Tcnicas Cromatograficas

Cromatografia: tcnica de separao excelente e extremamente poderoso, rpido, simples, sensvel, e requer geralmente pequena amostra Obter informaes em termos de: Anlise qualitativa; Anlise quantitativa; Aplicabilidade Toxicologia; Pesticidas Aminoacidos Polimeros Farmacos Proteinas Corantes Cosmeticos Alimentos Vitaminas Tcnicas de separao cromatogrficos A maioria das anlises qumicas envolve a separao de amostras complexas. Avaliao de um produto Monitoramento contnuo do processo de produo, como parte do controle de qualidade Acompanhamento e controle de produtos de resduos industriais como controle de qualidade preventiva da gua de superfcie Determinao das quantidades de produtos farmacuticos e seus metabolitos em amostras biolgicas em pesquisa clnica de (novas) drogas. Tcnicas de separao comuns so: Cromatografia Gasosa (GC): GC est limitada a compostos com um peso molecular at cerca de 1000, em fase de vapor.

Cromatografia Lquida (LC): LC aplicada a compostos com um peso molecular de 70 at 1.000.000. Componentes da amostra deve ser solvel na fase mvel. Cromatografia por excluso de tamanho (SEC) Cromatografia com fluido supercrtico (SFC) utiliza o CO2 - Tendo em lquidos e de gs-como propriedades, como fase mvel rea de aplicao e peso molecular

Classificao das cromatogrfico

tcnicas

cromatogrficas:

de acordo

com

sistema

Na Coluna: o cromatografia lquida o cromatografia gasosa o cromatografia Fluid Supercritic Planar cromatografia de camada fina (TLC) Papel cromatografia (PC) Lquido o Cromatografia lquida clssica (CLC) o Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) De acordo com a fase estacionria o lquido o slidos o quimicamente ligado De acordo com o modo de separao Cromatografia Adsoro (LSC) Cromatografia Partio (LLC) Cromatografia de troca inica

Tipo Gs

Liquido

Fase mvel Fase estacionria Mecanismo de separao Liquido Partio Gs Slido Adsoro Liquido Partio Adsoro Liquido Slido Troca inica Excluso Molecular

As seguintes caractersticas so importantes na escolha do sistema de separao adequada: A gama de ponto de ebulio dos analitos e as propriedades da fase de vapor resultante destes analitos; O nmero de componentes que devem ser separados; A presena de polar e / ou grupos no polares nos analitos e a presena ou ausncia de grupos funcionais; A presena de polar e / ou grupos no polares nos analitos e a presena ou ausncia de grupos funcionais; A combinao da fase estacionria e dimenses da coluna, bem como a espessura da pelcula da fase estacionria em relao selectividade desejada e resoluo; A taxa de fluxo do gs portador como um parmetro para acelerar a anlise total, com uma perda mnima na resoluo do par mais crtico de compostos a ser separados; O facto de tanto o programa de temperatura deve ser utilizado ou que a anlise pode ser realizada a uma temperatura constante. MINI-PROJECTOS GC-qMS Triagem fazer Perfil metabolmico volatilidade de indivduos com patologia oncolgica UHPLC Desenvolvimento de Metodologia UMA extractiva pargrafo uma determinao da Homocistena - biomarcador de DCV Cromatografia baseia-se num equilbrio fsico que resulta quando um soluto transferido entre o mvel e a fase estacionria. K = distribuio coeficiente ou relao de partio

Seco transversal de Equilbrio em uma coluna. "A" so adsorvidos fase estacionria. "A" est viajando na fase mvel. Onde SC a concentrao molar do soluto na fase estacionria e CM a concentrao molar na fase mvel. Em uma coluna de cromatografia em fase gasosa, ou lquido que flui continuamente substitui saturado fase mvel e resulta em movimento de atravs da coluna.

Coluna embalada com partculas fase estacionria. Como material viaja atravs da coluna, ele assume uma Gaussiana perfil de concentrao, uma vez que distribui entre o estacionrio embalagem de fase e o gs que flui mvel ou fase veculo lquido. Numa mistura, cada componente tem um coeficiente de distribuio diferente, e, assim, passa uma quantidade diferente de tempo absorvido na fase slida vs embalagem a ser transportada juntamente com o fluxo de gs.

Materiais mais volteis so transportados atravs da coluna mais rapidamente do que os materiais menos volteis, o que resulta numa separao.

Terminologia Bsica Tempo de reteno (tR) Factor de capacidade (k') Eficincia Coluna Matrcula (n) Altura equivalente de um prato terico (HETP) Selectividade () Resoluo (Rs) Tempo de reteno (tR) Tempo de reteno (RT) RT o tempo necessrio para eluir um pico Expresso em termos de factor de capacidade (k') RT afectado pela taxa de fluxo, fora de solvente, etc RT aumenta com o aumento de comprimento da coluna Factor de capacidade k' uma medida da reteno de pico ou quantas vezes o pico retido contra um pico no retidos (t0) k'= (tR-t0)/t0 = tR'/t0 Eficincia coluna Eficincia Medido em termos de pratos tericos (N) Funo de comprimento Coluna O tamanho das partculas Caudal Eficincia (N) duplica quando aumenta de tamanho de partculas de exemplo 20-10 a 5 micrmetros

A Teoria da Cromatografia existe duas teorias para explicar cromatografia: Teoria dos pratos - mais velho, desenvolvido por Martin e Synge em 1941 Ver coluna como sendo dividida em um nmero (N) de segmentos adjacentes imaginrias chamadas pratos tericos Dentro de cada analito prato terico completamente equilibrar entre a fase estacionria e a fase mvel.

SIGNIFICADO? Maior separao ocorre com: maior nmero de pratos tericos (N) como uma placa de altura (H ou HEPT) torna-se menor L = N*H ou H =L/N Em que: L comprimento da coluna; N o nmero de placas, e H a altura das placas N pode ser estimado a partir de um cromatograma experimentalmente:

N um rcio de tR e qual de Wb 4 Em que: o tR tempo de reteno o W1/2 a largura em h0.5 o w a largura medida na linha de base Em que: o N = nmero de pratos tericos o Ve = volume de eluio ou tempo de reteno (mL, sec, ou cm) o h = altura do pico o w1/2 = largura do pico a meia altura do pico (mL, sec, ou cm)

Quando o tempo de reteno, tR, mantida constante, a coluna que produz picos com bases mais estreitas, wb, ser mais eficiente - tm um maior valor N. Da mesma forma uma coluna que produz picos mais largos ser menos eficiente - ter um menor valor N. Isto porque um menor denominador, wb, ir produzir um conjunto maior e um maior nmero de denominador ir produzir um nmero mais pequeno.

Escolha de dimenses da coluna: a mxima eficincia Nmax = 0,4 * L/dp Em que: o Nmax - eficincia mxima da coluna o L - comprimento da coluna o dp - tamanho particule Assim, o menor tamanho de partcula maior ser a eficincia

A teoria taxa de cromatografia: Teoria tarifa - actualmente em uso, proposta por van Deemter em 1956; Contas para a dinmica da separao o Na teoria da taxa, um nmero de diferentes processos de disperso de pico foram propostos e as expresses que foram desenvolvidos descrito o A contribuio de cada um dos processos para a varincia total do pico eludo o Equao final que deu uma expresso para a variao por unidade de comprimento da coluna

H = altura equivalente ao prato terico (como na teoria das placas) HL = contribuio devida difuso longitudinal Hs = fase estacionria contribuio transferncia de massa HM = difuso associados a efeitos de fase mvel HSM = difuso dentro ou transferncia de massa atravs de uma camada estagnada de fase mvel (negligncia)

equao de van Deemter A, B e C so coeficientes, = velocidade

Os processos propostos foram: Redemoinho difuso Difuso longitudinal Resistncia transferncia de massa na fase mvel Resistncia transferncia de massa na fase estacionria Redemoinho difuso: um processo que conduz ao pico (banda) Alargamento, devido presena de mltiplos caminhos de fluxo atravs de uma coluna empacotada Como curso molculas de soluto atravs da coluna, algum chegar ao fim, mais cedo do que outro simplesmente devido ao caminho diferente viajou em volta das partculas de suporte da coluna, que resultam em diferentes distncias

Caminho mais longo chega ao fim da coluna

A transferncia de massa da fase mvel: um processo de alargamento dos picos provocado pela presena de perfil de fluxo diferente dentro de canais, ou entre as partculas do suporte da coluna. Um soluto no centro do canal se move mais rapidamente do que o soluto nas extremidades, isto tender a chegar ao fim do primeiro canal conduzindo a banda ampliao O grau de ampliao de banda devido a difuso turbulenta e a transferncia de massa da fase mvel depende principalmente de: O tamanho do material de embalagem A taxa de difuso do soluto

Transferncia de massa estagnada fase mvel: banda alargamento devido a diferenas na taxa de difuso das molculas do soluto entre a fase mvel fora dos poros do suporte (fase mvel flui) para a fase mvel, dentro dos poros do suporte (fase mvel estagnada )

Uma vez que um soluto no viaja para baixo na coluna, quando se est na fase mvel estagnada, que gasta mais tempo na coluna de soluto que permanece na fase fluida mvel

O grau de ampliao de banda, devido transferncia de massa da fase mvel estagnada depende: A estrutura de forma, tamanho, e dos poros do material de embalagem A difuso e de reteno do soluto A taxa de fluxo do soluto atravs da coluna A transferncia de massa da fase estacionria: banda alargamento devido ao movimento do soluto entre a fase parada e a fase estacionria Desde que diferentes molculas de soluto passar diferentes perodos de tempo na fase estacionria, eles tambm passar diferentes quantidades de tempo na coluna, dando origem ao aumento de banda ampliao

O grau de ampliao de banda devido a transferncia de fase estacionria massa depende: A reteno e difuso do soluto A taxa de fluxo do soluto atravs da coluna A cintica da interaco entre o soluto e da fase estacionria

Difuso longitudinal: banda alargamento devido difuso do soluto ao longo do comprimento da coluna na fase fluida mvel

O grau de ampliao de banda devido a difuso longitudinal depende A difuso de soluto A taxa de fluxo do soluto atravs da coluna

Van equao Deemter: relaciona o fluxo taxa ou velocidade linear de H

Onde = velocidade linear (taxa de fluxo x Vm / L) H = altura da placa total da coluna A = constante que representa eddy difuso e transferncia de massa da fase mvel B = constante que representa a difuso longitudinal C = constante que representa estagnao da fase mvel e de transferncia de massa da fase estacionria Utilizao de uma placa de altura (H) o de relacionar estes processos cinticos para um alargamento de um parmetro do sistema cromatogrfico (ex: taxa de fluxo) Esta relao utilizada para prever o que o efeito resultante seria de variao deste parmetro sobre a eficincia geral do sistema cromatogrfico Nmero de pratos tericos (N) Largura do pico (Wh) Trama de van equao Deemter mostra como H muda com a velocidade linear (caudal) da fase mvel

Velocidade linear ptima eficincia mxima da coluna

em que H tem um valor mnimo e o ponto de

opt fcil de conseguir GC, mas geralmente de pequena para taxas de fluxo mais elevadas que necessitam de LC do que ptima para separar compostos

Medidas de separao soluto: Factor de separao: parmetro usado para descrever como solutos separado por um sistema de cromatografia: Onde K'1 = factor a capacidade do primeiro soluto K'2 = factor de capacidade do segundo soluto com K'2> k'1 Um valor de 1,1> geralmente indicativo de uma boa separao

No considera o effct de eficincia da coluna ou withds de pico, a reteno s. Resoluo (Rs): resoluo entre dois picos uma segunda medida de quo bem dois picos so separados:

Onde tr1, WB1 = tempo de reteno e de largura de linha de base do primeiro pico de eluio tr2, WB2 = tempo de reteno e de largura de linha de base para o segundo pico de eluio Rs prefervel uma vez que tanto a reteno (tr) e da eficincia da coluna (Wb) so considerados na definio de pico de separao Rs > 1,5 representa resoluo de linha de base, ou a separao completa dos dois solutos vizinhos, caso ideal Rs = 1,0 considerada adequada para a maioria das separaes