de permeabilidade, perda de componentes intracelulares e reduo do metabolismo (Graham, 1996). Esses danos acontecem na fase de transio e ocorrem na membrana plasmtica na passagem do seu estado lquido para seu estado cristalino, ou seja, fase de gel. Devido ao resfriamento, ocorrem mudanas na forma estrutural das molculas de fosfolipdeos, as quais impossibilitam a movimentao aleatria dessas protenas, resultando em aumento de permeabilidade da membrana e decrscimo da atividade metablica (Amann e Pickett, 1987). O choque trmico sentido de forma diferente em cada espermatozoide de cada animal. Depende do grau de maturao do espermatozoide, da espcie do animal, da variao individual, da quantidade de plasma seminal, dentre outros fatores (Watson, 1981). Algumas espcies, como o touro, com maior proporo de colesterol, ou seja, com mais fosfolipdeos na membrana plasmtica, so mais resistentes a mudanas bruscas nas temperaturas, se comparadas espcie equina (Watson, 1981). Para que ocorra um menor dano possvel no espermatozoide, recomenda-se realizar o resfriamento lento do smen diludo at quatro graus, com queda de 0,5C por minuto at chegar a quatros graus. Outra maneira a adio de protenas do leite ou gema de ovo nos diluidores de smen (Jasko, 1994). Composio da membrana plasmtica A membrana plasmtica composta por uma dupla camada lipdica, que contm fosfolipdeos, colesterol, glicolipdeos e diferentes tipos de protenas (Ollivier e Gall, 1993). Os fosfolipdeos esto dispostos de duas maneiras, sendo a mais externa hidroflica, e a interna hidrofbica. Suas protenas so divididas em perifricas e integrais. As protenas perifricas so facilmente removidas, solveis no smen e na gua. As protenas integrais no so removidas com facilidade da membrana plasmtica, precisando de solventes ou detergentes para serem removidas (Watson, 1981). O transporte de molculas para dentro da membrana plasmtica ocorre atravs de poros ou canais formados pelas protenas. Em regies da membrana em que no h poros ou canais, o transporte de molculas pouco ou nulo. Na fase de resfriamento, pode ocorrer um desarranjo na conformao da membrana plasmtica, levando a uma desorganizao nas cadeias de fosfolipdeos e protenas, resultando, assim, numa passagem rpida de molculas pela membrana, que passariam de uma forma lenta (Amann e Pickett, 1987). A membrana plasmtica fluida temperatura corporal. Sua fluidez a capacidade de movimentao lateral de seus fosfolipdeos. Alguns fatores podem alterar a fluidez e flexibilidade de membrana, como o resfriamento (Amann e Pickett, 1987). Efeitos da congelao A maior dificuldade de resistncia celular s mudanas de temperatura ocorre na zona intermediria, que vai de 15 graus positivos at 60 graus negativos. Esse processo ocorre duas vezes, fazendo com que a clula passe por esse estresse trmico tanto na fase de congelao quanto na de descongelao (Mazur, 1984). Quando uma soluo com crioprotetor chega temperatura entre cinco graus negativos e 15 graus negativos, ela entra na zona de formao de cristais de gelo, levando formao de cristais no diluidor, o que resulta em um aumento da concentrao de soluto extracelular. Esta alta concentrao faz a gua intracelular se

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mover para o meio extracelular, provocando a desidratao da clula (Mazur, 1984; Amann e Pickett, 1987). Existem alguns tipos de curva de congelao, entre elas a curva de congelao lenta, em que ocorre a desidratao completa do espermatozoide, impedindo, assim, a formao de cristais de gelo intracelular, porm altas concentraes de soluto podem gerar leses nas clulas. A curva de congelao rpida evita que ocorra uma desidratao correta da clula, formando, assim, cristais de gelo intracelular, sendo prejudicial clula (Watson, 1995). Sempre que preconizada uma curva de congelao, ser escolhida uma curva de descongelao subsequentemente. Caso o smen seja congelado por meio de uma curva de congelao lenta, dever ser descongelado da mesma forma, para que haja tempo de o espermatozoide se reidratar. Porm, se for utilizada uma curva de congelao rpida, a descongelao dever ser rpida, evitando o fenmeno da recristalizao (Leibo e Bradley, 1999). Diluidores de congelao Para haver uma melhor resposta e proteo dos espermatozoides, so adicionados alguns tipos de extensores e diluidores de smen logo aps sua colheita. Esses diluidores e extensores, para melhor agirem sobre os espermatozoides, so devidamente aquecidos a uma temperatura de 37C, similar temperatura dos rgos sexuais, dando um conforto trmico ao espermatozoide. A diluio feita em proporo 1:1, quando uma parte de smen corresponde a uma parte de diluidor ou extensor (Oliveira et al., 2010). Para que o extensor seja ideal, deve respeitar a osmolaridade e o pH ideal do espermatozoide, de 350 mOsmol/L e 6,7 a 6,9, respectivamente. Porm, os extensores variam de 300 a 400 mOosmol/L, e seu pH varia de 6,7 a 7,2. Esses fatores influenciam diretamente em uma maior sobrevivncia do espermatozoide (Blanchard et al., 2003). Alm da osmolaridade e do pH similar ao do smen, tambm fundamental equilibrar os elementos mineirais e substncias que neutralizam produtos txicos, como antibiticos, e conferir uma proteo ao choque trmico (Amann e Pickett, 1987; Brinsko e Varner, 1992). Outros componentes do diluidor podem incluir EDTA, detergentes e tampo. O EDTA se liga aos ons de clcio e, assim, impede que o clcio extracelular penetre no espermatozoide e danifique a clula durante o choque trmico (Watson, 1981). Os detergentes solubilizam os lipdeos da gema do ovo e as lipoprotenas, intensificando as interaes entre os componentes e a membrana plasmtica (Pickett e Amann, 1993). Os diluidores mais utilizados nos equinos so aqueles cuja base contm leite desnatado ou gema de ovo. Sua base rica em lipoprotenas, geralmente presentes no leite, e tem a capacidade de estabilizar elementos proteicos da membrana do espermatozoide. Essa estabilizao fundamental nos processos de congelao e descongelao (Watson, 1981). Crioprotetores da congelao Os crioprotetores podem ser divididos em duas classes: crioprotetores penetrantes e no penetrantes. Os penetrantes so aqueles que tm a capacidade de atravessar a membrana plasmtica do espermatozoide devido a seu pequeno tamanho molecular, atuando, assim, nos meios intracelular e extracelular. So eles o glicerol, o propilenoglicol, o etilenoglicol, a acetamida e outras amidas, o 1,2 propanodiol e o dimetilsulfxido. Os no penetrantes, por sua vez, no tm a capacidade de atravessar a membrana plasmtica devido ao seu maior tamanho molecular. So eles: as protenas que podem estar presentes no leite e na gema de ovo, os acares, como lactose, manose, frutose, rafinose e trealose, os polmeros sintticos, como polivinilpirrolidona e metilcelulose (Amann e Pickett, 1987). Glicerol O glicerol considerado quimicamente um lcool que contm trs grupos funcionais de hidroxilas, os quais podem aceitar um grupo de hidrognio da molcula de gua em seis stios diferentes. Na espcie equina, o crioprotetor mais utilizado o glicerol, apesar do grau de toxicidade que oferece clula, podendo comprometer a fertilidade. Esse crioprotetor provoca estresse osmtico, mudanas na organizao, na fluidez e na permeabilidade da membrana e mudanas em sua composio lipdica. Porm, estudos recentes comprovam que no foram encontrados crioproterores mais eficientes que o glicerol na crioproteo (Amann e Pickett, 1987). Keith et al. (2000), ao testar diversos crioprotetores, entre eles o glicerol e a dimetilformamida, observaram que os espermatozoides conservados em glicerol apresentavam maior porcentagem de motilidade total e progressiva. Segundo McKinnon (1996), os crioprotetores penetrantes tm a capacidade de funcionar com soluto e solvente, como o glicerol, que acaba alterando a presso osmtica tanto do espermatozoide como do diluidor. Os crioprotetores solveis, como o glicerol, funcionam como solventes com ponto de congelamento mais baixo que o da gua, o que permite a formao de canais de diluidores descongelados, nos quais se encontram os espermatozoides. O glicerol um crioprotetor permeante e seu maior efeito favorvel extracelular, porm esse

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crioprotetor penetra e reside na membrana celular e no citoplasma. Juntamente ao efeito osmtico nas clulas, exerce um efeito direto na membrana plasmtica, ligando-se diretamente aos fosfolipdeos da membrana, reduzindo, assim, sua fluidez e interferindo na sua permeabilidade. Segundo alguns autores, sua concentrao pode variar 3,5 a 5% nos diluidores de smen equino (Cochran et al., 1984). Mtodos convencionais de congelao em palhetas de 0,25 mL ou 0,5 mL tm utilizado quantidades de 7% de glicerol como tima concentrao para diluidores base de gema de ovo (De Leew et al., 1993). Dimetilformamida As amidas so formadas por trs pontos de ligao ao hidrognio, portanto trs ligaes a menos que o glicerol. Elas so menos viscosas e menos solveis em gua se comparadas ao glicerol, o que leva menor permeabilidade da membrana. Essa caracterstica favorvel no ponto de vista da criopreservao, pois diminui a possibilidade de danos celulares por estresse osmtico (Ball e Vo, 2001). De acordo com Keith (1998), as acetamidas ou formamidas adicionadas ao radical metil tm maior efeito crioprotetor para as clulas do que as que no tm esse radical. A dimetilformamida vem cada vez mais se mostrando eficiente para a criopreservao de tecidos vivos, melhorando os processos de vitrificao e stabilizao em gua, superando o glicerol (Baudot e Boutron, 1998). Estudos recentes relatam que a dimetilformamida protege as clulas espermticas do garanho frente aos efeitos deletrios do processo de criopreservao (Medeiros, 2003). A prtica desse diluente na criopreservao de smen de garanhes vem sendo empregada cada vez mais, devido aos bons resultados obtidos. Segundo Keith (1998), foram comparados alguns tipos de amidas, como formamida, metilformamida, dimetilformamida, acetamida, metilacetamida, com o glicerol, sendo utilizada na criopreservao do smen equino essa comparao. A metilformamida obteve resultados melhores se comparada aos outros, sendo superior em relao ao glicerol para motilidade total e motilidade no tempo zero. Aps 20 minutos de descongelamento, a metilformamida obteve resultados melhores que o glicerol na motilidade total, na motilidade progressiva e na preservao da viabilidade celular determinada pelas sondas (Keith, 1998). Segundo Alvarenga (2003), o DMSO (dimetilsulfxido) tem sido menos eficiente se comparado com o glicerol, a dimetilformamida e o etilenoglicol nos parmetros de motilidade total e progressiva dos espermatozoides. De acordo com Graham (2000), uma menor eficcia nos tratamentos que utilizam os crioprotetores acetamida, metilacetamida, formamida, metilformamida e dimetilformamida se comparados aos que fazem uso do glicerol, pois a motilidade aps descongelao foi inferior. Ambos os pesquisadores testaram a ao da metilformamida e da dimetilformamida em concentraes maiores, comparando-as com etilenoglicol e glicerol e obtiveram um melhor resultado com a dimetilformamida em relao aos outros tratamentos para a motilidade. Etilenoglicol O etilenoglicol considerado um lcool que possui quatro pares de eltrons isolados, os quais podem ligar a mais eltrons isolados. Os tomos de hidrognio podem ligar aos quatros stios e posteriormente doar dois desses tomos (Keith, 1998). O etilenoglicol pode realizar ligaes de hidrognio na membrana do espermatozoide (Kundu, 2000). Mercante et al. (1995) testaram a eficcia do etilenoglicol comparada com a do glicerol como crioprotetores de espermatozoides equinos. A concentrao utilizada de crioprotetor em cada tratamento foi de 5% em meio diluidor base de EDTA-lactose-gema de ovo. Aps anlise microscpica de motilidade e vigor do smen congelado, no foram observadas grandes diferenas estatsticas entre o glicerol e o etilenoglicol, apesar de ser observada uma melhor tendncia para o etilenoglicol tanto em questo de motilidade quanto de vigor. Neves et al. (1995) avaliaram o percentual de gestaes obtidas pela inseminao artificial com smen congelado utilizando glicerol e etilenoglicol como crioprotetores. O etilenoglicol teve um percentual de gestao maior que o glicerol, porm no houve uma diferena estatstica significativa. Arruda (2000) avaliou a substituio do glicerol pelo etilenoglicol como o agente de criopreservao de smen equino e concluiu que o glicerol e o etilenoglicol tm as mesmas propriedades crioprotetoras, pois no se observou uma grande diferena estatstica entre ambos. Alvarenga (2003) utilizou concentraes de etilenoglicol e concentraes de etilenoglicol mais glicerol em meio diluidor EDTA-lactose-gema de ovo com diferentes concentraes de crioprotetores, a fim de avaliar a integridade da membrana espermtica antes e aps a criopreservao. A motilidade espermtica foi maior com o tratamento que utilizou etilenoglicol a 5%, no entanto os autores concluram que o etilenoglicol possui atividade crioprotetora similar ao glicerol. Chenier (1998) relatou que no houve diferena significativa quando comparados os crioprotetores glicerol, dimetilsulfxido (DMSO) e etilenoglicol para o congelamento do smen de equinos, apesar de o DMSO apresentar uma pequena vantagem ps-descongelao dos espermatozoides equinos. Ao se comparar o

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etilenoglicol com o glicerol e o DMSO, foi observado que o etilenoglicol faz com que ocorra uma diminuio na motilidade progressiva ps-descongelao dos espermatozoides equinos. Oliveira et al. (2010) relataram que no houve diferena estatstica significativa quando comparados os crioprotetores glicerol, dimetilformamida, etilenoglicol. Porm, quando associados, foi observado um bom protocolo de tratamento para criopreservao. Consideraes finais A criopreservao de smen equino vem crescendo devido facilidade de transporte e armazenamento do material gentico de garanhes por longo perodo de tempo. Com isso, consegue-se um melhor aproveitamento gentico de animais de grandes valores econmicos e zootcnicos. Todavia, cada animal tem uma pequena variao na composio da membrana plasmtica, podendo ter uma camada maior de colesterol e cidos graxos, deixando-o mais resistente ao processo de criopreservao. J alguns animais no tm a mesma habilidade de resistir aos danos da congelao. Por isso de grande importncia ressaltar os diferentes tipos de protocolos de crioprotetores, diluidores e curva de congelao utilizados na criopreservao, para que se adeque cada protocolo para cada individuo. A fim de que ocorra a fertilizao do ovcito, extremamente necessrio que ocorra a manuteno da membrana plasmtica, que pode ser lesada durante o processo de criopreservao, mudando sua fluidez, permitindo a entrada de molculas que normalmente no entrariam, levando, assim, morte celular. O grande sucesso dessa tcnica est em conhecer bem os diferentes tipos de protocolos e saber utilizlos para cada individuo de forma isolada. Referncias Alvarenga MA. The use of alternative cryoprotectors for freezing stallion semen. In: Workshop on Transportings Gameter and Embryos, 2003, Brewster, Mass. Proceedings New York, NY: Havemeyer Foundation, 2003. p.74-76. Amann RP, Pickett BW. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. J Equine Vet Sci, v.7, p.145-173, 1987. Arruda RP. Avaliao dos efeitos de diluidores e crioprotetores para o espermatozoide equino pelo uso de microscopia de epifluorescncia, citometria de fluxo, anlises computadorizadas da motilidade (CASA) e da morfometria (ASMA). 2000. Dissertao (Livre Docncia) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade So Paulo, So Paulo, SP, 2000. Ball BA, Vo A. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectants on equine sperm motility, viability and membrane potential. J Androl, v.22, p.1061, 2001. Baudot A, Boutron P. Glass-forming tendency and stability of aqueous solutions of dietilformamide and dimetilformamide. Cryobiology, v.37, p.187-199, 1998. Blanchard TL, Varner DD, Schumacher J, Love CC, Brinsko SP, Rigby SL. Semen preservation. In: Manual of equine reproduction. 2.ed. Philadelphia, PA: Elsevier-Mosby, 2003. p.165-177. Brinsko SP, Varner DD. Artificial insemination and preservation of semen. In: Blanchard TL, Varner DD. Stallion management. Vet Clin North Am Equine Pract, v.8, p.205-218, 1992. Chenier T. Evaluation of cryoprotective agents for use in the cryopreservation of equine spermatozoa. In: Proceedings for Annual Meeting, Society for Theriogenology, 1998, Baltimore, MD. Proceedings St Louis, MS: Society for Theriogenology, 1998. p.52-53. Cochran JD, Amann RP, Froman DP. Effects of centrifugation, glycerol level, cooling to 5C, freezing rate and thawing rate on the post-thaw motility of equine sperm. Theriogenology, v.22, p.25-38, 1984. Cottorello ACP, Henry M, Ferreira MKV, Juliani GC. Efeito da associao do etilenoglicol ao glicerol na criopreservao de smen equino. Rev Bras Reprod Anim, v.25, p.456-457, 2001. De Leeuw FE, De Leeuw AM, Den Daas JH, Colenbrander B, Verkleij AJ. Effects of various cryoprotective agents and membrane-stabilizing compounds on bull sperm membrane integrity after cooling and freezing. Cryobiology, v.30,p.32-34,1993. Graham JK. Cryoservetion of stallion spermatozoa. Vet Clin North Am Equine Pract, v.12, p.131-147, 1996. Graham JK. Evaluation of alternative cryoprotectans for preserving stallion spermatozoa. In: International Confress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, 2000, 14, Stockholm. Proceedings... Stockholm: ICAR, 2000. p.307. Resumo. Jasko DP. Procedures for cooling and freezing of equine semen. Ars Vet, v.10, p.156-165,1994. Keith SL. Evaluation of new cryoprotectants for the preservation of equine spermatozoa. J. Reprod. Fertil. Suppl., v.62, p.1056-1065,1998. Keith SL, Squires EL, Graham JK, Brinsko SP. Evaluation of cryprotectants for the preservation of equine spermatozoa. Colorado: CDU, 2000. Online. Disponvel em: http://www.cvmbs.colostate.edu/phisio/abstract/ els5.html. Acesso em: 24 ago. 2000.

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