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INTRODUO

A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais usado nas investigaes biolgicas e fisico-qumicas. O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visvel. A gua absorve fortemente na regio do infravermelho. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas dependem das estruturas das molculas, e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma substncia, parte da energia absorvida (absorbncia): a energia radiante no pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substncias se deve a absoro (transmitncia) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. A fotometria o ramo da ptica que se preocupa em medir a luz, em termos de como seu brilho percebido pelo olho humano. Aquela se diferencia da radiometria, que a cincia que mede a luz em termos de sua potncia absoluta, por descrever a potncia radiante associada a um dado comprimento de onda usando a funo de luminosidade modeladora da sensibilidade do olho humano ao brilho. A fotometria tambm utilizada na astronomia, na observao de estrelas, pela percepo da diminuio da luz por elas emitida. Atravs de estudos e clculos, possvel descobrir novos planetas e saber informaes como rotao, translao, distncia da estrela e satlites. Neste trabalho, trataremos dos mtodos analticos baseados na absoro de radiao eletromagntica. A luz tem radiaes para as quais a vista humana sensvel, e as ondas com comprimento de onda diversos provocam sensaes de cores diferentes; uma mistura apropriada da luz, com estes comprimentos de onda, constitui a luz branca.

MTODOS FOTOMTRICOS De acordo com o senso comum, quanto mais cromforo (substncia que absorve luz)

uma soluo tiver, mais escura ela ser. Todo dia inferimos a quantidade de caf pela aparncia do cafezinho! No incio, a fotometria utilizou exatamente este instrumento, ou seja, o olho humano, para determinar a concentrao de substncias cromforas. Para facilitar esta tarefa, uma vez que o nosso olho no um equipamento absoluto, usou-se cores ou concentraes padres com os quais a soluo em anlise poderia ser comparada. A preciso deste mtodo, porm, no era adequada devido s propriedades da viso e tambm do componente subjetivo, que sempre que possvel deve ser eliminado na quantificao. O advento de equipamentos capazes de quantificar a luz permitiu que a quantidade de ftons pudesse ser medida, permitindo uma quantificao muito mais precisa. Antes de abordar os aparelhos responsveis pelas medidas fotomtricas, importante discutir um pouco as bases tericas que permitem a aplicao da absoro da luz como mtodo quantitativo. 2.1 LUZ A luz uma onda eletromagntica, isto , possui dois componentes, um componente eltrico e outro magntico, posicionados a um ngulo de 90 um em relao ao outro. Todo movimento oscilatrio possui um comprimento de onda, que a distncia entre dois mximos de onda(HARRIS, 2005). Na Figura 1 podemos ver uma onda com um comprimento de 360 e outro de 200 nm. A amplitude da onda ( neste exemplo de 1,0 e 0,6) representa a intensidade da mesma.

Figura 1 Amplitude da onda Fonte: http://www.chemkeys.com

Uma outra propriedade muito importante das ondas que elas podem interagir umas com as outras. No exemplo da figura 1, as duas ondas na realidade se somam para produzir a onda marcado com SOMA. Este efeito de soma das ondas particularmente importante no que se refere interferncia entre ondas, que, quando defasadas em p se anulam completamente (interferncia destrutiva) e quando no possurem defasagem (ou obviamente defasagem de 360, 720 ...) se somam (interferncia construtiva). Basta lembrar que a diferena entre uma luz normal e um laser a interferncia, que construtiva neste e tanto construtiva como destrutiva naquele. O comprimento de onda (l) se relaciona com as outras propriedades das ondas atravs das seguintes equaes:

E=h

c a velocidade da luz no vcuo (~ 3 x 108 m s-1), n a frequncia em s-1, E a energia em Joules e h a constante de Plank (6,6 x 10-34 J s). Estas duas equaes indicam que tanto a frequncia como a energia inversamente proporcional ao comprimento de onda. Desta forma, ondas mais energticas tem um menor e uma frequncia maior. As ondas eletromagnticas, dependendo da sua energia, possuem caractersticas diferentes, principalmente no que se refere a sua interao com a matria, sendo utilizados para os mais diversos fins. importante salientar que as propriedades de ondas eletromagnticas (i. e. velocidade, interferncia) permanecem inalteradas por todo o espectro de energia. A Figura 2 mostra o espectro de ondas eletromagnticas, que vo desde um l de quilmetros at fentometros (10-15). As ondas eletromagnticas que podem ser detectadas por nossos olhos, isto , o visvel, Ocupam uma pequena faixa de todo o espectro. Dentro do visvel, como bem sabemos, existem vrias cores, que nada mais so do que ondas com diferentes s. As energias, as frequncias e os comprimentos de onda das cores so mostradas na Tabela-1.

Figura 2 - Ondas eletromagnticas de diferentes energias. Fonte: www.quimlab.com.br/produtos

Cor Ultravioleta (UV) Violeta Azul Azul-esverdeado Verde-Azulado Verde Prpura Verde-amarelado Amarelo Alarajado Vermelho Infravermelho (IV)

Cor Complementar Verde-amarelado Amarelo Alaranjado Vermelho Violeta Azul Azul-esverdeado Verde-azulado

/nm <380 380-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-650 650-780 > 780

/(1014 Hz) 7,89 7,89-6,90 6,90-6,25 6,25-6,12 6,12-6,00 6,00- 5,36 5,36-5,17 5,17-5,04 5,04-4,62 4,62-3,85 3,85

Tabela 1 - Energias, as frequncias e os comprimentos de onda das cores Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

2.2

INTERAO DA LUZ COM A MATRIA Radiaes eletromagnticas interagem com a matria de muitas formas. Como

trataremos somente das radiaes no visvel e das radiaes com energias prximas a este, como o UV e o IV, sero analisadas somente as interaes que as radiaes eletromagnticas desta faixa de energia produzem. Para podermos compreender a interao da luz com a matria necessrio fazer uma rpida reviso sobre a constituio da matria. Como todos sabemos, os tomos e portanto as molculas, so constitudas por um ncleo (prtons + nutrons) e por eltrons. As energias das radiaes eletromagnticas na faixa do visvel no possuem energia suficiente para alterar os ncleos , podendo alterar somente as distribuies eletrnicas dos tomos e das molculas. interessante lembrar que os eltrons so distribudos em orbitais preenchidos segundo as regras de distribuio eletrnica de Pauling. Um tomo ou molcula possui orbitais ocupados e orbitais no ocupados. No estado fundamental os eltrons se distribuem de forma a minimizar a energia. Existe, porm, a possibilidade de ocupao de orbitais mais energticos, se for proporcionada uma certa quantidade de energia(SKOOG, 2002). Isto pode acontecer quando um fton de luz atingir um tomo ou molcula como visto na Figura 3.

Figura 3. Orbitais eletrnicos e a absoro e emisso de luz Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

Este eltron no estado excitado tender a voltar para o estado fundamental, o que geralmente ocorre por um caminho tortuoso, na qual o eltron passa para um estado metaestvel, emitindo com isso energia trmica, e deste estado volta ao estado fundamental, emitindo luz. Este eltron no estado excitado tender a voltar para o estado fundamental, o que geralmente ocorre por um caminho tortuoso, na qual o eltron passa para um estado metaestvel, emitindo com isso energia trmica, e deste estado volta ao estado fundamental, emitindo luz. Esta emisso de luz classificada como fluorescncia quando a emisso cessa logo aps a extino da excitao e fosforescncia quando a emisso espontnea continua por perodos de tempo mais elevados (at mesmo horas, mas caracteristicamente segundos ou fraes de segundos). Uma caracterstica muito importante a que deve ser considerada quando se leva em considerao estas transies energticas entre orbitais a quantizao. As transies s ocorrem quando a energia fornecida pela radiao igual energia de transio entre os dois orbitais, sendo que tanto energias inferiores como superiores so incapazes de produzir a transio eletrnica (SKOOG, 2002).

Figura 4. Espectro de absoro de vrios pigmentos fotossintticos. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

As transies energticas que ocorrem em um tomo ou molcula podem ser determinadas atravs de um espectro de absorbncia, que a medio da quantidade de luz absorvida em vrios s, como visto na Figura 4. interessante ressaltar que justamente nestas transies eletrnicas que est o motivo do mundo colorido que vivenciamos. Vejamos o caso da clorofila, que como todos sabemos responsvel pelo maravilhoso verde das matas, possui uma forte absoro na regio do azul e do vermelho. Isto significa dizer que quando olhamos para uma folha, estamos recebendo em nossos olhos a luz filtrada, isto , a luz branca (que possui todos os s) subtrados do azul e do vermelho (Figura 4), fazendo com que somente o que no for absorvido seja captado pelos nossos olhos, isto , o verde ( = 530). Da mesma forma, todas as coloraes que vemos so resultado da absoro seletiva de algum l, restando a cor. Neste ponto interessante filosofar que pode ter havido uma presso seletiva durante a evoluo dos rgos responsveis pela deteco da luz (leia-se olhos) para que fossem detectadas justamente os s entre 400 e 700nm pois esta regio riqussima em transies observadas na natureza, trazendo desta forma uma quantidade de informaes imensa (muito provavelmente o mundo em diferentes do visvel seja bastante cinza ou montono - isto , contm muito menos informao). 3 FOTOMETRIA Fotometria a medida da luz proveniente de um objeto. At o fim da Idade Mdia, o meio mais importante de observao astronmica era o olho humano, ajudado por vrios aparatos mecnicos para medir a posio dos corpos celestes. Depois veio a inveno do telescpio, no comeo do sculo XVII, e as observaes astronmicas de Galileo. A fotografia astronmica iniciou no fim do sculo XIX e durante as ltimas dcadas muitos tipos de detectores eletrnicos so usados para estudar a radiao electromagntica do espao. Todo o espectro electromagntico, desde a radiao gama at as ondas de rdio so atualmente usadas para observaes astronmicas. Apesar de que observaes com satlites, bales e espaonaves podem ser feitas fora da atmosfera, a grande maioria das observaes obtida da superfcie da Terra. Como a maioria das observaes utiliza radiao electromagntica, e podemos obter informaes

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sobre a natureza fsica da fonte estudando a distribuio de energia desta radiao, introduziremos alguns conceitos para a caracterizao desta radiao.

comprimento de onda freqncia c 300 000 km/s velocidade da luz

Localizao no espectro: A radiao visvel vai aproximadamente de 3900 (violeta) at cerca 7800 (vermelho). Cor violeta azul verde amarelo laranja vermelho Comprimento de onda () Freqncia (1012 Hz) 3900 - 4550 4550 - 4920 4920 - 5770 5770 - 5970 5970 - 6220 6220 - 7800 659 - 769 610 - 659 520 - 610 503 - 520 482 - 503 384 482

Tabela 2 - Freqncias e comprimentos de onda para vrias cores, no vcuo. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

Como as cores so subjetivas, pois dependem da sensibilidade de cada olho humano, a definio um pouco arbitrria. 3.1 TRANSMITNCIA Se passarmos um feixe de luz de intensidade conhecida (Io) atravs de uma amostra e medirmos a intensidade da luz que emergiu, podemos calcular a transmitncia (T) desta amostra da seguinte forma: T = I / Io , isto , a razo de luz que atravessa a amostra.

Figura 5. Transmitncia Fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica

LEI DE LAMBERT-BEER

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Para que esta diminuio na intensidade da radiao possa ser utilizada para a determinao da concentrao de um cromforo, necessrio relacionar estas duas grandezas, o que realizado pela lei de Lambert-Beer. Primeiramente necessrio esclarecer que a luz atravessa um caminho ptico no qual se encontram uma certa quantidade de molculas do cromforo, sendo que somente uma parte destas podem interagir de forma adequada com a luz para que esta possa ser absorvida. Importante mencionar aqui que a quantidade de cromforos que interagem com a luz neste caminho ptico proporcional concentrao do cromforo na cubeta (recipiente no qual passa a luz). Uma teoria que pretende relacionar a concentrao de um cromforo com a quantidade de luz absorvida deve levar em considerao que cada interao adequada da luz com o cromforo diminui a intensidade do feixe de luz4 numa quantidade infinitesimal dP, no qual P a intensidade radiante e d uma quantidade infinitesimal. Esta reduo na intensidade radiante proporcional concentrao do cromforo e intensidade do feixe de luz1. Podemos ento escrever a equao como sendo: dP C P db (1) dP = -k C P db (2)

No qual db representa uma quantidade infinitesimal do caminho ptico percorrido (o necessrio para encontrar um cromforo pronto para absorver um fton), k a constante de proporcionalidade e o sinal negativo significa que a intensidade da luz est diminuindo. Bem, mas o que interessa a quantidade de luz absorvida ao longo de um certo caminho ptico de, por exemplo, 1 cm e no infinitesimal. Para chegarmos equao que descreve isto, devemos somar as d Ps em todos os d bs, o que matematicamente conseguido com a integrao, o que fornece: ln P/P0 = - k b C considerando que, ln = log2,303: -log P = k b C P0 2,303

E finalmente considerando que P/P0 = T e k/2,303 = . temos:

1

Quanto mais concentrado e quanto mais ftons tiver, maior a probabilidade de haver um choque fton cromforo.

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A = b C sendo que A= -log T

Nesta equao, que denominada de Lambert-Beer, o e (epsilon) a absortividade molar, uma constante dependente do , do cromforo, do solvente e da temperatura. Um e elevado significa uma grande capacidade de um cromforo absorver luz de um certo em determinadas condies. Por exemplo, o e da clorofila em 480nm um dos mais elevados da natureza, o que condiz com a sua utilizao como captadora de luz para a fotossntese (ALCANTARA, 2009).

Figura 6 - Lei de Lambert-Beer Fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica

Como mostrado na Figura 6, a lei de Lambert-Beer fornece um traado grfico de A x [C]. Em forma de reta enquanto que a transmitncia fornece uma curva descendente, quando a abscissas a concentrao do cromforo ([C]). Neste grfico a inclinao da reta fornece o valor de e b, ou seja, um grfico de A x [C] pode ser utilizado para o clculo do absortividade molar. importante mencionar que a lei de Lambert-Beer somente se aplica quando as seguintes consideraes forem obedecidas: a) a radiao incidente deve ser monocromtica, isto , possuir somente um ; e b) os centros absorventes devem atuar independentemente uns dos outros no processo de absoro. Tambm necessrio destacar que quanto maior o e mais precisa ser a determinao, o que significa dizer que o l mais adequado para a determinao da concentrao de um cromforo atravs da lei de Lambert-Beer o de absorbncia mais intensa, ou seja, o pico de absorbncia. 4.1 DETERMINAES SIMULTNEAS

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Dois ou mais cromforos podem ser quantificados independentemente quando presentes em uma mistura (VOGEL, 1985). Para que isto seja possvel necessrio que algumas condies sejam satisfeitas: o cromforo A deve possuir pelo menos um pico de absorbncia no qual a absorbncia do cromforo B seja negligencivel e vice-versa. A Figura 7 mostra a absorbncia de dois compostos separadamente e somados. Neste caso o pico de 670nm seria melhor para a deteco do composto A e o pico de 530nm para o composto B. Embora seja aconselhvel escolher o pico de maior e para a determinao da concentrao de um composto, neste caso o pico de 670nm indicado pois ele no sofre a interferncia do espectro de absoro do composto B. importante mencionar que, como a absoro total a soma da absoro dos diversos componentes, possvel at fazer uma determinao simultnea quando os dois espectros se sobrepem completamente, contanto que se conhea os espectros isolados e os s de cada pico.

Figura 7 - Determinao simultnea em uma mistura de dois cromforos Fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica

4.2

DESVIOS NA LEI DE LAMBERT-BEER Como abordado anteriormente, a Lei de Lambert-Beer somente se aplica quanto os

centros absorventes no interagem uns com os outros. Isto obviamente s conseguido em concentraes muito pequenas. Em termos prticos, as concentraes limites at as quais esta lei obedecida situam-se na faixa de 10-2 M para a maioria dos compostos. At estas concentraes as molculas (centros absorventes) interagem predominantemente com o solvente. Em concentraes superiores, iniciam-se interaes tambm entre as molculas do soluto (cromforo), fazendo com que o e o de certos picos de absorbncia sejam alterados2. Lembrem-se de que certo espectro com os seus respectivos s caracterstico
2

blue ou red shift - deslocamento para o azul ou vermelho (HARRIS, 2005).

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daquela substncia em um determinado solvente. Em concentraes muito altas, as interaes entre as molculas do soluto se tornam to elevadas que predominam sobre as interaes solvente-soluto, fazendo com que o prprio soluto aja como solvente, produzindo alteraes na absorbncia. Outra fonte de erro pode ser o ndice de refrao, que pode aumentar significativamente em solues concentradas, desviando parte da luz e diminuindo a intensidade detectada. Na Figura 6 pode-se ver o desvio da lei de Lambert-Beer na curva A*. O equipamento de deteco tambm pode representar uma fonte de erro, principalmente em concentraes muito baixas ou muito elevadas, nas quais a intensidade de luz transmitida muito prxima ou muito distante, respectivamente, da intensidade do feixe que no passa pela amostra, fazendo com que as comparaes se tornem muito menos precisas. 4.3 FLUORESCNCIA A fluorescncia devido emisso de luz aps uma excitao, sendo que aquela sempre acontece em s maiores do que esta. A fluorescncia possui vrias vantagens em relao absorbncia, entre as quais pode-se destacar a maior sensibilidade, a maior seletividade e a maior dependncia do meio circundante. A sensibilidade da fluorescncia aproximadamente 2 ordens logartmicas maior do que a absorbncia. Quanto seletividade interessante mencionar que um composto fluorescente geralmente possui mais de um espectro de emisso, cada qual para um certo de excitao, fazendo com que este mtodo tambm seja melhor do que a absorbncia para a determinao qualitativa do composto. Alm destas vantagens, a fluorescncia extremamente sensvel ao meio em que se encontra o composto. Existem vrias substncias que suprimem a emisso de fluorescncia (quencher) dentre os quais se pode citar o O2. Isto pode ser utilizado para detectar, por exemplo, se um grupo fluorescente est em contato com o meio ou est protegido dele (na parte interna de uma protena, por exemplo). Esta tcnica bastante utilizada no auxlio da determinao de estruturas de protenas usando o aminocido triptofano como grupo fluorescente.

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4.4

MTODOS FOTOMTRICOS NA ANLIZE QUALITATIVA Como discutido anteriormente, o espectro uma caracterstica de uma certa substncia

em um certo solvente. Obviamente isto pode ser utilizado para a anlise qualitativa, o que geralmente acontece por comparao, isto , se compara o espectro de um composto desconhecido com espectros de padres. O espectro de absoro fornece algumas informaes sobre a natureza do composto. A absoro na faixa do visvel e do IV geralmente indica ligaes duplas conjugadas para compostos orgnicos e complexos de metais de transio no caso de compostos inorgnicos. Um exemplo interessante de utilizao da absorbncia a determinao se o DNA est na forma de simples ou dupla fita. As bases do DNA absorvem na faixa do UV, em torno de 260 nm, sendo que esta absoro aumentada quando a dupla hlice separada, fazendo com que a absorbncia neste seja um bom mtodo para a determinao da conformao do DNA. 4.5 MTODOS FOTOMTRICOS NA ANLIZE QUANTITATIVA O principal uso dos mtodos fotomtricos na quantificao de substncias. Em anexo se encontra um protocolo que mostra como que estes mtodos podem ser utilizados para a determinao da concentrao de um cromforo, a partir de solues com concentraes conhecidas ou ento com a utilizao da constante e para as condies nas quais se est fazendo a determinao. Na construo de uma curva de calibrao importante utilizar todas as condies nas quais se encontra a amostra cuja concentrao se deseja determinar3.

ESPECTROFOTOMETRIA

Pequenas alteraes no solvente, pH ou fora inica podem produzir alteraes nas propriedades dos cromforos.

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Este , indubitavelmente, o mtodo mais exato para a determinao da concentrao de substncias em soluo. Mas os instrumentos so mais dispendiosos do que os que foram descritos anteriormente. Um espectrofotmetro pode ser considerado como um fotmetro fotoeltrico de filtro refinado que permite o uso de faixas de luz aproximadamente monocromticas continuamente varivel. As partes essenciais de um espectrofotmetro so uma fonte de energia radiante, um monocromador, um dispositivo para o isolamento de luz monocromtica, mais exatamente, faixas estreitas de energia radiante da fonte de luz, clulas de vidro ou de slica feixes de energia radiante que passam atravs do solvente ou da soluo. A variao da cor de um sistema, com a modificao da concentrao de um certo componente, constitui a base do que os qumicos denominam anlise colorimtrica. A cor provocada pela formao de um composto corado, resultante da adio de um reagente apropriado, ou pode ser intrnseca ao constituinte analisado. A intensidade da cor pode ser comparada com a que se obtm pelo tratamento idntico de uma quantidade conhecida da substncia. De acordo com HARRIS, a colorimetria visa a determinar a concentrao de uma substncia pela medida da absoro relativa de luz, tomando como referncia absoro da substncia numa concentrao conhecida. Na colorimetria visual usa-se, em geral, como fonte de luz, uma fonte natural ou artificial de luz branca. As de terminaes so feitas num instrumento simples, denominado colormetro, ou comparador de cores. Quando a vista for substituda por uma fotoeltrica4, o instrumento um colormetro fotoeltrico. Neste instrumento emprega-se a luz que est numa banda estreita de comprimentos de onda, que se consegue pela passagem da luz atravs de filtros, isto , de materiais coloridos na forma de placas de vidro, ou de gelatina, etc., que s transmitem a luz numa regio espectral limitada. O instrumento chamado, s vezes, "fotmetro de filtro". Na anlise espectrofotomtrica a fonte de radiao emite at a regio ultravioleta do espectro. Desta radiao selecionam-se comprimentos de onda definidos que constituem bandas, com largura menor que 1nm. Este procedimento necessita de um instrumento mais complicado, e por isso mais caro. O instrumento um espectrofotmetro. Um espectrmetro tico um instrumento que dispe de um sistema tico que pode provocar a disperso da radiao eletromagntica incidente, e com o qual se podem fazer medidas da radiao transmitida num certo comprimento de onda da faixa espectral. Um
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O que elimina em grande parte os erros devidos s caractersticas pessoais de cada observador.

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fotmetro destina-se a medir a intensidade da radiao transmitida ou uma funo desta intensidade. Um espectrmetro e um fotmetro, combinados num espectrofotmetro, podem gerar um sinal que corresponde diferena entre a radiao transmitida por um material tomado como referncia e a radiao transmitida pela amostra analisada, num certo comprimento de onda. A principal vantagem dos mtodos colorimtricos e espectrofotomtricos, a de proporcionarem um meio simples para determinar quantidades diminutas de substncias. O limite superior dos mtodos colorimtricos , em geral, a determinao dos constituintes que esto presentes em quantidades relativas inferiores a 1 ou 2%. A sensibilidade pode ser, no entanto, aumentada mediante a tcnica da espectrofotometria derivada. O desenvolvimento de colormetros fotoeltricos de baixo custo colocou ao alcance de qualquer instituio de ensino pequena este ramo da anlise qumica instrumental. Cor Ultravioleta Violeta Azul Verde Comprimento de onda (nm) <400 400-450 450-500 500-570 Cor Amarelo Alaranjado Vermelho Infravermelho Comprimento de onda (nm) 570-590 590-620 620-760 >760

Tabela 3 - Comprimento de onda aproximado das cores Fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica

Figura 8 - Comprimento de onda aproximado das cores Fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica

Na tabela 3 esto as faixas de comprimento de onda aproximados que correspondem s diferentes cores. A percepo visual das cores provocada pela absoro seletiva, por um objeto corado, de certos comprimentos de onda da luz incidente. Os outros comprimentos de onda ou so refletidos ou so transmitidos, de acordo com a natureza do objeto, e so percebidos pela vista como a luz do objeto. Se um corpo slido opaco tem a aparncia de

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branco, todos os comprimentos de onda so igualmente refletidos; se o corpo parece negro, a reflexo de luz de qualquer comprimento de onda muito pequena. Se um corpo parece azul, so refletidos os comprimentos de onda que correspondem ao estmulo do azul, e assim sucessivamente5. Na figura abaixo aparecem os limites aproximados do comprimento de onda e o conjunto de radiaes pode ser considerado o espectro eletromagntico (excluindo-se, como claro, as ondas acsticas). Percebe-se, no espectro, que os raios y e os raios X tm comprimentos de onda muito curtos, enquanto a radiao ultravioleta, a radiao visvel, a radiao infravermelha, e as ondas de rdio tm comprimentos de onda sucessivamente maiores. Na colorimetria e na espectrofotometria, a regio visvel e a regio ultravioleta que lhe adjacente so da maior importncia.

Figura 9 - Espectro eletromagntico Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

As ondas eletromagnticas so usualmente descritas em termos (a) do comprimento de onda (distncia entre os picos sucessivos em cm, a menos de explicitao de outra unidade), (b) do nmero de onda v (nmero de ondas por cm) e (c) da freqncia v (nmero de ondas por segundo). As trs grandezas esto relacionadas como segue: Para a adoo integral das unidades SI estas funes deveriam ser calculadas com o metro como umidade bsica. , no entanto, ainda a prtica comum usar o centmetro. 5.1 TIPOS DE ESPECTROFOTOMETRIA

Deve-se acentuar que a faixa de radiao eletromagntica estende-se muito alm da regio visvel.

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5.1.1 Espectrofotometria astronmica Os astrnomos utilizam redes de difrao para estudar o espectro de energia da radiao eletromagntica dos astros coletada nos telescpios. A rede de difrao o artefato que substitui o antigo prisma ptico na pesquisa cientfica. Sua qualidade se mede pelo poder de separao de duas linhas de absoro ou de emisso do espectro eletromagntico de uma estrela, isto , pela sua resoluo espectral.

5.1.2 Espectrofotometria de absoro atmica o mtodo de anlise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presena de metais. O mtodo consiste em determinar a presena e quantidade de um determinado metal em uma soluo qualquer, usando como princpio a absoro de radiao ultravioleta por parte dos eltrons que, ao sofrerem um salto quntico depois de devidamente excitados por uma chama de gs acetileno a 3000 graus celsius, esses devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de orgem. A energia devolvida na forma de um fton de luz, por sua vez, absorve a radiao ultravioleta emitida pela fonte especfica (ctodo co) do elemento qumico em questo. Dessa forma, eltrons que esto contidos na soluo, e que sofrem tambm um salto quntico e que no pertencem ao mesmo elemento que constitui o ctodo co que est sendo usado no momento, no sero capazes de causar uma interferncia, isso porque eles absorvero apenas radiao com comprimento de onda referente ao elemento qumico do qual fazem parte. 5.1.3 Espectrofotometria no Infra-vermelho Os compostos orgnicos tambm absorvem radiaes na regio do infravermelho (IV) do espectro . A radiao infravermelha no tem energia suficiente para excitar os eltrons e provocar transies eletrnicas, mas ela faz com que os tomos ou grupos de tomos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligaes covalentes que os unem. Estas vibraes so quantizadas e, quando ocorrem, os compostos absorvem energia IV em certas regies do espectro. Nas vibraes, as ligaes covalentes comportam-se como se fossem pequenas molas unindo os tomos. Quando os tomos vibram, s podem oscilar com

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certas frequncias, e as ligaes sofrem vrias deformaes. Quando a ligao absorve energia, ela sofre alteraes e, ao retornar ao estado original, libera essa energia, que ento detectada pelo espectrmetro. As molculas podem vibrar de muitos modos. Dois tomos unidos por uma ligao covalente podem efetuar vibraes de estiramento dessa ligao, como se fosse uma mola que estica e retorna ao tamanho original. Trs tomos tambm podem efetuar diferentes vibraes de estiramento e alterao dos ngulos de ligao, em vrios planos do espao. No entanto, as vibraes de estiramento so as mais importantes. A radiao infravermelha outra espcie de radiao eletromagntica cujo espectro comea num dos limites do espectro da luz (o vermelho) e se estende at zona das ondas hertzianas (radar, televiso, rdio). caracterizada por um comprimento de onda compreendido entre cerca de 800 e 105 nm. Nas molculas, os tomos e os grupos atmicos esto em contnuo movimento, uns em relao aos outros (vibraes moleculares). Quando elas so sujeitas a radiao com energia semelhante correspondente a essas vibraes (radiao infravermelha), as molculas podem alterar o seu estado de vibrao (excitao), absorvendo a radiao correspondente diferena de energia entre o estado inicial e o estado excitado. Como no possvel a uma molcula vibrar de qualquer modo, mas apenas de alguns modos, a absoro da radiao ocorre apenas para determinados valores da energia, valores estes que so caractersticos das molculas. Assim, atravs da comparao dos valores de energia da radiao infravermelha para os quais h absoro, possvel identificar as molculas ou os tipos de molculas presentes nas amostras. A espectrofotometria infravermelho prximo oferece um mtodo rpido de anlise qumica que fornece, em segundos, resultados de mltiplas propriedades em amostras no preparadas. Usos e aplicaes: A espectroscopia no infravermelho largamente usada tanto na indstria quanto na pesquisa cientfica pois ela uma tcnica rpida e confivel para medidas, controle de qualidade e anlises dinmicas. Os instrumentos agora so pequenos, e podem ser transportados, mesmo para medidas de campo. Com a crescente tecnologia em filtragem computacional e manipulao de resultados, agora as amostras em soluo podem ser medidas com preciso (a gua produz uma banda larga de absorbncia na faixa de interesse, o que daria um espectro ilegvel sem esse tratamento computacional). Algumas mquinas at mesmo diro automaticamente que substncia est sendo analisada a partir de milhares de espectros de referncia armazenados na memria. Medindo-se a uma freqncia especfica ao

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longo do tempo, mudanas no carter ou na quantidade de uma ligao em particular podem ser medidas, isso especialmente til na medida do grau de polimerizao na manufatura de polmeros. As mquinas modernas podem tirar medidas na faixa de interesse freqentemente, como 32 vezes por segundo. Isso pode ser feito enquanto se fazem medidas simultneas com outras tcnicas. Isso faz com que as observaes de reaes qumicas sejam processadas mais rapidamente, de forma mais precisa e mais exata. 5.2 EQUIPAMENTO Os equipamentos mais utilizados nos mtodos fotomtricos. 5.2.1 Espectrofotmetro A Figura 9 mostra um esquema de um espectrofotmetro, com os seus principais componentes numerados de 1 a 5, sendo 1 - fonte, 2 - prisma para seleo do l, 3 - fenda, 4 cubeta com a amostra e 5 - detector produzindo o resultado final.

Figura 10 Esquema de um espectrofotmetro Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

Figura 11 Espectrofotmetro Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

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Os espectrofotmetros modernos geralmente utilizam feixes duplos produzidos atravs de espelhos semitransparentes, sendo que um feixe passa atravs da amostra enquanto o outro feixe no, e a comparao entre a intensidade destes dois feixes produz a leitura final do equipamento. Isto elimina problemas como flutuaes na fonte, diferente deteco para diferentes ls, etc. 5.2.2 Fonte A fonte de energia eletromagntica precisa fornecer radiao estvel e com intensidade razoavelmente constante por toda a faixa de l na qual se pretende usar. Devido a essas exigncias, geralmente utiliza-se um lmpada para a regio do visvel e do IV e outra lmpada para o UV. A fonte de radiao visvel e IV mais utilizada a lmpada incandescente de tungstnio, que devido a sua alta temperatura (2600-3000C) fornece uma radiao razoavelmente constante entre 350 a 2500 nm. No caso da radiao UV, as fontes mais utilizadas so as lmpadas fluorescentes de hidrognio e hlio, que fornecem radiaes com l de 180 a 350 nm. 5.2.3 Seleo do Comprimento de Onda (l) Uma das premissas da lei de Lambert-Beer a luz monocromtica, isto , que tenha somente um determinado , que precisa ser selecionado do vasto espectro geralmente fornecido pela fonte. A seleo do pode ser realizado de vrias formas. Nos fotocolormetros, esta seleo se d atravs do uso de filtros, que nada mais so do que vidros coloridos. Obviamente as cores destes vidros foram cuidadosamente escolhidas para que estes permitam a passagem de um especfico. Na realidade a seleo do usando-se filtros geralmente consegue uma preciso de somente alguns nm, ou seja, consegue selecionar uma faixa de s em vez de um especfico. Nos espectrofotmetros utilizam-se geralmente prismas ou grades de difrao para uma seleo mais precisa do . Diferentes s viajam com velocidades diferentes atravs da matria, sendo que s menores sofrem mais difrao do que s maiores.

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Usando-se um prisma mvel juntamente com lentes adequadas e uma fenda se consegue selecionar s com a preciso de at nm. Outra forma de seleo do l o uso de uma grade de difrao, que nada mais do que uma superfcie irregular que consegue refletir a luz. A interferncia desta luz refletida fornece um espectro, do qual se pode selecionar os s de forma semelhante ao descrito para o prisma.

Figura 12 - Prisma (la > lb) Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

5.2.4

Fendas e lentes Existem nos espectrofotmetros vrias lentes e fendas, que tem como objetivo colimar

e selecionar os feixes de luz apropriados. 5.2.5 Cubeta A caracterstica fundamental da cubeta que ela seja transparente radiao. No caso da radiao UV utiliza-se quartzo ou slica fundida enquanto que na regio do visvel podem ser utilizados materiais mais baratos como o vidro ou plsticos. Geralmente as cubetas possuem um caminho ptico (espessura) de um centmetro, tamanho padronizado na lei de Lambert-Beer. Sempre bom lembrar que estas cubas devem ser rigorosamente limpadas para que sujeiras ou mesmo a gordura dos dedos no interfira na leitura. conveniente que as cubetas sejam regularmente limpas com agentes oxidantes como por exemplo soluo sulfocrmica para retirar qualquer trao de sujeira.

5.2.6 Detectores Existem vrias formas de se detectar ondas eletromagnticas, sendo que todas esto baseadas na converso da energia radiante em energia eltrica, que podem ento ser

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detectados por um equipamento convencional. Os trs tipos diferentes de detectores mais utilizados. As clulas fotovoltaicas baseiam-se na gerao de fora eletromotriz quando se ilumina uma placa metlica recoberta com uma camada de material semicondutor como o selnio e o xido de cobre. As clulas fotovoltaicas so utilizadas principalmente no caso de uma iluminao alta, pois a amplificao deste tipo de clula difcil de ser conseguida. As clulas fotoeltricas tem como princpio o efeito fotoeltrico, que consiste na liberao de um eltron de uma superfcie (geralmente constituda de xidos alcalinos) quando um fton de luz visvel ou UV atingir a placa. Estes eltrons liberados podem ser captados por um nodo, o que produzir uma corrente eltrica detectvel. Uma modificao das clulas fotoeltricas, denominados fotomultiplicadores, (Figura 11) utilizam a emisso induzida por ftons e eltrons para amplificar o sinal. O fton bate na primeira placa e 2 a 5 eltrons secundrios so emitidos, que so atrados pela placa seguinte (dodo) atravs de uma voltagem de aproximadamente + 90V. Cada qual destes eltrons podem por sua vez produzir 2 a 5 outros 12 eltrons e assim sucessivamente. Com a utilizao de 9 a 16 dodos, cada qual com uma voltagem de +90 V em relao ao anterior, pode se conseguir uma amplificao de at 108, considerando- se que cada passo tenha um fator multiplicador de 4,5. Desta forma possvel detectar uma quantidade nfima de luz. Devido a sua alta sensibilidade, os tubos fotomultiplicadores no podem ser utilizados para intensidades de luz muito elevadas.

Figura 13 Fotomultiplicador Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

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Figura 14 Tubo fotomultiplicador Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

Figura 15 Funcionamento do arranjo de diodos Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

Figura 16 Esquema ptico de um espectrofotmetro Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki

5.2.7

Fluormetro A diferena bsica no fluormetro a geometria da deteco da luz, que se localiza a

um ngulo de 90 em relao fonte. Este desenho geomtrico utilizado no intuito de maximizar a deteco da fluorescncia e minimizar a deteco da luz referente transmitncia. Outra diferena fundamental a presena de um segundo sistema de seleo de l aps a passagem da luz pela amostra, possibilitando desta forma a escolha do l de emisso, alm obviamente, do l da excitao.

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CONCLUSO Ondas eletromagnticas, como o luz, fornecem inmeras informaes sobre a fonte que a produziu e tambm sobre o caminho percorrido, isto , as interaes sofridas com a matria ao longo do caminho. Para ilustrar isto interessante mencionar que a fonte de informao mais poderosa sobre a constituio do universo vem da luz, que vem ao nosso encontro das estrelas mais distantes. Esta luz possui as bandas caractersticas dos componentes dos quais as estrelas so formadas e desta forma possvel determinar a

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concentrao dos componentes presentes nas estrelas. Se voltarmos um telescpio para uma estrela distante alguns bilhes de anos luz, estaremos vendo a luz primordial, provavelmente emitida por ela a alguns bilhes de anos, permitindo o conhecimento da constituio da matria naqueles primrdios. Este trabalho foi uma forma de enriquecer mais meus conhecimentos no campo da anlise qumica quantitativa pode observar e entender melhor a quantidade de informaes que a luz capaz de carregar fazendo com que ela pode ser uma informante poderosa da constituio qualitativa e quantitativa da matria.

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