UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE CIENCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD-2)

Relatrio referente disciplina de Cromatografia e Espectrometria (CQ040)do curso de Farmcia da Universidade Federal do Paran. Orientado pelo professor Dr. Luiz Pereira Ramos e professora Dra. Ana Luiza Lordello Realizado pelas alunas Ana Paula Martins e Bruna Heloyse Ribeiro

Curitiba Maio de 2013

1- INTRODUO

A Cromatografia consiste em um mtodo fsico-qumico de separao. Esta fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). A fase estacionria pode ser slido ou lquido disposto sobre um suporte slido. A fase mvel pode ser gasosa, lquida ou fluda, e este ao ser eluda passa carreando consigo diversos componentes da mistura, de acordo com as diferentes interaes com a fase estacionria (PERES, 2002). Esta tcnica pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos e separando-se as substncias indesejveis (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). Os principais mtodos cromatogrficos so: cromatografia em papel (CP), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). A escolha do mtodo a ser empregado depende do material a ser analisado e das condies laboratoriais (PERES, 2002). O desenvolvimento prtico neste momento aplicar a tcnica de cromatografia em camada delgada, a qual ser abordada no decorrer deste relatrio.

2- REFERENCIAL TERICO

2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

A cromatografia em camada delgada utilizada normalmente em anlise qualitativa e quantitativa devido sua grande sensibilidade e preciso. Pode tambm ser utilizada em escala preparativas de amostras at 250mg e para quantidades maiores prefere-se a cromatografia em coluna. Pela comodidade, rapidez e confiabilidade dos resultados esta tcnica cromatogrfica amplamente utilizada em laboratrios clnicos e de controle de qualidade (UFRGS, 2004). Na CCD a fase estacionria consiste em uma fina camada de slido granulado (slica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumnio ou outro suporte inerte (PERES, 2002), de maneira uniforme em toda a placa. Estas placas devem ser manuseadas cuidadosamente pelas bordas, para se evitar a contaminao dessa e para no desfazer a uniformidade da placa, o que pode levar a deformidade da mancha desenvolvida e dificuldade de interpretao do cromatoplaca. Para a melhor eficincia da tcnica de separao, alguns cuidados no preparo da placa devem ser tomados, como a espessura do absorvente entre 150- 250m e a secagem da placa em estufa a 80- 100 C, para a retirada de gua que possa estar presente e sua ativao (VOGEL et al., 2002). As Amostras a serem analisadas so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa (PERES, 2002). Usam-se normalmente volumes de 1, 2 ou 5L, medidos com seringa, micropipeta ou capilar, devendo trabalhar com acurcia e preciso (VOGEL et al., 2002). Podem-se utilizar padres, que so substncias relacionadas amostra, aplicadas na mesma placa, seguindo as mesmas recomendaes anteriores e que aps a eluio da fase mvel e revelao so comparadas ao perfil da amostra e pode servir como base de identificao. Deixa-se a placa secar e ento a coloca em um recipiente contendo a fase mvel. A polaridade do solvente utilizado depende da substncia que se deseja separar. A eluio do solvente na placa acontece por capilaridade, uma vez que somente a base fica submersa (PERES, 2002). Aps o deslocamento da fase mvel, usualmente 10 a 15 cm, remova-se a placa e marca-se a posio final percorrida. Seca-se a placa em capela ou estufa, e deve-se cuidar da sensibilidade da amostra com calor e luz (VOGEL et al., 2002). Segundo Vogel e colaboradores (2002) as substncias coloridas podem ser visualizadas diretamente sobre a fase estacionria. Outras, por serem incolores tm a

necessidade de utilizao de reveladores, que colorem a mancha e permitem sua identificao. A razo de movimento de determinada substncia frente ao solvente, que medido desde a linha de aplicao da amostra at o centro da mancha em estudo, d-se pelo valor de Rf (frente relativa ou fator de retardamento), onde se segue sua frmula:

Rf= distncia do composto linha de aplicao distncia percorrida pelo solvente

Os resultados encontrados variam de zero a um, e podem ser caractersticos a determinadas substncias e comparadas a do padro e capaz de identifica-las. Estes valores so reprodutveis em condies idnticas de trabalho (temperatura, solvente e umidade constantes) e comparados aos tabelados na literatura especializada (UFRGS, 2004).

3- OBJETIVOS

Desenvolver a separao dos componentes de mistura de corantes. Mostrar o efeito da polaridade na fase mvel no processo de separao. Determinar apropriadamente os valores de migrao cromatogrfica relativa (Rf) dos componentes presentes na amostra.

4- MATERIAIS E MTODOS

A prtica de separao de uma mistura de corantes por cromatografia em camada delgada foi desenvolvida para a matria CQ040 e ministrada pela professora Dra. Ana Luiza Lordello (QUMICA- UFPR, 2013).

4.1 MATERIAIS

Amostra problema (contendo amarelo-manteiga, vermelho sudan G e indofenol); Capilares; Cubetas de vidro para cada solvente utilizado; Estilete de vidro; Padro de amarelo manteiga (4-dimetilaminoazo-benzeno); Placa de slica ativada e recentemente preparada; Solventes: benzeno, clorofrmio, ciclohexano, acetato de etila e ciclohexano:acetato de etila (9:1, v/v).

O
(CH3)2N

N N

N OH N

OCH3

OH

Figura 1: Frmula estrutural dos componentes da mistura de corantes, em que: (a) amarelo manteiga, (b) vermelho sudan G e (c) indofenol azul.

4.2 MTODOS

Aplica-se em diferentes placas de slica ativadas e recentemente preparadas, da esquerda para a direita, utilizando tubo capilar, o Padro de amarelo manteiga (4dimetilaminoazo-benzeno), a mistura problema (contendo amarelo-manteiga, vermelho sudan G e indofenol) e a combinao do padro e mistura problema. Na linha de aplicao

devem-se aplicar pequenas manchas de reas iguais e separadas a fim de no haver interferncia. Depois de secas ao ar, transfere-se a cromatoplaca para as diferentes cubetas de vidro, contendo os diferentes solventes (benzeno, clorofrmio, ciclohexano, acetato de etila e ciclohexano:acetato de etila (9:1, v/v)). Deve-se ater para a placa seja colocada verticalmente e que o nvel da fase mvel no atinja o ponto de aplicao. Deve-se observar quando a fase mvel atinge a frente final do solvente e retirar a cromatoplaca da cubeta e deixar evaporar o solvente, lembrando de marcar o ponto final do solvente com o auxlio de estilete de vidro. Posteriormente a corrida, deve-se calcular os Rf para o padro, amostra problema e da combinao dos dois.

RESULTADOS

Os resultados obtidos nas placas logo aps eluio esto esquematizados a seguir. Figura 2 Cromatoplaca utilizando Ciclohexano como fase mvel

Figura 3 -Cromatoplaca utilizando Ciclohexano : Acetato de Etila (9:1) como fase mvel

Figura 4- Cromatoplaca utilizando Tolueno como fase mvel

Figura 5 - Cromatoplaca utilizando Clorofrmio como fase mvel

Figura 6 - Cromatoplaca utilizando Acetato de Etila como fase mvel

Os dados experimentais obtidos esto descritos na tabela 1. Tabela 1 Dados referentes a cada corrida

Fase mvel TOLUENO

Componentes AM VS IF AMP

da (mm) 40 17 09 42 43 32 22 46 0 0 0

ds (mm) 50

Rf 0,8 0,34 0,18 0,84

CLOROFRMIO AM VS IF AMP CICLOHEXANO AM VS IF

56

0,76 0,57 0,39 0,82

50

0 0 0

AMP ACETATO ETILA DE AM VS IF AMP ACETATO ETILA DE AM VS IF AMP

0 49 50 50 49 31 23 28 34 57 55

0 0,89 0,91 0,91 0,89 0,54 0,40 0,49 0,59

CICLOHEXANO (1:9 v/v)

LEGENDA: AM- Amarelo Manteiga presente na aplicao conjunta do padro e da amostra problema VS- Vermelho Sudan G na amostra problema IF Indofenol na amostra problema AMP- Amarelo Manteiga Padro ds- Distancia percorrida pela fase mvel da- Distncia percorrida pela amostra

DISCUSSO

De acordo com as estruturas dos corantes, observadas na figura 1, podemos afirmar que os trs possuem carter polar, sendo o Indofenol o de maior polaridade, devido presena de uma hidroxila livre em sua estrutura, aumentando assim sua afinidade pela fase estacionria (grupamento silanol). O Vermelho Sudan apresenta polaridade intermediria, pois sua hidroxila forma uma ligao de hidrognio intramolecular com o nitrognio bsico da sua estrutura. Essas diferenas de polaridade podem ser bem observadas analisando os resultados obtidos. O amarelo manteiga, por ser o menos polar, apresentou os maiores valores de Rf comparados aos outros, alm disso, esse corante obteve manchas de maior raio, o que tambm pode ser explicado pela sua menor polaridade, pois interage menos com a slica e consequentemente, maior sua difuso radial, ou seja, se espalha mais, ocasionando manchas de maior rea. Nas cromatoplacas obtidas pode-se observar que a rea da mancha foi inversamente proporcional a sua ordem de polaridade, ou seja, quanto maior a polaridade do corante, maior a fora de interao deste com a fase estacionria, e portanto, menor a rea da mancha. Conforme explicado anteriormente, o indofenol possui grupos hidroxila que interagem intensamente com a fase estacionria, j o grupo hidroxila do vermelho sudan G, em solventes de menor polaridade, est associado internamente com o nitrognio bsico, havendo a formao de ligao de hidrognio intramolecular, no podendo interagir to intensamente com a slica e ento, apresenta um valor de Rf maior comparado ao indofenol. Porm, ao utilizar o acetato de etila e ciclo hexano (1:9), observamos a inverso da migrao cromatogrfica, isto ocorre pois essa ligao de hidrognio rompida e o composto (vermelho Sudan G) passa a interagir mais intensamente com a fase estacionria do que o indofenol. Percebe-se que os maiores valores de Rf foram obtidos utilizando Acetato de Etila como fase mvel, ou seja, o solvente mais polar. Os corantes, por seu carter polar, possuem uma maior afinidade pela fase mvel, sendo quase totalmente carreados pela placa, no havendo separao. J com o ciclohexano, ocorre o contrrio, pois trata-se do solvente menos polar utilizado, sendo assim, a afinidade dos corantes pela fase estacionria maior, e praticamente no h movimentao das amostras. Utilizando como fase mvel o clorofrmio e o tolueno, obteve-se uma melhor separao, devido a polaridade intermediria que estes solventes apresentam em relao aos outros. Portanto a ordem crescente de polaridade dos solventes Ciclohexano < Mistura acetato de etila : ciclohexano (1: 9) < Tolueno < Clorofrmio < Acetato de Etila.

Os valores de Rf obtidos em uma mesma placa para o amarelo manteiga, tanto na aplicao isolada (padro) como na mistura problema, foram muito prximos, o que nos mostra que a cromatografia em camada delgada eficaz na separao de amostras complexas que contenham mais que dois componentes. As diferenas de valores obtidos podem ter ocorrido devido aplicao das amostras nas placas ter sido realizada de forma incorreta, e a distancia de aplicao ter sido diferente. Alm disso, a quantidade de solvente na cuba cromatogrfica ou o tempo de saturao deste, podem no ter sido adequados, fazendo com que a eluio ocorresse de forma irregular, levando valores de Rf diferentes. Por fim, a prpria irregularidade da slica na superfcie da cromatoplaca pode ocasionar pequenas diferenas nos resultados. Isto mostra a importncia de se obter um treinamento tcnico e um mtodo reprodutvel. Supondo que ao invs da mistura de corantes fosse utilizada a mistura de cido benzoico, lcool dodeclico e naftaleno, admitindo-se uma fase mvel pouco polar, o composto com maior valor de Rf seria o naftaleno, pois dos trs, o menos polar. J o menor Rf seria do cido benzoico, pois apresenta a maior polaridade, portanto, maior afinidade pela fase estacionria, composta por slica, que altamente polar.

CONCLUSO

A tcnica de cromatografia em camada delgada mostrou-se eficaz na determinao dos componentes na prtica realizada. A ordem eluotrpica para os solventes analisados : Ciclohexano < acetato de etila : cliclo hexano (1:9) < tolueno < clorofrmio < acetato de etila O comportamento dos analitos, fase mvel e fase estacionria ficaram dentro do esperado para as anlises efetuadas. A melhor separao da mistura de corantes foi obtida quando se utilizou como fase mvel o clorofrmio, com polaridade intermediria. .

REFERNCIAS

COLLINS, C. H. ; BRAGA, G. L. ; BONATO, P. S. ; Fundamentos de cromatografia; 6 Ed. Unicamp- Campinas, 1997. DEGANI, A.L.; CASS. Q.B.; VIEIRA, P.C. Cromatografia- atualidades em qumica. Qumica Nova, n.7, maio/ 1998. Disponvel em: http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf. Acesso em: 05/2013. PERES, T.B. Noes Bsicas de Cromatografia. So Paulo, v.64, n.2, p. 227-229, jul/dez. 2002. Disponvel em: http://www.biologico.sp.gov.br/docs/bio/v64_2/peres.pdf. Acesso em: 05/2013. QUMICA- UFPR. Material de apoio s aulas prticas da disciplina CQ040- Qumica Cromatografia e Espectrometria. Prtica CCD-2: separao de uma mistura de corantes por cromatografia em camada delgada. UFPR: Curitiba, 2013. SKOOG, D. A; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R.; Fundamentos de Qumica Analtica; Traduo da 8 ed. Norte-Americana.; Editora Thomsom, 2004 UFRGS. Qumica Orgnica experimental: tcnicas cromatogrficas. Rio Grande do Sul, 2004. Disponvel em: http://www.iq.ufrgs.br/dqo/poligrafos/Poligrafo_QUI_02004_2011_1.pdf. Acesso em: 05/2013 VOGEL, et al. Anlise qumica quantitativa. Rio de Janeiro: LTC, 2002.